类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用

摘要

本发明公开了一种类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中间体中的应用，类产碱假单胞菌XW-40菌落表面形态扁平，圆形，边缘光滑整齐，呈潮湿状，颜色呈乳白色，不透明，菌落直径约为1.9mm。该菌株能够有效催化4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]-吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基)丁-2-酮还原为西他列汀手性中间体，在最适反应条件下能耐受10g/L的高底物浓度，且仍保持高选择性，底物抑制作用较弱，可实现高底物浓度的生物催化。该菌体还能够循环使用，与分批补料相比，同时去除了底物与产物对细胞的抑制作用，使菌体的催化活性达到最大限度的利用。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种类产碱假单胞菌株及其在制备西他列汀中 间体中的应用。

背景技术

磷酸西他列汀(sitagliptinphosphate)是默沙东公司第一个研制的用于治疗2型糖尿病的二 肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，该药能有效地针对2型糖尿病中的胰岛素抵抗和胰岛α、β细胞 的功能障碍，通过抑制DPP-4减缓肠促胰岛素GLP-1的降解，从而发挥降糖作用。与易导致 低血糖、体重增加和引起恶心呕吐等副作用的传统口服降糖药物相比，该抑制剂具有明显的 优势和良好的市场前景。磷酸西他列汀关键的手性中间体主要有两个，一个是手性β-氨基酸， 一个是其相应的手性醇中间体，目前关于西他列汀的合成工作重点主要围绕这两个手性中间 体展开。

目前文献报道此手性β-氨基酸的合成方法主要有以下几种：

(一)采用手性源诱导出手性的α-氨基酸，而后经重氮化反应产生β-氨基酸，从而构建 手性中心，该路线所用原料较为昂贵，反应条件相当苛刻，如需要-78℃及-30℃等低温条件， 且有些反应所需时间较长且操作较为繁琐，中间产物的精制需要经过柱层析分离；

(二)采用手性磷钌催化剂对酮酯进行不对称催化氢化，构建手性二级醇，然后将手性 二级醇手性反转为二级胺，该路线中手性催化剂价格昂贵，放大效应明显；

(三)β-烯氨基酸中间体的不对称氢化，不对称氢化反应在昂贵的金属催化剂如与手性 膦/二膦配体相组合的铑的存在下进行或是使用昂贵的钌金属催化剂；

(四)以异丙胺为氨供体，以西他列汀前体酮为氨受体，利用转氨酶生物催化制备西他 列汀，该方法具有环境友好，反应条件温和等优势，但特殊酶的不易获得和价格的高昂特性 (分离方案等)不可忽视；

(五)以三氟苯甲醛和N-乙酰甘氨酸经缩合、还原、生物酶拆分、水解、保护氨基、重 氮化、Arndt-Fistert重排反应、水解得R-β-氨基丁酸，但是所述合成路线过长，手性拆分获得 手性氨基酸的收率不超过50％，另外一半对映异构体的循环利用是一大难题，且反应过程用 到重氮甲烷，重氮甲烷室温下是不稳定的有毒气体，具有爆炸性，操作危险。

而目前文献报道相应的手性醇中间体的合成方法主要如下：

(一)WO09/045507利用适当的羰基还原酶对β-羰基部分进行不对称还原得到β-羟基中 间体，再与氮杂环丁酮中间体反应得到西他列汀，该方法的缺点在于：在高压下反应、使用 非常昂贵的金属手性催化剂(Rh或Ru)、低立体选择性和铑污染产物以及由此引起的最终化 合物很难纯化；

(二)WO12/046254公开制备通过酶促转化制备西他列汀的中间体的方法，提供了两种 生物催化合成手性醇中间体的方法，分别为利用工程菌全细胞和工程菌所产的羰基还原酶的 粗提物作为生物催化剂，将西他列汀前体酮还原为相应的(S)构型的醇；其方法具有环境友好， 反应条件温和，ee值高等优势，但在另一方面，工程菌的构建有很大的难度而且花费昂贵， 使用粗提酶作为生物催化剂存在的问题是游离的粗酶在反应液中不稳定，酶的催化能力较低， 酶容易失活，不易实现酶的循环使用，且后期的分离操作复杂；而使用整细胞作为催化剂， 将底物溶于甲苯中进行两相催化反应所存在的问题是，底物在甲苯中溶解度小，反应所转化 的底物浓度较低，不适合大规模工业化生产。

现有的化学法和生物催化法合成西他列汀以及中间体的方法都存在其不足之处，因此， 开发更清洁的环境友好的制备西他列汀的中间体的方法是非常有意义的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种类产碱假单胞菌株，并提供了该菌株的用途，通 过该菌株菌体的生物催化能够更经济地获得西他列汀中间体。

本发明以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]-吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5)-三 氟苯基)丁-2-酮(Ⅱ)为原料，利用微生物中的羰基还原酶，区域选择性和对映选择性催化还 原为(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基) 丁-1-酮(I)。

本发明技术路线如下：

本发明采取的技术方案如下：

1、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)XW-40，由中国典型培养物保藏 中心保藏，保藏号为CCTCCNO:M2015521。

2、上述类产碱假单胞菌XW-40在制备西他列汀中间体中的应用。

优选的，以类产碱假单胞菌XW-40菌体作为催化剂，将原料4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6- 二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]-吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基)丁-2-酮催化还原为(S)-3-羟基 -1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

优选的，所述反应体系中还包括辅酶再生底物和有机助溶剂。

优选的，所述催化剂类产碱假单胞菌XW-40菌体经过重新收集，洗涤后用于下一批次西 他列汀中间体的制备。

优选的，所述类产碱假单胞菌XW-40菌体浓度为90g(干重)/L，原料浓度为10g/L， 辅酶再生底物为质量分数5％的葡萄糖，有机助溶剂为体积分数10％的二甲基亚砜，反应时 间为28小时。

本发明的有益效果在于：(1)筛选的产羰基还原酶菌株Pseudomonaspseudoalcaligenes XW-40具有高度的区域选择性和对映选择性，能够有效催化4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢 [1,2,4]三唑并[4,3-a]-吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基)丁-2-酮(Ⅱ)还原为西他列汀手性中 间体(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基) 丁-1-酮(I)，无副产物产生，简化了分离过程；(2)对于土壤中菌株的筛选，选择与底物 (Ⅱ)结构相似的苯乙酮为唯一的碳源进行菌株的筛选，可以快速地从众多种土壤中快速的 筛选出合适的疑似初筛菌株，再将其用于(Ⅱ)的还原，快速的选择出最佳的菌株；(3)所 筛选的菌株PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40在最适的反应条件下能耐受10g/L的高底 物浓度，并且仍保持高选择性，底物抑制作用较弱，从而可实现高底物浓度的生物催化，这 一点对于目前所报道的利用野生细菌进行生物还原来说相对少见；(4)Pseudomonas pseudoalcaligenesXW-40菌体能够循环使用，待一批反应结束后将菌体离心，可重新投入下 一批次的催化反应中，与分批补料相比，同时去除了底物与产物对细胞的抑制作用，使菌体 的催化活性达到最大限度的利用，同一批菌体可循环使用5次，收率和光学纯度高，过程绿 色，成本低廉。

菌种保藏

本发明中类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)XW-40是从土壤中分离获得， 送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2015521，地址位于 湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015年9月10日，分类命名为类产碱假单胞菌 Pseudomonaspseudoalcaligenes。菌落在固体培养基的形态为表面形态扁平，圆形，边缘部分 光滑整齐，整个菌落呈潮湿状，颜色呈乳白色，不透明，菌落直径约为1.9mm，生理学性质 见表2。经16SrDNA分子生物学鉴定为类产碱假单胞菌，同源性达100％。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1土壤菌株的初筛

称取约1g土壤样品于10ml无菌水中，振荡混匀后离心，吸取上清液1ml加入到100ml 以苯乙酮为唯一碳源的最小盐培养基中，30℃培养5-7天。然后将培养的菌悬液涂布至以苯 乙酮为唯一碳源的最小盐琼脂培养基中，将平板上长出来的菌落分离纯化接种于琼脂斜面上 (培养基组成：蛋白胨5g/L，酵母膏1.5g/L，葡萄糖10g/L，牛肉膏1.5g/L，NaCl5g/L，pH7.0)， 30℃培养48h，作为进一步筛选的疑似菌株，编号保存。

实施例2产羰基还原酶菌株的筛选

将实施例1分离纯化得到的菌种接种于组成为蛋白胨5g/L，酵母膏1.5g/L、葡萄糖10g/L， 牛肉膏1.5g/L，NaCl5g/L，pH7.0的培养基中，30℃培养48h，4℃下7000rpm/min离心10min， 收集菌体，用冷生理盐水洗涤两次，得细胞湿菌体。

采用如下菌株筛选体系进行筛选：1g/L底物(Ⅱ)，质量分数5％的葡萄糖，10％(v/v) 无水乙醇，80g/L菌体(干重)，0.1M的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH7.0，30℃下搅拌 反应12h，离心，上清液用乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，无水硫酸镁干燥过夜，反相C₁₈液相色谱以及手性液相色谱测定转化率和对映体过量(ee)。

液相色谱条件为：检测转化率时色谱柱C₁₈(250×4.6mm×5μm，AgilentAmerica)，流动相： 水/乙腈(v/v)＝70/30，流速1ml/min，检测波长：268nm，温度：25℃；4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6- 二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]-吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5)-三氟苯基)丁-2-酮及3-羟基-1-[3-(三氟甲 基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的保留时间分别为 19.7和26.8min；检测ee时色谱柱ChiracelAY-H(5×250mm)，流动相：正己烷/无水乙醇(v/v) ＝85：15，流速：1.0ml/min，检测波长：268nm，温度：25℃；在化学合成外消旋醇3-羟基-1-[3-(三 氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮的分 析中，S和R异构体的保留时间分别为11.3min以及17.8min。采用相同方法确定制备醇产物 的手性构型，将转化率大于5％的菌株的结果表述于表1中，

表1产羰基还原酶菌株的筛选

由表1可知，对映体过量(ee)最高以及转化率最好的为编号40-1的菌株，观察了40-1 号菌落在固体培养基的形态为表面形态扁平，圆形，边缘部分光滑整齐，整个菌落呈潮湿状， 颜色呈乳白色，不透明，菌落直径约为1.9mm，生理学性质见表2。经16SrDNA分子生物 学鉴定为类产碱假单胞菌，同源性达100％，命名为PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40， 其DNA序列见SEQIDNo.1。

表140-1菌株生理生化性质

实施例3产物(I)制备

利用PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40细菌制备(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢 [1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(I)。取5ml种子液转接至100ml 新鲜的培养基中(250ml容量的摇瓶)(培养基组分以及培养条件见实施例2)，在30℃下，190 转/分钟震荡培养48小时，4℃下，7000转/分钟条件下离心10分钟，收集沉淀菌体，并用 冷生理盐水洗涤两次，得到湿菌体作为生物催化剂。将所得湿菌体用pH7.0的磷酸盐缓冲液 配成菌体浓度为50g(干重)/L菌悬液。5ml反应体系，底物(Ⅱ)浓度为1g/L，加入质量 分数5％的葡萄糖作为辅酶再生底物，体积分数10％无水乙醇作为有机助溶剂，30℃，190转 /分钟，转化12小时，反应混合液用一倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用无水硫酸 钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得残余物用2ml无水乙醇(色谱纯)充分溶解，取10μl样 品进行HPLC检测(方法和柱子类型如同实施例2)，计算转化率为57％，ee值＞99％。

利用多种经典工具分析酶促制备的产物(I)，即熔点(m.p.)、比旋度(SOR)、核磁共振光 谱(NMR)，结果如下：

m.p.：114-119℃；SOR[α]D25：23.2°(c＝1，CHCl₃)；1HNMR(400MHz，DMSO-D6)： δ2.46-2.48(m，1H)，2.67-2.79(m，3H)，3.90-3.97(m，2H)，4.00-4.09(m，2H)，4.21-4.26(m， 1H)，4.84-5.06(overlappingm，3H)，7.40-7.48(m，2H)；13CNMR(100MHz，DMSO-D6)：δ35.4， 37.3，38.3，40.1，41.3，42.1，43.0，43.7，67.3，105.1，115.2，117.3，119.5，123.0，142.3， 144.4，146.5，148.7，151.0，154.8，156.8，170.2。

实施例4～25产物(I)的数据与实施例3相同。

实施例4产物(I)制备

为了进一步筛选最优的有机助溶剂，将实施例3中菌株初步转化实验时采用体积分数 10％无水乙醇作为有机助溶剂更换为表2中列出的不同有机溶剂作为反应体系中的助溶剂， 其他条件同实施例3。

表2有机助溶剂对反应的影响

由表2可知，选用二甲基亚砜作为有机助溶剂时，底物的转化率最高，ee值为＞99％。 因此，实施例5～25中有机助溶剂均为二甲基亚砜。

实施例5产物(I)制备

培养基配方和种子液制备方法参见实施例3。用于生物转化的菌体培养48小时后离心， 洗涤，将所得湿菌体用磷酸盐缓冲液配成菌体浓度为30g(干重)/L菌悬液作为生物催化剂， 5mL反应体系，底物(Ⅱ)浓度为1g/L，加入质量分数5％的葡萄糖作为辅酶再生底物，体 积分数10％二甲基亚砜作为有机助溶剂，30℃，190转/分钟，转化12小时，反应混合液用 一倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，所 得残余物用2ml无水乙醇(色谱纯)充分溶解，取10μl样品进行HPLC检测(方法和柱子类 型详见实施例2)，计算转化率为56％，ee值＞99％。

实施例6产物(I)制备

反应体系中PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度为40g(干重)/L，其余同实 施例5。HPLC检测计算得转化率为78％，ee值＞99％。

实施例7产物(I)制备

反应体系中的PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度为50g(干重)/L，其余条 件同实施例5。HPLC检测计算得转化率为89％，ee值＞99％。

实施例8产物(I)制备

反应体系中的PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度为60g(干重)/L，其余实 验条件同实施例5。HPLC检测并计算得转化率为95％，ee值＞99％。

实施例9产物(I)制备

反应体系中的PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度为70g(干重)/L，其余实 验条件同实施例5。HPLC检测并计算得转化率为98％，ee值＞99％。

实施例10产物(I)制备

反应体系中的PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度为80g(干重)/L，其余实 验条件同实施例5。HPLC检测并计算得转化率为99％，ee值＞99％。

实施例11产物(I)制备

反应体系中的PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度为90g(干重)/L，其余实 验条件同实施例5。HPLC检测并计算得转化率为＞99％，ee值＞99％。

实施例12产物(I)制备

培养基配方和种子液制备方法见实施例2。用于生物转化的菌体培养48小时，离心收集 菌体洗涤后作为生物催化剂，5ml反应体系，添加质量分数5％的葡萄糖作为辅酶再生底物， PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体浓度90g(干重)/L，底物浓度为1g/L，30℃条件 下，190转/分钟，转化12小时，用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，收集有机层用无水硫酸钠 干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，残余物用5ml无水乙醇(色谱纯)充分溶解，取2μl样品进行 HPLC检测，计算得转化率为＞99％，ee值＞99％。

实施例13产物(I)制备

反应体系中的底物浓度为3g/L，其余实验条件同实施例12。用HPLC检测并计算出转 化率为99％，ee值＞99％。

实施例14产物(I)制备

反应体系中的底物浓度为6g/L，其余实验条件同实施例12。用HPLC检测并计算出转 化率为95％，ee值＞99％。

实施例15产物(I)制备

反应体系中的底物浓度为8g/L，其余实验条件同实施例12。用HPLC检测并计算出转 化率为89％，ee值＞99％。

实施例16产物(I)制备

反应体系中的底物浓度为10g/L，其余实验条件同实施例12。用HPLC检测并计算出转 化率为80％，ee值＞99％。

实施例17产物(I)制备

培养基配方和种子液制备方法同实施例2。用于生物转化的菌体培养48小时，离心收集 菌体洗涤后作为生物催化剂，操作同实施例3，5ml反应体系，添加5％的葡萄糖作为辅酶再 生底物，体积分数10％二甲基亚砜作为助溶剂，PseudomonaspseudoalcaligenesXW-40菌体 浓度90g(干重)/L，底物浓度10g/L，转化16小时，用一倍体积乙酸乙酯萃取三次，收集 有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，残余物用5ml色谱纯级无水乙醇充分溶 解，取2μl样品进样，用HPLC检测，计算得转化率为89％，ee值＞99％。

实施例18产物(I)制备

生物转化时间为20小时，其余实验条件同实施例16。用HPLC检测并计算得转化率为 96％，ee值＞99％。

实施例19产物(I)制备

生物转化时间为24小时，其余实验条件同实施例16。用HPLC检测并计算得转化率为 99％，ee值＞99％。

实施例20产物(I)制备

生物转时间为28小时，其余实验条件同实施例16。用HPLC检测并计算得转化率为＞ 99％，ee值＞99％

实施例21产物(I)制备

反应体系扩大到500ml，生物转化28小时，其余实验条件同实施例16。用HPLC检测 并计算得转化率为99％，ee值＞99％

实施例22产物(I)制备

反应体系扩大到1000ml，生物转化28小时，其余实验条件同实施例16。反应完全后， 将反应液在4℃下，7000转/分钟离心10分钟，收集沉淀菌体，使用冷生理盐水洗涤两次， 离心收集沉淀菌体，重新悬浮于pH7.0磷酸盐缓冲液中作为第二批次生物转化的催化剂，第 二批次的生物催化反应的反应体系为1000ml，生物转化24小时，其余实验条件同实施例16。 用HPLC检测并计算得转化率为99％，ee值＞99％

实施例23产物(I)制备

第三批次的生物催化反应的反应体系为1000ml，生物转化28小时，其余实验条件同实 施例22。用HPLC检测并计算得转化率为93％，ee值＞99％。

实施例24产物(I)制备

第四批次的生物催化反应的反应体系为1000ml，生物转化28小时，其余实验条件同实 施例22。用HPLC检测并计算得转化率为91％，ee值＞99％。

实施例25产物(I)制备

第五批次的生物催化反应的反应体系为1000ml，生物转化28小时，其余实验条件同实 施例22。用HPLC检测并计算得转化率为90％，ee值＞99％。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。