新型转氨酶Nec的克隆表达及其在西他列汀手性中间体合成中的应用

摘要

西他列汀对糖尿病具有极好的疗效。生物催化制备西他列汀是目前公认的绿色环保高效的制备技术。本文设计了合成西他列汀的新路线，利用转氨酶催化前体酮制备西他列汀合成的新型关键手性中间体，具有重要的研究意义。
　　本文首先建立了新型前体酮及手性中间体的液相分析方法。随后运用基因探矿的方法，以ATA117氨基酸序列为模板，在基因数据库中挖掘出五个可能具有催化活力的转氨酶基因片段，将其分别构建在pETDuet-1和pET-30a(+)的质粒载体上，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。五个转氨酶均成功实现可溶性表达，但酶活测定结果表明仅有pETDuet-1-Nec对底物前体酮具有微弱催化活力，发酵液酶活为0.08U/L，纯酶比活0.007U/mg。
　　为了提高该酶针对西他列汀中间体前体酮的催化活力，本文对转氨酶小口袋区域附近的三个位点V60、F113和A275进行定点饱和突变，共得到57个突变体，其中V60位点突变为T时酶活提高最为显著，发酵液酶活达到0.104U/L，F113位点突变为M时酶活提高最为显著，发酵液酶活达到0.094U/L，而A275位点的突变体均无酶活。然后选取酶活相比原始酶有所提高的六个突变体V60T，V60M，F113S，F113Y，F113M，F113A进行组合突变，共得到8个突变体。其中V60T和F113M两个位点的组合突变体转录的转氨酶活力最高，发酵液酶活达到了0.112U/L，比活0.0095U/mg，比原始酶比活提高了36％。最后，我们对该突变酶进行了酶学性质表征。结果表明，重组转氨酶的最适pH值为8.5，最适反应温度为30℃。

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摘要

表目录

图目录

中英文缩写对照表

第1章 文献综述

1．1 转氨酶简介

1．1．1 转氨酶的来源及分类

1．1．2 转氨酶催化机制

1．1．3 转氨酶的应用

1．2 西他列汀

1．2．1 糖尿病简介

1．2．2 西他列汀简介

1．2．3 酶法制备西他列汀

1．3 本课题的研究思路和主要内容

第2章 新型转氨酶基因探矿及表达

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种和质粒

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 常用实验试剂与药品

2．3 实验方法

2．3．1 新型转氨酶的基因挖掘

2．3．2 菌种的活化和保藏

2．3．3 基因来源菌种的诱导

2．3．4 超声破碎

2．3．5 SDS-PAGE电泳

2．3．6 Ni-NTA亲和柱纯化

2．4 分析方法

2．4．1 高效液相色谱法的建立

2．4．2 酶活测定方法

2．4．3 蛋白浓度测定

2．5 结果与讨论

2．5．1 重组转氨酶的获得

2．5．2 重组转氨酶及ATA117的异源表达

2．5．3 重组菌粗酶酶活测定

2．5．4 ATA117和pETDuet-1-Nec纯化

2．6 本章小结

第3章 定点突变提高重组转氨酶NeC的催化活性

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验仪器

3．2．2 药品与试剂

3．3 实验方法

3．3．1 突变株的构建

3．3．2 质粒抽提

3．3．3 琼脂糖凝胶电泳

3．3．4 PCR扩增全质粒

3．3．5 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备及转化

3．4 结果及分析

3．4．1 结合域空间结构分析

3．4．2 定点饱和突变

3．4．3 单点突变对催化活性的影响

3．4．4 组合突变及活性表达

3．5 本章小结

第4章 转氨酶突变体的酶学性质研究

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 菌种与质粒

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验药品

4．3 转氨酶突变体的酶学性质研究

4．3．1 产酶条件优化

4．3．2 转氨酶突变体的酶学性质研究

4．3．3 催化制备西他列汀手性中间体

4．4 结果及分析

4．4．1 产酶条件优化

4．4．2 酶学性质表征

4．4．3 转氨酶催化西他列汀手性中间体

4．5 本章小结

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

作者简介