R型ω-转氨酶的克隆表达及其在手性药物合成中的应用研究

摘要

ω-转氨酶(ω-TA)是一种可逆地催化氨基与酮基互换的转移酶，由于其产物光学纯度高、立体选择性强、反应条件温和、环境友好等优点，ω-转氨酶在催化合成手性胺类化合物中得到广泛应用。相对于S型选择性转氨酶，R型选择性转氨酶的研究较少，而其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大，这使得R型选择性转氨酶具有更大的研究和应用价值。
　　本实验研究通过基因组挖掘的方法找到了两种新型R型ω-转氨酶，分别为来源于洋葱伯克霍尔德氏菌的转氨酶pdBC以及来源于尖孢镰刀菌的转氨酶hpFO。将这两种转氨酶pdBC、hpFO克隆到pET22b质粒上，并在大肠杆菌宿主中表达，经纯化后获得蛋白分子量大小分别为54kDa以及36 kDa。
　　在以R-苯乙胺、丙酮酸钠为模式底物对转氨酶pdBC、hpFO的酶学性质进行了研究，结果显示，转氨酶pdBC酶活力最适温度为35℃，最适pH值为10，在1mM浓度的金属离子作用下，Fe3+、Fe2+对酶具有明显的活化作用，而Cu2+、Mn2+具有较强的抑制作用，当温度大于35℃时该酶易失活，对于底物R-苯乙胺的米氏常数Km为31.238mM，对于底物丙酮酸钠的米氏常数为26.793 mM;转氨酶hpFO的最适的温度为25℃，最适pH值为7，当温度大于25℃时该酶易失活，在1mM浓度的金属离子作用下，Mg2+会抑制该酶的活性，而Mn2+具有活化作用，Zn2+对该酶的活化效果最为显著，可使得酶活力提高近6倍，转氨酶hpFO对于氨基供体R-苯乙胺的米氏常数Km为11.031 mM，对于氨基受体丙酮酸钠的Km为14.692 mM。在对转氨酶pdBC、hpFO的底物氨基受体以及氨基供体特异性研究中，转氨酶pdBC、hpFO表现出对R-苯乙胺以及苯乙酮结构类似底物的活性。
　　在转氨酶ATA-117催化合成西他列汀以及西他列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸乙酯的研究中，分别将R型选择性转氨酶ATA-117在大肠杆菌以及毕赤酵母表达系统进行表达，结果表明大肠杆菌Transetta工程菌构建简单，发酵周期较短，可以作为转氨酶ATA-117较好的表达宿主。当以R-苯乙胺作为氨基供体时，ATA-117可以催化相应底物合成具有R构型的西他列汀中间体，其ee值为81.35％，转化率为70.47％，这为药物西他列汀的合成提供了一个新方法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 转氨酶

1．1．1 转氨酶简介

1．1．2 ω-转氨酶(ω-TA)

1．1．3 转氨酶催化机制

1．1．4 转氨酶的分类

1．2 手性胺类药物

1．2．1 手性药物

1．2．2 手性药物的制备方法

1．2．3 手性胺类药物制备方法

1．3 R型ω-转氨酶研究进展

1．3．1 土壤样本中筛选具有R型ω-转氨酶活性菌株

1．3．2 一种新R型ω-转氨酶的纯化及克隆表达

1．3．3 经由计算机模拟挖掘新酶的方法

1．3．4 利用保守序列比对挖掘新酶方法

1．4 一种利用R型ω-转氨酶催化合成的手性胺类药物

1．4．1 手性胺类药物西他列汀介绍

1．4．2 西他列汀的合成方法

1．4．3 酶不对称催化合成西他列汀方法

1．5 课题研究目的及意义

第二章 洋葱伯克霍尔德氏菌中一种新R型ω-转氨酶的克隆表达与蛋白纯化

2．1 引言

2．2 本章主要研究内容

2．3 实验仪器与试剂

2．4 实验方法

2．4．1 洋葱伯克霍尔德氏菌全基因组的提取

2．4．2 目的片段扩增

2．4．3 pET22b-pdBC重组质粒的构建

2．4．4 pdBC的诱导表达

2．4．5 超声破碎细胞

2．4．6 SDS-PAGE凝胶电泳

2．4．7 pdBC的催化活性检测

2．4．8 转氨酶pdBC的纯化

2．4．9 转氨酶pdBC蛋白质浓度的测定

2．4．10 转氨酶pdBC酶的活力测定

2．5 结果分析与讨论

2．5．1 pdBC目的片段扩增

2．5．2 pET22b-pdBC重组质粒的构建

2．5．3 pdBC诱导表达以及SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白

2．5．4 pdBC的催化活性检测

2．5．5 转氨酶pdBC的纯化

2．5．6 转氨酶pdBC蛋白质浓度的测定

2．5．7 转氨酶pdBC酶活力测定

2．6 本章小结

第三章 尖孢镰刀菌中一种新R型ω-转氨酶的克隆表达与蛋白纯化

3．1 引言

3．2 本章主要研究内容

3．3 实验仪器与试剂

3．4 实验方法

3．4．1 尖孢镰刀菌的恢复培养

3．4．2 尖孢镰刀菌基因组提取以及验证

3．4．3 目的片段phFO扩增

3．4．4 重组质粒pET22b-phFO的构建

3．4．5 重组蛋白hpFO的诱导表达

3．4．6 重组蛋白hpFO的纯化

3．4．7 hpFO催化活性的测定

3．4．8 转氨酶hpFO的酶活力测定

3．5 结果分析与讨论

3．5．1 尖孢镰刀菌基因组提取以及验证

3．5．2 目的片段hpFO扩增

3．5．3 重组质粒pET22b-hpFO的构建

3．5．4 重组蛋白hpFO的诱导表达

3．5．5 重组蛋白hpFO的纯化

3．5．6 hpFO催化活性检测以及转氨酶hpFO酶活力测定

3．6 本章小结

第四章 R型ω-转氨酶pdBC、hpFO的酶学性质研究

4．1 引言

4．2 本章主要研究内容

4．3 实验仪器与试剂

4．4 实验方法

4．4．1 不同pH对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响

4．4．2 不同温度对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响

4．4．3 转氨酶pdBC、hpFO温度稳定性研究

4．4．4 金属离子对pdBC、hpFO酶活的影响

4．4．5 转氨酶pdBC、hpFO米氏常数的测定

4．5 结果分析与讨论

4．5．1 不同pH对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响

4．5．2 不同温度对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响

4．5．3 转氨酶pdBC、hpFO热稳定性研究

4．5．4 金属离子对转氨酶pdBC、hpFO酶活影响

4．5．5 转氨酶pdBC、hpFO米氏常数的测定

4．6 本章小结

第五章 转氨酶pdBC、hpFO底物特异性研究

5．1 引言

5．2 本章主要研究内容

5．3 实验仪器与试剂

5．4 实验方法

5．4．1 3-(1-乙氨基)-苯酚的合成

5．4．2 (R)-3-(1-乙氨基)-苯酚的合成

5．4．3 1-(2-氟苯基)-乙胺的合成

5．4．4 1-(3-氯苯基)-乙胺的合成

5．4．5 1-(3-溴苯基)-乙胺的合成

5．4．6 3-氧-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸乙酯的合成

5．4．7 [3，4](亚甲基二氧)-苯丁酮的合成

5．4．8 3-氧-3-苯基-丙酸甲酯的合成

5．4．9 2-乙酰基-苯甲酸乙酯的合成

5．4．10 (R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸乙酯的合成

5．4．11 3-氨基-3-苯基-丙酸甲酯的合成

5．4．12 (4-氯苯基)-苯基-甲胺的合成

5．4．13 胺类化合物以及酮类化合物HPLC检测条件的确定

5．4．14 转氨酶pdBC、hpFO的氨基受体特异性研究

5．4．15 转氨酶pdBC、hpFO的氨基供体特异性研究

5．5 结果分析与讨论

5．5．1 几种胺类化合物以及酮类化合物的化学合成

5．5．2 胺类化合物以及酮类化合物HPLC检测条件的确定

5．5．3 转氨酶pdBC、hpFO的氨基受体特异性研究

5．5．4 转氨酶pdBC、hpFO的氨基供体特异性研究

5．6 本章小结

第六章 ATA-117在大肠杆菌以及毕赤酵母表达系统中的克隆表达以及ATA-117工程菌在西他列汀药物合成中的应用研究

6．1 引言

6．2 本章主要研究内容

6．3 实验仪器与试剂

6．4 实验方法

6．4．1 R型选择性转氨酶ATA-117在大肠杆菌宿主中克隆与重组表达

6．4．2 R型选择性转氨酶ATA-117在毕赤酵母宿主中克隆与重组表达

6．4．3 ATA-117在BL-21、Transetta大肠杆菌以及GS115毕赤酵母表达系统中的表达效果比较

6．5 结果分析与讨论

6．5．1 R型选择性转氨酶ATA-117在大肠杆菌宿主中克隆与重组表达

6．5．2 R型选择性转氨酶ATA-117在毕赤酵母宿主中克隆与重组表达

6．5．3 ATA-117在BL-21、Transetta大肠杆菌以及GS115毕赤酵母表达系统中表达的研究

6．6 本章小结

第七章 总结

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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