用于检测培养于含有EGF或BFGF的培养基的脂肪源性干细胞的增殖和治疗能力的标记物及其用途

摘要

本发明涉及用于检测标记物的组合物，所述标记物用于检测培养于含有表皮生长因子(EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基的脂肪源性干细胞的增殖能力或治疗能力；以及检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测标记物的组合物及其检测方法，所述标记物能够 检测培养于含有表皮生长因子(EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 的培养基的脂肪源性干细胞的增殖或治疗潜能。

背景技术

因为脂肪组织含有的干细胞比可以从等量的骨髓获得的干细胞多 1000倍，已经进行各种研究来将脂肪组织源性干细胞(ASC)用作移植 材料。而且，脂肪源性干细胞是多能样(multipotentlike)骨髓源性干 细胞因此能够被分化为软骨类、骨类、脂肪细胞、肌肉细胞等。此外， 脂肪源性干细胞在表达细胞表面标记物方面与骨髓源性干细胞类似，并 已经被报道不诱导针对体内和体外自体移植或异体移植的免疫反应，而 是在调节免疫反应方面表现出潜能，从而获得作为有效用于基于细胞治 疗的方法方面的关注。

但是，如果使用常规已知基础培养基通过标准培养方法体外培养脂 肪源性干细胞，该细胞培养需要大量时间，从而使得难于获得临床有效 数量的细胞。因此，标准培养方法在实际临床应用中具有低效率的缺点。 在这方面，本发明人目标在于开发用于有效临床治疗方法的培养方法， 并确认，相比于通过标准培养方法培养的脂肪源性干细胞，在含有表皮 生长因子(EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中培养的 脂肪源性干细胞表现出优异的临床效果(申请公开号为10-2010-0118491 的韩国专利)。但是，尚未提供与在含有EGF或bFGF的培养基中培养的 脂肪源性干细胞的优异临床效果有关的涉及分子生物学特征的目标分 析。

特别地，对于作为实际药物具有高于一定水平的治疗作用同时相比 于在基础培养基中培养的干细胞表现出在生长培养基中培养的干细胞的 优异的增殖和治疗潜能的干细胞治疗剂的可重复生产，需要开发可被应 用于使用生长培养基通过改善的培养方法所获得的医学效果如干细胞的 分化潜能、增殖潜能和效力的质量控制检查的方法。特别地，为了开发 评估治疗剂的质量和细胞治疗剂的产量提高的方法，需要能够表示这种 提高的生物标记物。

发明内容

技术问题

与培养于基础培养基中相比，当培养于生长培养基中时，脂肪源性 干细胞表现出优异的增殖潜能，使得其甚至在长期传代培养之后仍然能 够维持干细胞的特征，并表现出高治疗效果以及分化潜能。在这方面， 本发明人目标在于开发一种标记物，其在培养于基础培养基中的脂肪源 性干细胞和培养于生长培养基中的脂肪源性干细胞之间显示出表达差 异，并且本发明人观察到在培养于生长培养基中的脂肪源性干细胞中， 1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶9(AGPAT9)、膜联蛋白A10(ANXA10)、 胰岛素样生长因子2结合蛋白3(IGF2BP3)和前列腺素E受体2(PTGER2) 的基因表达提高，并且整合素α11(ITGA11)、PRKC细胞凋亡WT1调节 子蛋白(PAWR)(PRKCapoptosisWT1regulatorprotein)和分泌型卷 曲相关蛋白2(SFRP2)的基因表达降低。因此，本发明人确认，这些基 因可以被用于测量培养于生长培养基中的脂肪源性干细胞的治疗活性等 以及增殖、免疫抑制潜能、分化潜能等，并完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供检测标记物的组合物，所述标记物能够检 测培养于含有表皮生长因子(EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 的培养基的脂肪源性干细胞的治疗潜能，所述组合物包括用于测量至少 一种基因的mRNA或蛋白质水平的试剂，所述至少一种基因选自由1-酰 基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶9(AGPAT9)、膜联蛋白A10(ANXA10)、 胰岛素样生长因子2结合蛋白3(IGF2BP3)、前列腺素E受体2(PTGER2)、 整合素α11(ITGA11)、PRKC细胞凋亡WT1调节子(PAWR)和分泌型卷 曲相关蛋白2(SFRP2)组成的组。

本发明的另一个目的是提供用于检测标记物的组合物，所述标记物 能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞的增殖潜 能，所述组合物包括用于测量选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、 ITGA11、PAWR和SFRP2组成的组中至少一种基因的mRNA或蛋白质水平 的试剂。

本发明的另一个目的是提供用于检测标记物的试剂盒，所述标记物 能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞的治疗或 增殖潜能，所述试剂盒包括用于检测该标记物的组合物。

本发明的另一个目的是提供用于检测脂肪源性干细胞的治疗或增殖 潜能的方法，所述方法包括测量培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂 肪源性干细胞中的选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、 PAWR和SFRP2组成的组中至少一种基因的mRNA或蛋白质水平的步骤。

有益效果

本发明提供能够检测培养于生长培养基中的具有增强的临床效果的 脂肪源性干细胞的标记物，从而为证实脂肪源性干细胞的效果提供更加 有效的数据。而且，本发明可以被有效用作能够检测通过改善的培养方 法培养的脂肪源性干细胞的由增殖潜能、分化潜能等代表的治疗活性的 标记物。

附图说明

图1显示在基础培养基和生长培养基中的脂肪源性干细胞的细胞形 态学。

图2显示在基础培养基和生长培养基中的脂肪源性干细胞的细胞生 长差异。

图3显示使用Illumina24K芯片的培养于3组基础培养基中的细胞 和培养于生长培养基中的脂肪源性干细胞的微阵列结果。

图4显示由RT-PCR和实时PCR所证实的、收集自17个供体的脂肪 源性干细胞中的基因表达量的改变，其在图3中的生长培养基中提高， 其中RPL13A为对照基因。图4A、4B、4C和4D分别显示APPAT9、ANXA10、 IGF2BP3和PTGER2的结果，其在生长培养基中均提高。

图5显示由RT-PCR和实时PCR所证实的、收集自17个供体的脂肪 源性干细胞中的基因表达量的改变，其在图3中的生长培养基中降低， 其中RPL13A为对照基因。图5A、5B和5C分别显示ITGA11、PAWR和SFRP2 的结果，其在生长培养基中均降低。

图6显示在基础培养基和生长培养基中的基因的蛋白质改变。

具体实施方式

本发明提供用于检测标记物的组合物，所述标记物能够检测培养于 含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞的治疗潜能，所述组合物 包括用于测量选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR 和SFRP2组成的组中至少一种基因的mRNA或蛋白质水平的试剂。

如本文使用的术语“脂肪源性干细胞(ASC)”是指分离自脂肪组织 的干细胞，其能够分化成为大多数间充质细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、 软骨细胞、肌成纤维细胞等，并且其也被称为前脂肪细胞、基质细胞、 多能脂肪源性的细胞、脂肪源性成体干细胞等。所述脂肪源性干细胞可 以源自包括猪、牛、灵长类动物、人类等哺乳动物，其可以被移植到人 类,但不限于此。

如本文使用的术语“能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的 脂肪源性干细胞的治疗潜能的标记物”是指有机生物分子，所述有机生 物分子在比较培养于不含EGF或bFGF的基础培养基中的脂肪源性干细胞 和培养于含有EGF或bFGF的生长培养基中的脂肪源性干细胞时，表现出 表达水平的显著差异。而且，与培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞 相比，培养于生长培养基中的脂肪源性干细胞具有优异的治疗潜能，如 免疫抑制或分化潜能等(申请公开号为10-2010-0118491的韩国专利)。 因此，该术语是指能够通过比较表达水平与基础培养基中的表达水平来 检测脂肪源性干细胞的治疗潜能的标记物，并具体为选自由AGPAT9、 ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR和SFRP2组成的组中至少一 种基因，与培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞相比，所述标记物对 于培养于生长培养基中的脂肪源性干细胞显示提高的AGPAT9、ANXA10、 IGF2BP3和PTGER2表达，以及降低的ITGA11、PAWR和SFRP2表达。

而且，本发明中所使用的基因的信息，可以从已知数据库获得，所 述数据库如美国国立卫生研究院的GenBank等，并且其实例可以包括但 不限于AGPAT9(NM_032717.3，NP_001243351.1)、ANXA10(NM_007193.3， NP_009124.2)、IGF2BP3(NM_006547.2，NP_006538.2)、PTGER2 (NM_000956.2，NP_000947.2)、ITGA11(NM_001004439.1， NP_001004439.1)、PAWR(NM_002583.2，NP_002574.2)或SFRP2 (NM_003013.2，NP_003004.1)。

当比较培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞和培养于生长培养基 中的脂肪源性干细胞时，所述基因显示表达差异。在这方面，所述基因 可以被用作检测脂肪源性干细胞的治疗潜能的标记物。

如本文所使用的术语“表皮生长因子(EGF)”是指能够通过结合其 受体EGFR刺激细胞增殖、生长和分化的生长因子。EGF的作用是刺激各 种上皮细胞的增殖并还能够增殖大鼠T细胞或人成纤维细胞。根据本发 明的目的，EGF是指通过被包含于脂肪源性干细胞的培养基中起到提高 治疗活性(如增殖和分化潜能)作用的蛋白质。

如本文所使用的术语“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)”是指生 物过程(如血管生成或伤口愈合)中涉及的生长因子。根据本发明的目 的，与EGF类似，bFGF是指通过被包含于脂肪源性干细胞的培养基中起 提高治疗活性(如增殖和分化潜能)作用的蛋白质。

如本文所使用的术语“基础培养基”是指用于培养脂肪源性干细胞 的培养基，特别是含有这样的细胞的基质血管组分。所述基础培养基可 以是DMEM培养基，或当培养脂肪源性干细胞时的含有血清的培养基，如 DMEM/F12等，其中所述血清可以是常规用于细胞培养的胎牛血清(FBS) 并培养基含有但并不限于大约10％(即8％至12％)的所述血清，只要其 为本领域常规用于脂肪源性干细胞的培养基。在本发明的一个实施方案 中，含有10％FBS的DMEM培养基被用作基础培养基。

如本文所使用的术语“生长培养基”是指用于提高脂肪源性干细胞 的增殖或分化潜能的培养基，其除了基础培养基之外还包含碱性成纤维 细胞生长因子(bFGF)或表皮生长因子(EGF)。所述生长培养基可以 0.1ng/mL至100ng/mL的浓度含有EGF和bFGF中的每一个。在本发明 中，术语“生长培养基”可以与术语“含有EGF或bFGF的培养基”互换 使用。

关于基础培养基和生长培养基的信息等公开于申请公开号为 10-2010-0118491的韩国专利中，并且申请公开号为10-2010-0118491 的韩国专利的整个说明书可以作为本发明的参考被包括进本发明，但并 不限于此。

如本文所使用的术语“治疗潜能”是指干细胞的治疗活性，并且当 本发明的干细胞被用作细胞治疗剂等时可以被称为“效力”。优选地， 它是指但并不限于脂肪源性干细胞的增殖、分化、免疫调节潜能或上述 所有潜能。

如本文所使用的术语“分化潜能”是指脂肪源性干细胞分化成脂肪 细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌成纤维细胞、成骨细胞、肌肉细胞、神 经元等的潜能。在本发明中，具有高分化潜能的脂肪源性干细胞是指容 易被诱导分化成但不限于脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌成纤维细 胞、成骨细胞、肌肉细胞或神经元的细胞。

如本文所使用的术语“免疫调节潜能”优选指免疫抑制潜能，其是 指培养于含有bFGF或EGF的培养基中的脂肪源性干细胞在抑制免疫细胞 的活性方面的潜能。特别地，已知间充质干细胞通过抑制抗原递呈细胞 (APCs)参与免疫抑制作用。因此，可以使用本发明的脂肪源性干细胞 作为免疫抑制剂治疗免疫疾病。

如本文所使用的术语“具有高治疗潜能的脂肪源性干细胞”是指与 培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞相比具有选自由AGPAT9、ANXA10、 IGF2BP3和PTGER2组成的组中至少一种基因的提高的表达以及选自由 ITGA11、PAWR和SFRP2组成的组中至少一种基因的降低的表达的脂肪源 性干细胞，并且还指与培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞相比具有 更快的增殖、更好的免疫抑制潜能、分化效率等从而作为治疗剂表现出 更好的活性(效力)的脂肪源性干细胞。

可以通过测量mRNA或蛋白质的量(水平)检测基因的表达水平。

如本文所使用的术语“mRNA水平测量”是指检测代表生物样品中脂 肪源性干细胞的治疗潜能的标记物基因的mRNA的存在和表达水平从而 检测脂肪源性干细胞的分化潜能的过程。相应的分析方法可以包括但不 限于RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定(RPA)、 Northern印迹法、DNA芯片等。在本发明的一个实施方案中，使用RT-PCR 和实时PCR检测所述基因的mRNA水平(实施例3)。

用于测量基因的mRNA水平的试剂优选引物对或探针，和分别由 NM_032717.3、NM_007193.3、NM_006547.2、NM_000956.2、 NM_001004439.1、NM_002583.2和NM_003013.2代表AGPAT9、ANXA10、 IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR和SFRP2基因的核苷酸序列。因此， 基于所述序列，本领域技术人员可以设计能够特异性扩增所述基因的具 体区域的引物或探针。

如本文所使用的术语“引物”是指具有游离3'-末端羟基的短核苷 酸序列，其能够与互补模板形成碱基对并作为用于模板链复制的起点发 挥功能。在本发明中，优选但并不限于，针对AGPAT9的引物是由SEQID NOS:3和4代表的引物对，针对ANXA10的引物是由SEQIDNOS:5和6 代表的引物对，针对IGF2BP3的引物是由SEQIDNOS:7和8代表的引 物对，针对PTGER2的引物是由SEQIDNOS:9和10代表的引物对，针 对ITGA11的引物是由SEQIDNOS:11和12代表的引物对，针对PAWR 的引物是由SEQIDNOS:13和14代表的引物对，或者针对SFRP2的引 物是由SEQIDNOS:15和16代表的引物对。

如本文所使用的术语“探针”是指RNA、DNA等的核酸片段，其由几 个至上百个碱基组成，其能够特异性结合mRNA并被加标签以允许检测 mRNA的存在。探针可以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、 RNA探针等的形式进行构建。在本发明中，经由使用AGPAT9、ANXA10、 IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR或SFRP2多核苷酸及其互补探针进行 杂交，通过多核苷酸和互补探针是否杂交确定脂肪源性干细胞的分化潜 能。本领域技术人员可以基于本领域已知内容适当地选择探针和杂交条 件。

在用于聚合的4种不同核苷三磷酸(即DNA聚合酶或逆转录酶)和 试剂的存在下、在合适的缓冲溶液中、在合适的温度下，本发明的引物 可以启动DNA合成。本发明的引物是特异性针对每种标记物基因的正义 和反义核酸，其具有7至50个核苷酸序列。在不改变引物作为DNA合成 的起点的基础功能的情况下，引物可以引入另外的特征。本发明的引物 或探针可以通过亚磷酰胺固相基质法、或其它广泛知晓的方法进行化学 合成。也可以通过本领域已知的众多方法修饰所述核苷酸序列。这样的 修饰的非限制性的例子包括甲基化、加帽、将至少一个天然核苷酸置换 为类似物、以及在核苷酸之间的修饰如修饰成不带电连接物质(例如甲 基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)或带电连接物质(例如 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。核酸可以含有至少一种另外的共价键 合的残基，如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨 酸等)、嵌入材料(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放 射性金属、铁、氧化性金属等)和烷化剂。还可以使用能够直接或间接 提供可检测信号的标签来修饰本发明的核苷酸序列。标签的例子可以包 括放射性同位素、荧光分子、生物素等。

如本文所使用的术语“蛋白质水平测量”是指检测代表生物样品中 脂肪源性干细胞的治疗潜能的标记物基因的蛋白质的存在和表达水平的 过程，以检测脂肪源性干细胞的分化潜能。优选地，可以使用特异性结 合所述基因的蛋白质的抗体测量蛋白质的量。

如本文所使用的术语“抗体”是指通过其与抗原结合部位 (antigeniclocalities)区分的特异性蛋白质分子。根据本发明的目 的，抗体特异性结合标记物蛋白质，特别是结合由本发明的标记物基因 AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR或SFRP2编码的蛋 白质，并且所述抗体包括所有的多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。 由于早已研究了本发明的标记物蛋白质，使用其的抗体可以通过本领域 广泛知晓的方法容易地进行生产。可以通过本领域广泛知晓的方法生产 多克隆抗体，其包括将所述标记物蛋白质抗原注射入动物，接着取血样 并获得含有抗体的血清。可以从任意动物宿主(如山羊、兔、绵羊、猴、 马、猪、牛、狗等)生产所述多克隆抗体。可以通过本领域广泛知晓的方 法生产单克隆抗体，如杂交瘤法(KohlerandMilstein(1976)欧洲免 疫学杂志(EuropeanJournalofImmunology)6:511-519)或噬菌体 抗体文库法(Clackson等,自然(Nature),352:624-628,1991；Marks 等,J.Mol.Biol.,222:58,1-597,1991)等。由这样的方法生产的 抗体可以通过如凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析或亲和层析的 方法进行分离和纯化。而且，本发明的抗体不仅包括具有两条全长轻链 和两条全长重链的完整形式抗体分子，而且包括抗体分子的功能片段。 抗体分子的功能片段是指至少具有结合抗原的能力的片段，并且可以包 括Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv等。在蛋白质水平的测量方法包括但不限 于Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、 放射性免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染 色、免疫沉淀测定、补体结合测定、荧光激活细胞分选(FACS)、蛋白 质芯片等。在本发明的一个实施方案中，经由Western印迹测量所述蛋 白质水平(实施例4)。

在本发明的一个实施方案中，基于与培养于不含生长因子的基础培 养基中的脂肪源性干细胞相比，培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂 肪源性干细胞的治疗活性如增殖潜能、免疫抑制、分化潜能等是更优异 的(申请公开号为10-2010-0118491的韩国专利)，检测了在培养于含 有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞和培养于基础培养基中的脂 肪源性干细胞之间显示显著表达差异的基因，并且结果证实了在培养于 含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞中的AGPAT9、ANXA10、 IGF2BP3和PTGER2的提高的表达以及ITGA11、PAWR和SFRP2的降低的 表达(图4和5)。因此，确认被高表达的AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3 和PTGER2蛋白和被低表达的ITGA11、PAWR或SFRP2蛋白可以被用作针 对脂肪源性干细胞的治疗活性的标记物(图6)。

在另一方面，本发明提供用于检测标记物的组合物，所述标记物能 够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞的增殖潜 能，所述组合物包括用于测量选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、 ITGA11、PAWR和SFRP2组成的组中至少一种基因的mRNA或蛋白质水平 的试剂。

所述脂肪源性干细胞、EGF、bFGF、mRNA或蛋白质水平测量以及基因 如上所述。

如本文所使用的术语“增殖潜能”是指提高参与由自我调节或外部 刺激如激素所刺激的DNA合成或细胞分裂的细胞数量的潜能，并且还包 括以下情况：其中细胞具有增殖的潜能但在该时刻并不增殖。因为干细 胞具有体外自我更新的潜能，所以它们具有增殖潜能，但是所述增殖潜 能随培养代数的重复而降低，在获得大量纯干细胞方面具有局限性。因 此，为了有效使用干细胞作为治疗剂，需要能够在短时间内大量获得干 细胞的培养方法。

在本发明中，确认与培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞相比， 培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞表现出更优异的增 殖潜能，并且检测了在基础培养基或生长培养基中培养的在增殖潜能方 面显示差异的脂肪源性干细胞之间显示表达差异的基因。

特别是，与培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞相比，培养于生 长培养基中的脂肪源性干细胞中选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和 PTGER2组成的组的至少一种基因的表达提高，以及选自由ITGA11、PAWR 和SFRP2组成的组的至少一种基因的表达降低。与培养于基础培养基中 的脂肪源性干细胞相比，特别是与具有降低的AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3 或PTGER2基因表达或提高的ITGA11、PAWR或SFRP2基因表达的脂肪源 性干细胞相比，具有这样的基因表达的脂肪源性干细胞表现出更优异的 增殖，从而提高细胞的产量并显示出高临床治疗效果的特征，如细胞增 殖、免疫抑制和分化潜能。

在本发明的一个实施方案中，当相同量的脂肪源性干细胞培养于基 础培养基和生长培养基中连续五代时，观察到在生长培养基中的细胞增 殖平均提高了两倍或更高(实施例1和图2)。

在另一个方面，本发明提供用于检测能够检测培养于含有EGF或 bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞的分化潜能的标记物的试剂盒，所述 试剂盒包括用于检测能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪 源性干细胞的分化潜能的标记物的组合物。

用于检测能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性干 细胞的分化潜能的标记物的组合物如上所述。

本发明的用于检测标记物的试剂盒包括依据用于培养的含有的EGF 或BFGF的生长培养基其表达提高或降低的标记物基因，能够特异性鉴定 其蛋白质的引物，或抗体，以及通常被用于本领域中的免疫学分析的工 具和试剂。所述工具和试剂包括但不限于合适的载体、能够产生可检测 的信号的标记物、溶剂、去污剂、缓冲剂、稳定剂等。当所述标记物为 酶时，可以含有允许测量酶活的底物和反应终止剂。合适的载体可以是 可溶性载体，如本领域已知的生理学可接受的缓冲剂，如PBS，不溶性 载体如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡 聚糖、多糖、聚合物，其中镀有类似于磁性粒子的金属的胶乳、其它纸、 玻璃、金属、琼脂糖及其组合，但不限于此。

用于检测本发明的标记物的试剂盒可以优选为RT-PCR试剂盒、DNA 试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。当在所述蛋白质芯片中提供针对由所述基 因编码的蛋白质的抗体时，可以观察到与至少两种抗体有关的抗原-抗体 复合体的形成，并因此所述蛋白质芯片试剂盒在检测脂肪源性干细胞的 分化潜能方面更加有利。

所述RT-PCR试剂盒可以包括各自特异性针对所述标记物基因的引物 对并且还可以包括试管或其它合适的容器、反应缓冲溶液(各种pH和镁 离子浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA 酶、RNA酶抑制剂、DEPC-水、灭菌水等。

所述DNA芯片试剂盒可以包括附着有基因、cDNA或对应于其片段的 寡核苷酸的底物，用于产生加荧光标签的探针的试剂，制剂，酶等。所 述底物可以包括对照基因、或cDNA或对应于其片段的寡核苷酸。

所述蛋白质芯片试剂盒可以是这样的试剂盒，其中针对标记物的至 少一种抗体被组织于底物上预定的位置并以高浓度进行固定。通过从样 品分离蛋白质，将分离的蛋白质与蛋白质芯片杂交以形成抗原-抗体复合 体，并且分析结果，蛋白质芯片可以被用于检测蛋白质的存在和表达水 平。

在本发明的一个实施方案中，培养于基础培养基和生长培养基中的 脂肪源性干细胞中标记物基因之间的表达差异经由微阵列进行确认(实 施例2和图3)。

在另一个方面，本发明提供用于检测能够检测培养于含有EGF或 bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞的增殖潜能的标记物的试剂盒，所述 试剂盒包括用于检测能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪 源性干细胞的增殖潜能的标记物的组合物。

所述用于检测能够检测培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源 性干细胞的增殖潜能的标记物的组合物和用于检测标记物的可以使用的 试剂盒如上所述。

在另一个方面，本发明提供用于检测脂肪源性干细胞的分化潜能的 方法，所述方法包括测量培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性 干细胞中的选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR 和SFRP2组成的组中至少一种基因的mRNA或蛋白质水平的步骤。

所述含有EGF或bFGF的培养基、所述基因的mRNA或蛋白质水平的 测量和脂肪源性干细胞的分化潜能如上所述。所述方法可以是还包括以 下步骤的用于检测脂肪源性干细胞的分化潜能的方法，所述步骤为与用 作对照组的培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞所测量的量相比，当 选自由ITGA11、PAWR和SFRP2组成的组的至少一种基因的mRNA或蛋白 质的量更低时或者当选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和PTGER2组成的 组的至少一种基因的mRNA或蛋白质的量更高时，确定该分化潜能高于对 照组的分化潜能。

优选地，作为对照组的培养于基础培养基中的脂肪源性干细胞和培 养于生长培养基中的脂肪源性干细胞代数相同或最多具有一代的差异。

在本发明的一个实施方案中，基于与培养于不含EGF或bFGF的基础 培养基中的脂肪源性干细胞相比，培养于含有EGF或bFGF的培养基中的 脂肪源性干细胞的治疗活性如增殖潜能、分化潜能等是更优异的(申请 公开号为10-2010-0118491的韩国专利)，检测了在培养于含有EGF或 bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞和培养于基础培养基中的脂肪源性干 细胞之间显示显著表达差异的基因，并且结果证实了培养于含有EGF或 bFGF的培养基中的脂肪源性干细胞中的AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和 PTGER2的提高的表达以及ITGA11、PAWR和SFRP2的降低的表达(图4 和5)。因此，与具有AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和PTGER2降低表达或 ITGA11、PAWR和SFRP2提高表达的脂肪源性干细胞相比，具有AGPAT9、 ANXA10、IGF2BP3和PTGER2提高表达或ITGA11、PAWR和SFRP2降低表 达的脂肪源性干细胞表现出优异的分化潜能。

在另一个方面，本发明提供用于检测脂肪源性干细胞的增殖潜能的 方法，所述方法包括测量培养于含有EGF或bFGF的培养基中的脂肪源性 干细胞中的选自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR 和SFRP2组成的组中至少一种基因的mRNA或蛋白质水平的步骤。

所述含有EGF或bFGF的培养基、所述基因的mRNA或蛋白质水平的 测量和脂肪源性干细胞的增殖潜能如上所述。

优选地，所述方法可以是还包括以下步骤的用于检测脂肪源性干细 胞的增殖潜能的方法,所述步骤为：与用作对照组的培养于基础培养基中 的脂肪源性干细胞所测量的量相比，当选自由ITGA11、PAWR和SFRP2组 成的组的至少一种基因的mRNA或蛋白质的量更低时或者当选自由 AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和PTGER2组成的组的至少一种基因的mRNA 或蛋白质的量更高时，确定该分化潜能高于对照组的分化潜能。

实施例

在下文中，本发明将参考实施例进行更详细地描述。但是，实施例 仅用于说明的目的，因此本发明的范围并不旨在由所述实施例限制。

实施例1：检测在基础培养基或生长培养基中的脂肪源性干细胞的细胞增殖潜能。

实施例1-1：培养人脂肪源性基质干细胞

从供体(Anterogen,京畿道(Gyeonggi-do),韩国)分离脂肪组 织，并从所获得的脂肪组织分离脂肪源性干细胞。为了除去血液，用相 同体积的克-林二氏重碳酸盐(Krebs-Ringerbicarbonate，KRB)溶液 洗涤脂肪组织34次。向脂肪组织加入相同体积的胶原酶溶液并使其在 37℃的水浴中反应，转移入离心管，并以1200rpm的速度在20℃离心 10分钟。去除脂肪层上清，并仔细分离下层的胶原酶溶液，小心不要摇 动。向其加入基础培养基重悬之后，所分离的层以1200rpm的速度在 20℃离心5分钟。因为沉淀到底部的部分是基质血管组分，所以去除上 清。将所述基质血管组分重悬于基础培养基中，接种至培养容器上并在 37℃、5％CO₂的培养箱中培养24小时。除去培养基后，用磷酸盐缓冲溶 液洗涤产物，并在基础培养基、含有浓度1ng/mL的bFGF的基础培养基 或含有浓度5ng/mL的EGF的基础培养基中进行增殖。当脂肪源性干细 胞被增殖到覆盖培养容器的80-90％时，通过用胰酶处理将它们获得为单 个细胞。用生长培养基以1:31:4的比例稀释所收集的细胞并进行继代培 养(申请公开号为10-2010-0118491的韩国专利)。为了根据培养基组 成分析表达差异，收集培养于含有10％FBS的DMEM的基础培养基中的第 5代细胞和培养于生长培养基中的第5代细胞，所述生长培养基为含有1 ng/mLbFGF的基础培养基。

培养了总共5批(lot)显示与培养于基础培养基中相比，当培养于 生长培养基中时增殖速率更快，并且稳定的成纤维细胞结构得到保持。 图1显示培养于基础培养基和生长培养基中的脂肪源性干细胞的结构。 图2显示培养于基础培养基和生长培养基中的脂肪源性干细胞的细胞群 体倍增水平(CPDL)的例子。

实施例2：经由微阵列分析鉴定依据培养基的提高的基因表达

实施例2-1：培养人脂肪源性干细胞

从17个供体(Anterogen,京畿道,韩国)分离脂肪组织，并以与 实施例1中相同的方式培养脂肪源性干细胞。

实施例2-2：分离总RNA

使用QIAGEN试剂盒(RNeasyMaxi试剂盒：cat#75162)分离总RNA， 并使用ExperionRNAStdSens芯片(Bio-Rad)进行定量。首先，所培 养的脂肪源性干细胞溶解于所述试剂盒中的15mL的降解缓冲溶液中， 向其加入150μL的β-巯基乙醇。向其加入15mL的70％乙醇并进行搅 拌，并以3000g离心5分钟，从而将总RNA附着至膜上。洗涤两次后， 通过加入1.2mL的无RNA酶的水分离RNA。

实施例2-3：实施微阵列

使用IlluminaTotalPrepRNA扩增试剂盒(Ambion)杂交所提取的 总RNA。使用T7T重复寡核苷酸(dT)引物合成cDNA，并使用生物素-UTP 通过体外转录制备加生物素标签的cRNA。使用NanoDrop定量所制备的 cRNA。脂肪源性干细胞中制备的cRNA在人-6V2芯片(Illumina)上进 行杂交。杂交后，用Illumina基因表达系统洗涤缓冲液(Illumina)洗 涤DNA芯片以除去非特异性杂交，并且用链霉亲和素-Cy3(Amersham) 荧光染色剂将所洗涤的DNA芯片加标签。用共聚焦激光扫描仪 (Illumina)扫描加荧光标签的DNA芯片。获得每个点的荧光数据并以 TIFF格式保存为图像文件。使用BeadStudio版本3(Illumina)定量 TIFF图像文件，从而定量每个点的荧光。使用AvadisProphetic版本3 (StrandGenomics)中的‘分位数(quantile)’选项校正所定量的结 果。

结果示于图3中。图3显示在基础培养基中和在生长培养基中培养 的第5代细胞之间的表达差异。与基础培养基相比，在生长培养基中的 AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和PTGER2基因显示出显著提高的表达，以及 ITGA11、PAWR和SFRP2基因显示出显著降低的表达。结果表明，所述基 因可以被用于确定培养于临床有效生长培养基中的脂肪源性干细胞，因 为它们在基础培养基和生长培养基之间显示出显著的表达差异。但是， 这样的结果可能与区分干细胞和分化的干细胞的已知标记物不同，并且 还可以依据代数和分化而不同。例如，在分化之前的干细胞之中IGF2BP 的表达随代数提高，但在分化开始之后急剧降低。在分化之前的干细胞 之中ITM2A的表达随代数降低，但在分化开始之后提高。

实施例3：对个别供体的脂肪源性干细胞在基础培养基和生长培养基之间显示表达差异的基因的个别检测

经由RT-PCR使用来自供体的17对脂肪源性干细胞样品(培养于基 础培养基和生长培养基中的细胞)分析在实施例2中确认的基因的表达 水平。根据实施例2的方法分离总RNA。

实施例3-1：合成cDNA并校正模板浓度

向每个样品加入2μg的总RNA、1μL的50MT重复寡核苷酸(dT) 引物和2.5μL的10mMdNTP，并通过加入含有RNA酶抑制剂DEPC的 灭菌水制备总共25μL的RNA/引物混合溶液。65℃反应5分钟后，在 55℃储存混合溶液。然后，加入5μL的10XRT缓冲液、10μL的25mM MgCl₂、5μL的0.1MDTT、1μL的RNA酶抑制剂和1μL的SuperScriptIII RT酶至25μL的终体积，并与55℃储存的混合溶液混合，并将混合物在 55℃反应50分钟。然后，将混合物在85℃反应5分钟以灭活RT酶，并 通过向其加入冰终止反应。RPL13A被用作定量标记物基因的对照基因。 使用对照基因的引物进行RT-PCR反应，并校准cDNA浓度以均衡对照基 因RPL13A的表达水平。将每个cDNA稀释20倍后使用2μL的样品进行 PCR反应。使用15μL的2xPCR预混物(premix)(热启动(Hotstart))、 2μL的PRL13A的正向引物、2μL的PRL13A的反向引物和11μL的蒸 馏水进行20个循环、23个循环和25个循环的PCR反应。在此，RT-PCR 反应条件为94℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟。用于RPL13A的正 向引物为5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3'(SEQIDNO:1)，并且反向 引物为5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3'(SEQIDNO:2)。将PCR产物上样 至2％琼脂糖凝胶上，并且于电泳后拍摄凝胶图像。使用TotalLabv1.0 程序(NonlinearDynamix)通过定量所述图像均衡每个样品的浓度，校 准接着定量之后进行PCR。

实施例3-2：使用RT-PCR/实时PCR分析表达水平

使用cDNA的正义和反义引物进行PCR，稀释cDNA以均衡其量。加入 3μL的cDNA、10μL的2x预混物(2xpremix)、2μL的每种引物 (20皮摩尔)和2μL的蒸馏水至20μL终体积的溶液。PCR反应在 94℃进行1分钟、54℃进行30秒和72℃进行1分钟，并且所进行的PCR 循环数针对每种基因而改变。为了检测PCR产物，使用2％琼脂糖凝胶进 行电泳，并且使用图像工具分析结果。使用Qiagen的DNASYBRI试剂(CA, USA)和LightCycler(罗氏(Roche))进行实时RT-PCR。经由熔点曲 线分析检测PCR产物的质量，并使用LightCycler版本3.5软件(罗氏 (Roche))分析基因表达水平。在RT-PCR/实时PCR中所使用的基因特 异性引物序列和反向引物(SEQIDNO:1至16)示于表1中。

结果示于图4和5中。证实相比于基础培养基所述基因在生长培养 基中显著提高或降低。因此，AGPAT9(94.1％，在17个样品中有16个中 提高)、ANXA10(94.1％，在17个样品中有16个中提高)、IGF2BP3(100％， 在17个样品中有17个中提高)、PTGER2(100％，在17个样品中有17 个中提高)(图4A-D)、ITGA11(94.1％，在17个样品中有16个中降 低)、PAWR(94.1％，在17个样品中有16个中降低)和SFRP2(94.1％， 在17个样品中有16个中降低)(图5A-C)基因是能够确定培养于生长 培养基中的具有提高的临床效果的脂肪源性干细胞的标记物，并可以被 进一步用作检测使用改善的培养方法培养的脂肪源性干细胞的质量的精 度的标记物。

【表1】

实施例4：检测依据代的所选基因的蛋白质表达

使用来自供体的脂肪源性干细胞样品(培养于基础培养基和生长培 养基中)，经由Western印迹分析通过定量蛋白质分析实施例3中所鉴 定的基因中的一些的表达水平。

特别地，在用PBS将培养于60mm皿上的细胞洗涤一次后，通过加 入冷的用于蛋白质的缓冲溶液(RIPA细胞裂解缓冲液：50mMTris-Cl(pH 7.5)、150mMNaCl、1％诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40、10％甘油、1mMPMSF、 1mMDTT、20mMNaF、1mMEDTA和蛋白酶抑制剂)制备细胞蛋白质。将 30μg每种所制备的蛋白质样品置于10％或12％的十二烷基磺酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上，根据它们的大小分离所述蛋白质 并固定于PVDF膜上。

将所述蛋白质固定的滤纸分割成合适的大小后，结合每种蛋白质对 应的抗体。关于抗体的信息如下：抗ANXA10(SantaCruz,sc-70009)， 抗IGF2BP3(SantaCruz,sc-100766)，抗PTGER2(abcam,ab16151)， 抗ITGA11(ab107858)，抗PAWR(SigmaA0545)和抗肌动蛋白(Sigma, A5316)。使用ImmobilonTMWestern印迹检测试剂(Millipore)通过 条带检测每种蛋白质的量。

结果显示，经由RT-PCR证实在生长培养基中具有提高的mRNA水平 的ANXA10、IGF2BP3和PTGER2等基因,经观察与mRNA实验结果一致，因 为蛋白质表达水平在基础培养基中低而在生长培养基中高。在生长培养 基中具有随代数增加而降低的mRNA水平的ITGA11和PAWR基因,经观察 与mRNA实验结果一致,因为蛋白质表达水平在基础培养基中高而在生长 培养基中低(图6)。

基于以上说明书，本领域技术人员应当理解的是，其它具体的实施 方案可以被用于实施本发明而不偏离本发明的技术思想或必要特征。在 这方面，上述实施例仅用于说明的目的，并不旨在通过这些实施例限制 本发明。应当理解的是，本发明的保护范围包括由下列权利要求书或其 等价概念衍生的所有修改或修饰形式，而不是上述详细的说明书。

<110>韩国生命工学研究院

安特罗根有限公司

<120>用于检测培养于含有EGF或BFGF的培养基的脂肪源性干细胞的增殖和治疗能力的标记物及其用途

<130>OPA14068

<150>KR10-2013-0067365

<151>2013-06-12

<160>16

<170>KopatentIn2.0

<210>1

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>RPL13A正向引物

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catcgtggctaaacaggtactg22

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>RPL13A反向引物

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gcacgaccttgagggcagc19

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>AGPAT9正向引物

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aatcttgacaacggatggat20

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<213>人工序列

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<223>AGPAT9反向引物

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<213>人工序列

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<223>ANXA10正向引物

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cgagacaaaccagcctattt20

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>ANXA10反向引物

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tggtcagcaggtctatttca20

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IGF2BP3正向引物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>IGF2BP3反向引物

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<213>人工序列

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<223>PTGER2正向引物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>PTGER2反向引物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>ITGA11正向引物

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tgaggtccctaaaagcactc20

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>ITGA11反向引物

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<213>人工序列

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<223>PAWR正向引物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>PAWR反向引物

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tacctgaaacatttgcatcc20

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>SFRP2正向引物

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<213>人工序列

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<223>SFRP2反向引物

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