用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法、所获得的悬浮液

摘要

用于由掺入活性成分的经重密封RBC获得包封有所述活性成分之红细胞的稳定化悬浮液的方法，所述方法包括将所述经重密封RBC在渗量浓度不低于280mOsmol/kg的孵育溶液中孵育30分钟或更长的时间，所述孵育溶液是不包含使RBC膜变性之试剂的溶液，然后从经孵育悬浮液中除去液体介质并将所获得的RBC悬浮置于允许所述悬浮液被注射到患者中的溶液中。特别地，所得悬浮液的特征在于：在2℃至8℃的温度下在悬浮置于保存液中之后72小时时，细胞外血红蛋白水平维持在0.5g/dl或更低，特别是0.2g/dl或更低，和/或溶血率维持在2％或更低，特别是1％或更低。

说明书

本发明涉及用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法。本发 明还涉及用于制备这样的悬浮液的方法、使用这些悬浮液的处理方法以及 包封有活性成分之红细胞的新型稳定悬浮液。

已描述了多种允许将活性成分掺入到红细胞中的方法。在这些方法 中，所谓的裂解-重密封技术(lysis-resealingtechnique)是最普遍的。该 技术包括三种变化形式，它们是低渗透析、低渗预膨胀和低渗稀释，所有 均基于红细胞内部和外部之间的渗透压差异。这些变化形式的共同之处是 以下五个步骤：清洗红细胞残留物并将其在生理缓冲液中离心一次或更多 次，使红细胞与低渗液体介质接触导致红细胞膜中的孔打开，活性成分进 入红细胞，使用高渗缓冲液使孔关闭(重密封)从而将活性成分封闭在红 细胞内，然后将红细胞悬浮置于保存液中。低渗透析法是最有利的并且是 工业发展的主题。EP1773452中所述的方法是目前提供了最佳表现的方 法，并且具有以下优点：其是可重复的并且提高活性成分的包封产率。

由此获得的产品的稳定性是其在人治疗中使用的关键要素。特别地， 当将产品注射到患者中时，产品中包含的细胞外血红蛋白的量必须低于预 定阈值。例如，美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration， FDA)所要求的细胞外血红蛋白的阈值为在用于人注射之终产品中0.2 g/dL或更低。

用现有技术方法获得的产品在其储存期间经历溶血并且在注射之前 经历运输。由于大部分脆性红细胞破裂，此溶血使血红蛋白释放到细胞外 介质中，结果是在注射这些产品时，其已不再满足FDA的要求。

因此，本发明的一个目的是提出一种方法，使用该方法可提高包封有 活性成分的红细胞悬浮液的稳定性。

特别地，本发明的一个目的是提出允许产生红细胞的悬浮液的方法， 所述悬浮液掺入活性成分并且在储存后具有稳定的细胞外血红蛋白水平 或者与FDA或任何其他健康权威机构提供的推荐保持一致。

本发明的另一个目的是提出适用于包封有活性成分之红细胞的任何 悬浮液的所述方法，无论其制备方法，特别是使用裂解-重密封法。

本发明的另一个目的是提出允许产生包封有活性成分之红细胞的悬 浮液的所述方法，所述悬浮液是经稳定化的并且具有高细胞产率。

可如下实现这些及其他目的：除去由包封过程(即重密封后)产生的 悬浮液中的大部分脆性红细胞以获得包含最大可能比例之抗溶血性红细 胞的悬浮液。因此，可将红细胞的悬浮液保存直至将其注射到患者中，其 中悬浮液不会经历显著溶血，使其可在注射时获得具有低细胞外血红蛋白 水平的悬浮液。因此，本发明的方法提供了大部分脆性红细胞、细胞外血 红蛋白和细胞外活性成分的去除。本申请人已成功实现这一点，同时维持 良好的细胞产率，在去除大部分脆性红细胞和保留最大数量红细胞之间找 到良好折衷。本申请人甚至已能够确定出人意料地使包封有活性成分之红 细胞的悬浮液稳定同时提高细胞产率的条件。

“包封”意指活性成分基本上或者完全包含在内部。“基本上”意指 小比例的活性成分可另外被捕获在膜中。

“包封有活性成分”意指红细胞掺入具有活性成分功能的分子或者意 指由红细胞及其掺入的分子形成的组装物具有活性成分功能。

“孵育溶液”意指在进行孵育步骤期间其中含有包封有活性成分的红 细胞的溶液。孵育可在宽血细胞比容范围内，特别是10％至85％血细胞 比容内进行。

“保存液”意指将包封有活性成分的稳定化红细胞以其适合储存的形 式悬浮置于其中直至使用的溶液。保存液优选包含至少一种促进红细胞保 存的试剂，其特别是选自葡萄糖、右旋糖、腺嘌呤和甘露醇。

“脆性红细胞”意指通过掺入操作获得的这样的红细胞，当将悬浮液 储存在2℃至8℃时，其一旦在保存液中呈悬浮状态就可能裂解，特别是 在1小时至72小时后。

“初始血细胞比容”意指在孵育期间，在由于脆性红细胞裂解而引起 细胞损失之前的血细胞比容。

概念“稳定化”基本上通过掺入活性成分之红细胞随时间的稳定性， 特别是根据细胞内血红蛋白的损失或细胞外血红蛋白水平来评估。

“红细胞的稳定化悬浮液”特别地意指这样的悬浮液，在其于人中使 用之前，其细胞外血红蛋白水平维持在0.5g/dL或更低，特别是0.3g/dL 或更低，优选0.2g/dL或更低，这样的使用可发生在产生该批掺入活性成 分之红细胞后1小时至72小时。其特征还可在于：在2℃至8℃的温度下 储存72小时时，溶血率维持在2％或更低，特别是1.5％或更低，优选1％ 或更低。

“红细胞的即用型稳定化悬浮液”意指在允许被注射到患者中的溶液 中的稳定化悬浮液，特别是在保存液中的稳定化悬浮液。其血细胞比容一 般为40％或更高。

“红细胞的残留物”或经包装红细胞意指在使红细胞与液体介质分离 后收集的红细胞浓缩物，其中红细胞此前以悬浮状态存在于所述液体介质 中。分离可通过过滤或离心来进行。离心是此类分离通常使用的方式。残 留物包含一定比例的液体介质。一般来说，残留物的血细胞比容为70％ 至85％。

不管用于掺入或包封活性成分的技术，均可应用所述方法。最特别地， 其可应用于前沿的裂解-重密封技术，特别是使用低渗透析的裂解-重密封 技术，优选地本领域技术人员可参考EP1773452中所述的方法。EP1773 452的内容通过引用并入本文。通过阅读以下说明将理解，本发明的稳定 化方法可应用于包封有活性成分之经重密封红细胞的悬浮液或残留物，或 者可包括在获得经重密封红细胞的悬浮液或残留物之前进行的裂解和重 密封步骤。

因此，本发明的一个目的是用于由掺入活性成分的经重密封红细胞获 得包封有活性成分之红细胞(redbloodcell，RBC)的稳定化悬浮液的方 法。所述方法包括将经重密封红细胞在孵育溶液中孵育，所述孵育溶液的 渗量浓度(osmolality)为不低于280mOsmol/kg，特别是约280mOsmol/kg 至约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg至约330mOsmol/kg。特别 地，孵育进行30分钟或更长的时间，特别是1小时或更长的时间。将孵 育称为后重密封(post-resealing)，即其对经重密封的RBC进行。然后， 从经孵育的悬浮液中除去液体介质并将所获得的RBC悬浮置于允许悬浮 液被注射到患者中的溶液中，优选地允许悬浮液被注射到患者中的保存液 中。

孵育溶液通常是包含至少允许调节渗量浓度的离子的盐水溶液(例 如，基于NaCl、KCl和/或磷酸盐的溶液)。孵育溶液可包含其他成分， 特别是碳水化合物，尤其是糖类，和/或允许调节pH(特别是约6至约8.5， 优选约7至约7.5)的酸性和/或碱性添加剂。孵育溶液不包含任何使RBC 膜变性的试剂，例如桥连或交联化学试剂，例如双(磺基琥珀酰亚胺)辛二 酸酯(BS3)、戊二醛和神经氨酸酶。因此，孵育溶液是惰性孵育溶液或 不使经重密封RBC的膜变得脆弱的溶液。

在一个实施方案中，所述方法包括在孵育之前，通过裂解-重密封将 活性成分包封到RBC中并获得包含活性成分的经重密封RBC。

优选地，在孵育之前对经重密封的RBC进行清洗(至少1个清洗循 环)。

应用所述方法的经重密封RBC可以是RBC在保存液中的悬浮液。 然后，可用孵育溶液稀释保存液以得到数值符合本发明的渗量浓度。或者， 可例如通过离心或过滤使RBC与保存液分离，然后添加孵育溶液。还可 对经重密封的RBC进行清洗(至少1个循环，如下文所述)；清洗循环优 选包括在悬浮置于孵育溶液中之前，将悬浮液稀释，然后分离。应用所述 方法的经重密封RBC还可以是仍然在重密封溶液中的经重密封RBC的 悬浮液。然后，可例如通过离心或过滤使RBC与重密封溶液分离，和/ 或对经重密封RBC进行清洗(至少1个循环，如下文所述)；清洗循环优 选包括在悬浮置于孵育溶液中之前，将悬浮液稀释，然后分离。

因此，所述方法包括将经重密封RBC置于孵育溶液中并进行孵育， 所述孵育溶液的渗量浓度为不低于280mOsmol/kg，特别是约280 mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg至约330 mOsmol/kg。

特别地，本发明的主题是用于获得包封有活性成分之红细胞(RBC) 的稳定化悬浮液的方法，其包括通过裂解-重密封将活性成分包封在RBC 内，获得包含掺入活性成分之经重密封RBC的悬浮液或残留物，对经重 密封的RBC进行清洗(至少1个清洗循环)，然后将其置于孵育溶液中并 进行孵育，所述孵育溶液的渗量浓度为不低于280mOsmol/kg，特别是约 280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg至约330 mOsmol/kg。特别地，孵育进行30分钟或更长的时间，特别是1小时或 更长的时间。然后，除去经孵育悬浮液中的液体介质并将获得的RBC悬 浮置于允许悬浮液被注射到患者中的溶液中，优选允许悬浮液被注射到患 者中的保存液中。所指定的渗量浓度为溶液的渗量浓度，其中在所考虑时 间时RBC以悬浮液或残留物形式存在于所述溶液中。

符合本发明的方法具体包括以下步骤：

(a)将活性成分包封在RBC内，其包括与低渗介质(使RBC膜中的孔打 开)接触，与活性成分(使进入RBC中)接触，特别是使用等渗或高渗 介质(优选高渗介质)使RBC重密封；

(b)获得或制备包含掺入活性成分之RBC的悬浮液或残留物和渗量浓度 不低于280mOsmol/kg、特别是约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg、 优选约290mOsmol/kg至约330mOsmol/kg的溶液；

(c)将步骤(b)中的残留物或悬浮液原样或者在添加孵育溶液之后孵育30 分钟或更长、特别是1小时或更长的时间，所述悬浮溶液的渗量浓度为不 低于280mOsmol/kg，特别是约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优 选约290mOsmol/kg至约330mOsmol/kg；

(d)从在步骤(c)中孵育的悬浮液中除去液体介质；

(e)将在(d)中获得的RBC悬浮置于允许悬浮液被注射到患者中的溶液 中，优选允许悬浮液被注射到患者中的保存液中。

根据第一模式，紧接通过裂解-重密封进行包封之后的步骤(特别是 步骤(b))包括至少1个清洗循环，优选2或3个清洗循环，所述清洗循 环通过将例如在裂解-重密封步骤或步骤(a)后获得的包含经重密封RBC 的残留物的悬浮液在溶液中进行稀释，所述溶液的渗量浓度为不低于280 mOsmol/kg，特别是约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优选约290 mOsmol/kg至约330mOsmol/kg，然后获得RBC的残留物或悬浮液。该 残留物或悬浮液包含掺入活性成分的RBC和渗量浓度为不低于280 mOsmol/kg，特别是约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优选约290 mOsmol/kg至约330mOsmol/kg的溶液。然后，应用以下步骤，例如(c)、 (d)和(e)。

在导致脆性红细胞或其大部分(特别是超过50％、60％、70％、80％ 或90％或更多)裂解的条件下进行紧接裂解-重密封之后的步骤，例如(b) 至(e)。为此，其可根据孵育时间、孵育温度和溶液的渗量浓度来发挥作用， 其中RBC以悬浮状态存在于所述溶液中。渗量浓度越高，孵育时间越短。 渗量浓度越低，获得相同效果的孵育时间越短。类似地，温度越高，孵育 时间越长，反之亦然。然后，一个或更多个清洗循环将允许去除细胞碎片 和细胞外血红蛋白并且去除细胞外活性成分。

根据本发明，清洗循环包括对RBC的悬浮液或残留物进行稀释，然 后使RBC和清洗溶液分离。优选地，清洗步骤优选包括2或3个稀释- 分离循环。分离可使用任何合适的方式(例如过滤和离心)来进行。优选 离心。优选用孵育溶液进行清洗。孵育不受悬浮液的血细胞比容的限制。 因此，可孵育初始血细胞比容一般为10％至85％，特别是40％至80％的 悬浮液。在血细胞比容为70％以及大于70％时，较多使用术语残留物； 在低于该数值时，较多使用术语悬浮液。

去除步骤或步骤(d)的目的是特别地“去除”经孵育悬浮液或残留物 中的液体部分以除去细胞碎片和细胞外血红蛋白，并随之除去细胞外活性 成分。

根据去除步骤或步骤(d)的第一模式，进行分离，特别是离心，这特 别适用于悬浮液。可在该分离之后进行一个或更多个(例如2或3个)清 洗循环，所述清洗循环通过在等渗溶液中进行稀释，之后特别地通过离心 进行分离。

根据去除步骤或步骤(d)的第二模式，在特别地通过离心进行分离之 前进行稀释，这适用于悬浮液或残留物。稀释可特别地用等渗清洗液或保 存液来进行。

在最后一步或步骤(e)，制备最终的悬浮液使得其无需任何其他处理 即可施用于患者。

根据该步骤的第一模式，用注射溶液(特别是保存液)稀释从去除步 骤或步骤(d)获得的RBC的残留物。

根据该步骤的第二模式，用注射液(特别是保存液)对从去除步骤或 步骤(d)获得的RBC的残留物进行一个或更多个清洗循环，所述清洗循环 通过稀释，之后进行分离。在清洗之后，将RBC悬浮置于注射液(特别 是保存液)中。

本发明的方法还可包括以下特征中的一个、几个或全部：

-在约2℃至约39℃的温度下进行孵育步骤或步骤(c)，持续足够长的时间 以确保脆性RBC的裂解；

-在低温下，特别是在约2℃至约10℃，特别是在约2℃至约8℃下进行 孵育步骤或步骤(c)，并持续约1小时至约72小时，特别是约6小时至约 48小时，优选约19小时至约30小时；

-在约20℃至约39℃的较高温度下，特别是在环境温度(25℃±5℃)下 进行孵育步骤或步骤(c)，并持续约30分钟至约10小时，特别是约1小时 至约6小时，优选约2小时至约4小时；可在比环境温度甚至更高的温度 下进行，但这可能对细胞产率、P50和/或2，3-DPG含量具有负面影响；

-在孵育步骤或步骤(c)，悬浮液具有10％至85％，特别是40％至80％的 初始血细胞比容；可孵育通过分离获得的血细胞比容为例如70％至约 85％的残留物，或血细胞比容为约40％至70％的经稀释残留物；

-孵育步骤包括搅拌悬浮液；

-孵育步骤不包括任何搅拌；

-作为用于清洗和/或孵育的溶液，以一定的浓度使用NaCl水溶液来获得 期望的渗量浓度；例如溶液可包含0.9％NaCl；值得注意的是，除了NaCl 或另外的盐来源(例如，KCl、磷酸盐)，该溶液还可包含葡萄糖，特别 是葡萄糖一水合物、磷酸二氢钠二水合物、磷酸氢二钠十二水合物；例如 组成包含：0.9％NaCl、0.2％葡萄糖一水合物、0.034％磷酸二氢钠二水 合物、0.2％磷酸氢二钠十二水合物；

-用保存液进行在最后一步或步骤(e)的清洗；

-在即用型悬浮液或能被注射到患者中的悬浮液中的溶液(液体部分)的 渗量浓度为约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优选为约290 mOsmol/kg至约330mOsmol/kg；

-即用型的悬浮液或能被注射到患者中的悬浮液的血细胞比容为40％或 更高；

-用保存液进行所有的清洗、孵育步骤；

-步骤(b)的清洗溶液和/或步骤(e)的清洗溶液以及保存液具有相同的组成 并包含促进红细胞的保存的一种或更多种化合物；

-保存液(以及当适用于清洗溶液或孵育溶液时)是含有NaCl、腺嘌呤 和选自葡萄糖、右旋糖和甘露醇的至少一种化合物的水溶液；

-保存液(以及当适用于清洗溶液或孵育溶液时)含有NaCl、腺嘌呤和 右旋糖，优选AS3介质；

-保存液(以及当适用于清洗溶液或孵育溶液时)含有NaCl、腺嘌呤、 葡萄糖和甘露醇，优选SAG-甘露醇或ADsol介质。

还可通过用于获得掺入活性成分的RBC的稳定化悬浮液的方法来定 义本发明，特别地包括以下步骤：

(a)将活性成分包封在RBC内，其包括与低渗介质接触(使得RBC膜中 的孔打开)，与活性成分接触(以使其进入RBC)，用等渗介质或高渗介 质重密封RBC并收获含有一组所谓的脆性RBC之RBC的悬浮液或残留 物，即当悬浮液储存在2℃至8℃时，所述脆性RBC一旦在保存液中呈悬 浮状态就有可能被裂解，特别是在1小时至72小时后，

(b-c)在导致脆性RBC或其大部分(特别是大于50％、60、70％、80％ 或90％)裂解的溶液中和条件下，清洗并孵育(a)中获得的RBC，

(d)从在前述步骤中孵育的悬浮液中除去液体介质，

(e)将在(d)中获得的RBC悬浮于允许悬浮液被注射到患者中的溶液中， 优选允许悬浮液被注射到患者中的保存液中。

根据一个特征，步骤(b)包括获得或制备含有掺入活性成分的RBC的 悬浮液或残留物和渗量浓度不低于280mOsmol/kg、特别是约280 mOsmol/kg至约380mOsmol/kg、优选约290mOsmol/kg至约330 mOsmol/kg的溶液。

根据一个特征，步骤(c)包括将步骤(b)的残留物或悬浮液原样或者在 添加的孵育溶液后孵育30分钟或更长时间，特别是1小时或更长时间， 所述孵育溶液的渗量浓度为不低于280mOsmol/kg，特别是约280 mOsmol/kg至约380mOsmol/kg，优选约290mOsmol/kg至约330 mOsmol/kg。

根据一个特征，步骤(d)包括对在(c)中获得的RBC进行清洗以除去细 胞碎片和细胞外血红蛋白，特别是进行2或3个清洗循环。

该方法可再现本文中所描述的两个实施方案及其多种形式和特点。

本发明的方法特别地包括以下步骤：

(a)将活性成分包封在RBC内，其包括与低渗介质接触以使RBC的膜中 的孔打开，与活性成分接触以使其进入RBC，使用等渗介质或高渗介质 重密封RBC。应注意的是，活性成分可存在于RBC裂解前的其悬浮液中， 或可在裂解过程中或裂解后添加，但总是在重密封前。

在这个步骤(a)的一个实施方案中，所述方法包括以下子步骤：

(a1)提供不低于60％或65％血细胞比容的红细胞的悬浮液，

(a2)测量该悬浮液中RBC的渗透脆性，

(a3)用于裂解和活性成分内在化的操作，其包括以下：使RBC的悬浮液 在透析设备(特别是透析管)中以与裂解溶液逆向流动，调节RBC的悬 浮液的流速或调节裂解溶液的流速，或调节裂解溶液的渗量浓度(作为在 (a2)中测量的渗透脆性的函数)，

(a4)用于重密封RBC的操作。

在本实施方案中，步骤(a1)包括清洗/离心细胞残留物，并在生理缓冲 液中以不低于60％或65％的血细胞比容悬浮经清洗的RBC。

在整个步骤(a1)和(a3)中优选维持2℃至8℃的温度且优选地使用的产 品的温度为2℃至8℃。

优选地，使用高渗溶液进行RBC的重密封过程，且优选在30℃至 40℃，特别是在约37℃的温度下进行。

重密封后，使用分离操作(优选离心)将RBC从重密封的介质中分 离出来。离心后，收集在离心管或容器中的RBC的残留物。根据本发明 的一个有利特性，收集物可能含有RBC的所有或基本上所有的级分以便 在随后除去了脆性细胞后提高最终细胞的产率。

在一个实施方案中，活性成分是L-天冬酰胺酶。另一些实施方案包 括掺入(优选包封)选自以下的活性成分：IHP、ADI、因子VIII、因子 IX、阿葡糖苷酶(alglucosidase)、β-葡糖苷酶、二膦酸盐类 (bisphosphonate)(特别是第二代和第三代)、尿酸酶、胸苷磷酸化酶、 腺苷脱亚胺酶等。

在步骤(a)和(b)之间或步骤(c)或(d)之后，RBC可进行另外的处理来修 饰RBC的表面或通过表面接枝或偶联来修饰其性能从而赋予其功能性。 根据一种特定的形式，这种处理是在孵育后进行，尤其是孵育步骤后或孵 育之后的清洗后。处理可以是下列之一：

-使用修饰RBC的表面的试剂进行化学处理，所述试剂特别是桥连剂或 交联剂，例如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、戊二醛和神经氨酸 酶(变性剂)；

-例如在下列条件下进行热处理：在温度约42℃至约55℃，优选约47℃ 至约51℃，将RBC加热约15分钟至约90分钟，优选约25分钟至约50 分钟；

-形成具有抗体(优选IgG亚型)的免疫复合物；例如抗恒河猴抗体 (anti-Rhesusantibody)，抗血型糖蛋白A(glycophorineA)抗体和抗 CR1抗体(CR1＝1型补体受体)。

本发明的另一个主题是应用RBC的悬浮液的孵育步骤，其特别是包 封活性成分，随后除去孵育介质，优选地通过清洗除去孵育介质以便稳定 RBC或RBC的悬浮液。优选地这种应用还包括将RBC悬浮置于在保存 液中的另外的步骤。上面提到的多种更精确的特征都适用于本发明的这一 主题。

具体地，根据一个特征，该孵育步骤包括孵育含有掺入活性成分的经 重密封RBC的悬浮液或残留物和渗量浓度不低于280mOsmol/kg、特别 是约280mOsmol/kg至约380mOsmol/kg、优选约290mOsmol/kg至约 330mOsmol/kg的溶液30分钟或更长时间，特别是1小时或更长时间， 所述溶液的。

更具体地，根据本发明，这种孵育可包括一个或更多个下列特性：

-在约2℃至约39℃的温度下进行孵育步骤，持续足够长的时间以确保脆 性RBC的裂解；

-在低温下，特别是在约2℃至约10℃，更特别是在约2℃至约8℃下进 行孵育步骤，并持续约1小时至约72小时，特别是约6小时至约48小时， 优选约19小时至约30小时的时间；

-在约20℃至约39℃的较高温度下，特别是在环境温度(25℃±5℃)下 进行孵育步骤，并持续约30分钟至约10小时，特别是约1小时至约6 小时，优选约2小时至约4小时；可在甚至比环境温度更高的温度下进行， 但这可能对细胞产率、P50和/或2，3-DPG含量具有负面影响；

-在孵育步骤中，悬浮液具有10％至85％，特别是40％至80％的初始血 细胞比容；可孵育具有70％至约85％血细胞比容的来自分离过程的残留 物，例如，或具有约40％至70％血细胞比容的经稀释残留物；

-孵育步骤包括搅拌悬浮液；

-孵育步骤不包括任何搅拌。

本发明的另一个主题是通过实施本发明的方法能够获得的包封有活 性成分的RBC的稳定化悬浮液。

特别地，在保存液中的悬浮液的特征在于：在2℃至8℃的温度下储 存72小时时，细胞外血红蛋白水平维持在0.5g/dl或更低，特别是0.3g/dl 或更低，更特别是0.2g/dl或更低，优选0.15g/dl或更低，更优选是0.1g/dl 或更低。

特别地，在保存液中的悬浮液的特征在于：在2℃至8℃的温度下储 存24小时至20天、特别是24小时至72小时的时间内，细胞外血红蛋白 水平维持在0.5g/dl或更低，特别是0.3g/dl或更低，更特别是0.2g/dl或 更低，优选0.15g/dl或更低，更优选0.1g/dl或更低。

使用由G.B.Blakney和A.J.Dinwoodie在Clin.Biochem.8，96-102， 1975中描述的参考手册的方法有利地测量细胞外血红蛋白水平。也存在 进行这种测量的自动装置，各自具有其特定的灵敏度。然而在本发明的方 法的实施例中仍使用三种不同的方法，有可能得到一致性的水平或者这三 种方法可用于该对照。

特别地，在保存液中的悬浮液的特征在于：在2℃至8℃的温度下储 存72小时时，溶血率维持在2％或更低，特别是1.5％或更低，优选1％ 或更低。

特别地，在保存液中的悬浮液的特征在于：在2℃至8℃的温度下储 存24小时至20天、特别是24小时至72小时的时间内，溶血率维持在 2％或更低，特别是1.5％或更低，优选1％或更低。

特别地，悬浮液的血细胞比容为40％或更高。

在一个实施方案中，活性成分是L-天冬酰胺酶。另一些实施方案包 括掺入(优选地包封)选自以下的活性成分：IHP、ADI、因子VIII、因 子IX、阿葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、二膦酸盐类(特别是第二代和第三代)、 尿酸酶、胸苷磷酸化酶、腺苷脱亚胺酶等。

有利地，在保存液中的悬浮液是即用型的，同时具有低的细胞外血红 蛋白水平，与FDA推荐特别地一致。

本发明的另一个主题是通过注射包封有活性成分之RBC的悬浮液的 治疗性处理方法。

在该方法的第一个实施方案中，向患者注射在注射前1小时至72小 时，特别是10小时至72小时制备的包封有活性成分之RBC的悬浮液。 该悬浮液的血细胞比容为40％或更高。悬浮液包含在保存液中。细胞外 血红蛋白水平是0.5g/dl或更低，特别是0.3g/dl或更低，更特别是0.2g/dl 或更低，优选0.15g/dl或更低，更优选0.1g/dl或更低和/或溶血率为2％ 或更低，特别是1.5％或更低，优选1％或更低。在注射前悬浮液不进行 清洗或类似操作。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：提供细胞残留物，将其 以60％或65％或更高血细胞比容悬浮置于生理缓冲液中，使用裂解和重 密封操作将活性成分包封在这些RBC中，孵育所获得的RBC，清洗后者 并收集最终的RBC悬浮液。悬浮液的血细胞比容为40％或更高。悬浮液 包含在保存液中。该悬浮液储存在2℃至8℃的温度下。在制备悬浮液后 1小时至72小时、优选24小时至72小时之间将该最终悬浮液注射到患 者中。该悬浮液的细胞外血红蛋白水平为0.5g/dl或更低，特别是0.3g/dl 或更低，更特别是0.2g/dl或更低，优选0.15g/dl或更低，更优选0.1g/dl 或更低和/或其溶血率为2％或更低，特别是1.5％或更低，优选1％或更 低。在注射前悬浮液不进行清洗或类似操作。

该方法特别地包括以下步骤：

(a1)以60％或65％或更高的血细胞比容提供RBC的悬浮液，

(a2)测量在该悬浮液中RBC的渗透脆性，

(a3)裂解和活性成分内在化的操作，其包括在透析管中使RBC的悬浮液 以与裂解溶液逆向流动，调节RBC的悬浮液的流速或调节裂解溶液的流 速，或调节裂解溶液的渗量浓度(作为在(a2)中测量的渗透脆性的函数)，

(a4)RBC的重密封操作，

(b)任选地通过至少一次清洗循环在溶液中稀释在(a4)中得到的悬浮液 或残留物，收集在清洗溶液中的RBC残留物或悬浮液，

(c)将(a4)或(b)的残留物或悬浮液原样孵育或在添加孵育溶液后孵育，

(d)从在步骤(c)中孵育的悬浮液中除去液体介质，

(e)将在(d)中获得的RBC悬浮置于允许悬浮液被注射到患者中的溶液中， 特别是保存液中。

在该方法的一个实施方案中，RBC包封有L-天冬酰胺酶。该活性成 分还可以是上述的另一些活性成分之一，但不限于此。

现在将借助作为非限制性实施例的一些实施方案并参照附图更加详 细地描述本发明，其中唯一附图示出了在EP1773452中描述的方法和本 发明的方法，并给出了其各自在72小时的时间内细胞外血红蛋白方面获 得的结果。

实施例1：在环境温度下在NaCl+葡萄糖中在可变时间段内孵育红细胞

在存在或不存在活性成分(L-天冬酰胺酶)的情况下，按照在专利 EP1773452中描述的方法处理人RBC的残留物直到完成重密封，并收 集血液袋中的RBC的悬浮液。将RBC的小袋转移至清洗器上(Cobe 2991)。用0.9％NaCl和0.2％葡萄糖预稀释悬浮液，然后转移到离心袋中。 将悬浮液以3000rpm离心2分钟。然后将上清液以设定为350ml/分钟的 上清液流量导向废物袋。稀释/离心分离操作重复两次以上以终止该清洗 循环。将含有80％血细胞比容的RBC的离心小袋置于清洗器中，在环境 温度(24±5℃)下保持30分钟、1小时或3小时。孵育后，进行另一次 清洗循环。然后用100ml的AS-3(CaridianBCT)保存液替换悬浮液中 的RBC并储存在5±3℃下。通过在制造当天(D0)、然后是24小时后(D1) 以及48小时后(D2)等测量细胞外血红蛋白来确定产品的稳定性。使用 两种方法进行这种测量：用自动分析器(CellDynRuby：在以下条件下 测量：555nm，血红蛋白线性度0.0-25.0g/dl±0.3，变异系数＜2.0％-使用 背景噪声函数来测量痕量的血红蛋白，灵敏度提高至±0.2g/dl；或Excell 2280自动分析器：在以下条件下测量：540nm，血红蛋白线性度1.5-30.0 g/dl±0.1，变异系数1％)或按照G.B.Blakney和A.J.Dinwoodie在Clin. Biochem.8，96-102，1975(其通过引用并入本文)中描述的参考手册方法 通过可见分光光度法在577nm进行测量。在实施例中，按照生产商的推 荐使用自动分析器。结果如下所示。

1.1使用Ruby分析器对4种包封有L-天冬酰胺酶的RBC的悬浮液进行 细胞外血红蛋白(以g/dl计)的测量：

1.2通过分光光度法对包封有(ERY-ASP-121217-CG)L-天冬酰胺酶或未 包封(ERY-121210-MA和ERY-121217-QB)L-天冬酰胺酶的RBC的3 种悬浮液的细胞外血红蛋白(以g/dl计)的测量：

1.3使用Excel2280分析器对RBC的2种悬浮液(第一种包封有L-天冬 酰胺酶，第二种没有活性成分)的细胞外血红蛋白(以g/dl计)的测量：

包含在NaCl+葡萄糖中RBC的孵育步骤(时间在30分钟至3小时 内变动)的方法使得在产品制造后在D3(72小时)，甚至长达D8(即8 天)时获得具有低于0.2g/dl细胞外血红蛋白水平的稳定产品。使用3种 不同的方法通过测量细胞外血红蛋白来确认这些结果。

实施例2：在环境温度下在孵育过程中细胞外血红蛋白水平的变化。

按照实施例1处理人RBC的残留物，其不含有任何活性成分。在环 境温度下孵育过程中取出等分试样，在4℃下以1000g离心10分钟。收 集上清液，并通过可见分光光度法在577nm确定血红蛋白水平。结果如 下所示：

结果表明，在环境温度下在NaCl+葡萄糖中3小时的孵育时间内RBC 的溶血是恒定的。因此，该孵育步骤对除去大多数脆性RBC作出了显著 贡献，因此它对于为了获得稳定的最终产品的方法是不可缺少的。然而， 如实施例1中所示，孵育时间仍可缩短至30分钟。但是，孵育步骤过程 中的脆性非溶血的RBC在此步骤过程中会变弱并在最后一次清洗过程中 破裂。

实施例3：在5±3℃下在保存液(AS-3或SAG-甘露醇)中将RBC孵育24小时

按照在专利EP1773452中描述的方法处理RBC残留物，直到完成 重密封并且掺入L-天冬酰胺酶。将RBC的小袋转移到清洗器上(Cobe 2991)。用0.9％NaCl和0.2％葡萄糖预稀释悬浮液，然后转移到离心袋中。 将悬浮液以3000rpm离心2分钟。然后将上清液以设定为350ml/分钟的 上清液流量导向废物袋。稀释/离心分离操作再重复两次以终止该清洗循 环。然后用100ml的AS-3或80ml的SAG-甘露醇保存液替换80％血细 胞比容的在悬浮液中的RBC的上清液。然后将～50％血细胞比容的RBC 的小袋在5±3℃下储存24小时，然后清洗，之后在100ml的AS-3保存 液(CaridianBCT)中再悬浮。最终产品储存于2℃至8℃。通过在制造 当天(D0)、然后是24小时后(D1)以及48小时后(D2)等测量细胞 外血红蛋白来确定产品的稳定性。使用可见分光光度法在577nm进行测 量。结果如下所示：

在AS-3或SAG-甘露醇中孵育RBC导致类似的结果。在至少48小 时内产品显示出非常好的稳定性，具有低于0.2g/dl的细胞外血红蛋白水 平，并且可预期在D7时如批次ERY-ASP-121211-CG-01所示的类似结果。

实施例4：细胞产率的改进

如实施例1中所示的要求保护的方法导致产品的改善的稳定性。然 而，这对本方法的细胞产率产生负面影响(～55％相对于在EP1773452 中描述的方法的65％)。为了获得更好的细胞产率，同时保持良好的产品 稳定性，修改了所要求保护的方法的2个循环中的一个清洗参数。简言之， 在实施例1的条件下生产批次，不同之处在于在细胞悬浮液的离心过程 中，上清液的流量设定为100ml/分钟而不是350ml/分钟。这使得RBC 检测器对上清液和RBC之间的界限进行更快的检测。降低了送到废物袋 的RBC的量并提高了该方法的细胞产率。实施例4中描述的方法的平均 产率为73％，相对于实施例1中方法的54％。产品的稳定性基本上相同。

通过Excell2280分光光度法测量细胞外血红蛋白(g/dl)且细胞产率 以％计：

实施例5：在优化生产方法后细胞外血红蛋白水平的降低

唯一的附图比较了在根据专利EP1773452中描述的方法与在实施 例1中的方法生产的产品中细胞外血红蛋白的水平。在72小时的储存时 间后，细胞外血红蛋白显著降低，原因是在优化后细胞外血红蛋白从EP1 773452中方法的1.5g/dl降至低于0.2g/dl的值，即血红蛋白水平降低超 过7倍。