一种干扰POH1表达的基因及其在抑制肝癌细胞生长中的应用

摘要

本发明公开一种干扰POH1表达的基因在抑制肝癌细胞生长中的应用，所述干扰POH1表达的基因为POH1特异性的siRNA序列；所述POH1特异性的siRNA序列为POH1？siRNA-1:GGTCTTAGGACATGAACCA或POH1？siRNA-2:？GTGATTGATGTGTTTGCTA。该干扰POH1表达的基因可在体内试验和体外实验中抑制肝癌细胞的生长，特别是对抑制肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1的生长。

说明书

技术领域

本发明涉及一种干扰POH1表达的基因及其在抑制肝癌细胞生长中的应用。

背景技术

肝癌是世界范围内的常见恶性肿瘤之一。其特点是术后复发率高，化疗敏 感性差。因此，肝癌具有较高的致死率。随着分子肿瘤学的发展和进步，人们 不断对肝癌的癌基因谱有着新的认识并从中寻找肝癌基因治疗的靶分子。

POH1(也称为PSMD14，RPN11)是蛋白酶体19S调节亚基的成分之一，是一 个具有去泛素化酶活性的蛋白。其在真核细胞生物中高度保守并参与多种生物 学过程。有研究显示，在酵母细胞中与蛋白酶体19S亚基结合的几种去泛素酶 中，只有POH1是必须的。该基因的功能缺失突变会导致酵母细胞周期阻滞、生 长抑制并影响线粒体形态。另外，在果蝇(Drosophilamelanogaster)中敲降 POH1会导致幼虫死亡；同时，POH1也是小鼠胚胎肝细胞维持多向分化潜能所必 须的基因；在人类细胞中，POH1被报道参与DNA的双链断裂修复(DSB)过程。 POH1在肿瘤细胞中能够调控蛋白酶体的活性。还能够通过其去泛素化酶活性稳 定一些转录因子或受体蛋白(如c-Jun、Mitf和ERBB2等)参与细胞信号通路 传递。

POH1具有保守的JAMM/MPN结构域，与Zn²⁺结合后该活性中心发挥金属蛋白 酶的活性。根据多项研究的报道，在POH1的JAMM结构域中，HXH基序是其活性 所必须的。与其他的金属蛋白酶相比，在POH1的JAMM结构域中还具有与半胱 氨酸蛋白酶家族成员相似的半胱氨酸盒(Cys-box)基序。该基序的功能缺失性 突变虽然在酵母中并未引起显著的表型改变，但是在人类细胞中，该基序是POH1 稳定转录因子c-Jun和Mitf的关键因素。这提示我们POH1似乎还具有与半胱 氨酸蛋白酶相似而区别于其他金属蛋白酶的功能。

我们发现POH1在一部分肝癌组织中异常高表达，且干扰POH1的表达具有 抑制肝癌细胞生长的作用。为肝癌的基因治疗提供了一个分子靶标。

参考文献

发明内容

本发明的目的是为了解决上述的肝癌基因治疗等技术问题而提供一种干扰 POH1表达的基因在抑制肝癌细胞生长中的应用。

本发明的技术方案

一种干扰POH1表达的基因在抑制肝癌细胞生长中的应用，所述的肝癌细胞 为SK-Hep1、SMMC-7721或PLC/PRF/5，具体步骤如下：

首先，在肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721或SK-Hep1中分别转染干扰POH1 表达的基因，所述的干扰POH1表达的基因为POH1特异性的siRNA序列，所述 的POH1特异性的siRNA序列为POH1siRNA-1:GGTCTTAGGACATGAACCA或POH1 siRNA-2:GTGATTGATGTGTTTGCTA，转染的具体步骤如下：

转染前一天将10⁵个PLC/PRF/5、SMMC-7721或SK-Hep1肝癌细胞种于孔板 中，转染时，先将细胞培养基换成无血清的DMEM培养液；

然后将20μMsiRNA与转染试剂(所述的转染试剂为lipofectamine2000 Reagent,Invitrogen)分别用Opti-MEM培养基按体积比1:50稀释，5分钟后 将siRNA和转染试剂的稀释液按体积比为1：1进行混合，得到混合液，20分钟 后在所得的混合液中加入上述的无血清DMEM培养液中，得到含siRNA和转染试 剂的细胞培养液；

6小时后将含siRNA和转染试剂的细胞培养液更换为含10％胎牛血清的DMEM 培养基，然后在37℃含5％CO2的培养条件下进行培养48-96h，即得含有干扰 POH1表达的基因的肝癌细胞。

上述的干扰POH1表达的基因还可以用能够抑制POH1表达或抑制该蛋白活 性的靶向小分子化合物或生物大分子进行替代。本发明的实施例中仅以干扰 POH1表达的基因，即特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1:GGTCTTAGGA CATGAACCA；POH1siRNA-2:GTGATTGATGTGTTTGCTA)为例进行了说明，但并不限 制其他抑制POH1表达或抑制POH1活性的靶向小分子化合物或生物大分子在抑 制肝癌细胞生长中的应用。

本发明的有益效果

本发明的一种干扰POH1表达的基因，由于肝癌细胞的增殖和存活对POH1 基因有一定的依赖性，因此转染了POH1siRNA-1和POH1siRNA-2序列的肝癌 细胞SK-Hep1、SMMC-7721或PLC/PRF/5可以使其生长得到有效的抑制。并且转 染了POH1siRNA-1序列的肝癌细胞SK-Hep1、SMMC-7721和PLC/PRF/5，较没有 转染POH1siRNA-1序列的肝癌细胞SK-Hep1、SMMC-7721和PLC/PRF/5，其第6 天的抑制率分别为50.5％、73.9％和65.0％。

附图说明

图1、转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1siRNA-2)的肝癌 细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1中的POH1蛋白含量情况，图中的 Parental表示细胞中不转染任何siRNA，ControlsiRNA表示细胞中转染对 照siRNA(对照siRNA序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT)，POH1siRNA-1细胞 中转染了POH1siRNA-1，POH1siRNA-2表示细胞中转染了POH1siRNA-2；

图2、转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1siRNA-2)的肝癌 细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1的生长曲线，图中的Parental 表示细胞中不转染任何siRNA，ControlsiRNA表示细胞中转染对照siRNA (对照siRNA序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT)，POH1siRNA-1细胞中转 染了POH1siRNA-1，POH1siRNA-2表示细胞中转染了POH1siRNA-2；

图3-1、转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1siRNA-2)的肝 癌细胞PLC/PRF/5的细胞凋亡情况，图中的Parental表示细胞中不转染任 何siRNA，ControlsiRNA表示细胞中转染对照siRNA(对照siRNA序列为： TTCTCCGAACGTGTCACGT)，POH1siRNA-1细胞中转染了POH1siRNA-1，POH1 siRNA-2表示细胞中转染了POH1siRNA-2；

图3-2、转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1siRNA-2)的肝 癌细胞SMMC-7721的细胞凋亡情况，图中的Parental表示细胞中不转染任 何siRNA，ControlsiRNA表示细胞中转染对照siRNA(对照siRNA序列为： TTCTCCGAACGTGTCACGT)，POH1siRNA-1细胞中转染了POH1siRNA-1，POH1 siRNA-2表示细胞中转染了POH1siRNA-2；

图3-3、转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1siRNA-2)的肝 癌细胞SK-Hep1的细胞凋亡情况，图中的Parental表示细胞中不转染任何 siRNA，ControlsiRNA表示细胞中转染对照siRNA(对照siRNA序列为： TTCTCCGAACGTGTCACGT)，POH1siRNA-1细胞中转染了POH1siRNA-1，POH1 siRNA-2表示细胞中转染了POH1siRNA-2；

图4、转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1siRNA-2)的肝癌 细胞PLC/PRF/5和SMMC-7721的细胞周期情况，图中的Parental表示细胞 中不转染任何siRNA，ControlsiRNA表示细胞中转染对照siRNA(对照siRNA 序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT)，POH1siRNA-1细胞中转染了POH1siRNA-1， POH1siRNA-2表示细胞中转染了POH1siRNA-2；

图5、POH1-shRNA抑制POH1蛋白表达，干扰ptripz空载体和ptripz-sh-POH1 的SK-Hep1分别被doxycycline诱导后通过Westernblot检测所得的shRNA 抑制POH1蛋白表达的情况，图中的Vector表示细胞中转染了ptripz空载 体，sh-POH1表示细胞转染了ptripz-sh-POH1，control表示细胞没用 doxycycline诱导，Tet-On表示细胞被doxycycline诱导；

图6-1、干扰POH1表达抑制细胞裸鼠致瘤能力，干扰ptripz空载体和 ptripz-sh-POH1的SK-Hep1分别注射到裸鼠皮下，并通过doxycycline诱 导POH1shRNA表达，自第15天形成明显的肿瘤起，每5天测量肿瘤体积 大小，所得的不同组的肿瘤生长曲线图，图中的Vector表示细胞中转染了 ptripz空载体，sh-POH1表示细胞转染了ptripz-sh-POH1，control表示 细胞没用doxycycline诱导，Tet-On表示细胞被doxycycline诱导；

图6-2、干扰POH1表达抑制细胞裸鼠致瘤能力，干扰ptripz空载体和 ptripz-sh-POH1的SK-Hep1分别注射到裸鼠皮下，并通过doxycycline诱 导POH1shRNA表达，自第15天形成明显的肿瘤起，40天后处死裸鼠取出 肿瘤称重的情况，图中的Vector表示细胞中转染了ptripz空载体，sh-POH1 表示细胞转染了ptripz-sh-POH1，control表示细胞没用doxycycline诱 导，Tet-On表示细胞被doxycycline诱导。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明的实施例中所用的：

细胞系SK-Hep1和PLC/PRF/5来自ATCC细胞库，SMMC-7721来自上海生命 科学院细胞库；

所有SK-Hep1、PLC/PRF/5和SMMC-7721细胞培养所使用的培养基，按质量 百分比计算，均为90％的DMEM和10％的胎牛血清，培养条件均为37℃，在含体 积百分比浓度为5％的CO₂的培养箱中培养。

转染试剂，Invitrogen公司的2000转染试剂，根据说 明书进行操作。

siRNA(POH1siRNA-1:GGTCTTAGGACATGAACCA；POH1siRNA-2:GTGATTGATG TGTTTGCTA)委托合成自上海吉玛公司。

POH1shRNA(CTCAGTCTCAGTTGTGCAATTATAGTGAAGCCACAGATGTATAATTGCAC AACTGAGACTGAA)由invitrogen公司合成。

MTT法测量细胞生长曲线

将待测细胞消化后制成单细胞悬液并计数，接种于96孔培养板中，每孔1000 个细胞，不同处理组细胞不同时间点做三个复孔。24h后，各组细胞中将三个孔 内加入5mg/mLMTT溶液20μL，继续培养3h，随后去除孔中的培养液，各孔加 150μLDMSO溶液，振荡5min，于酶标仪波长540nm处测定吸光度(OD)值。

细胞凋亡及周期的检测

待测细胞通过胰酶消化收集后进行Annexin-V和7-AAD的双染色，通过流式 细胞仪分析确定Annexin-V阳性细胞的比例即为凋亡细胞比例；

检测细胞周期时，待测细胞通过胰酶消化收集并用75％乙醇固定，PBS洗细 胞后加入100g/mlRNaseA和50g/ml碘化丙啶(PI)染色。再通过流式细胞仪分 析确定细胞周期的分布。

Westernblot检测

待测细胞通过包含蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics)和磷酸酶 抑制剂(RocheDiagnostics)的RIPA裂解液(ThermoFisherScientific) 裂解，总蛋白浓度通过BCA蛋白定量试剂盒(ThermoFisherScientific)定 量。

总蛋白通过SDS/PAGE分离后电转至NC膜上，再通过一抗和HRP标记的二 抗进行杂交并通过SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstrate试 剂盒(ThermoFisherScientific)显色。本实验所实验的一抗及稀释比例： POH1(Proteintech,12059-1-AP,1:1000)；GAPDH(SantaCruz,1:1000)。

裸鼠致瘤实验

本实验BALB/c雄性裸鼠，6-8周龄，体重20g左右，购于上海斯莱克实验 动物有限责任公司，饲养于华东师范大学动物房。

小鼠置于恒温(25-27℃)，恒湿(45-50％)，SPF级环境，均按照实验动物护 理和使用指南(NationalResearchCouncilGuideforCareandUseof LaboratoryAnimals)进行饲养。

本发明的所有的实验方案和操作程序均符合IACUC(InstitutionalAnimal CareandUseCommittee)规范。

裸鼠的右侧皮下注射感染ptripz-sh-POH及空载体的SK-Hep1细胞 (5x10⁶/0.2mL1×PBS)，每组12只，每组裸鼠再分为两组，分别给予正常饮用 水和含有doxycycline(Sigma,2mg/ml)的饮用水。没5天测量遗传肿瘤大小， 40天后处死小鼠取出肿瘤拍照。

本发明的所用的主要试剂的名称、生产厂家信息如下：

本发明的所用的主要仪器如下表：

所用的肿瘤消化液：胶原酶I0.05mg/ml，胶原酶IV0.05mg/ml，水解酶 0.025mg/ml，DNaseI0.01mg/ml，5％胎牛血清，用1640配制。

本发明所用的Westernblotting检测方法，具体操作步骤如下，但不仅限 于此：

将培养有细胞的培养皿置于冰上，吸走细胞培养液，加入2-3ml4℃预冷 的PBS，重复清洗2次，随后加入1ml的PBS，用干净的细胞刮将细胞刮于培养 皿的一侧，然后用移液枪将细胞悬液移至1.5ml离心管中，300×g4℃离心5min， 弃上清液。每管加一定量的RIPA蛋白裂解液(含一定量的PMSF、Complete蛋 白酶抑制剂和PhosSTOP磷酸酶抑制剂)。冰中放置裂解60min。12,000×g4℃ 离心30min，将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中，取2μl用于蛋白浓度 测定。取20-50μg按比例加入5×SDS-PAGE上样缓冲液并已变性的待测蛋白样 品，加入已制备好的PAGE胶(5％浓缩胶和10％分离胶)，进行电泳：浓缩胶70V， 分离胶140V，直至溴酚蓝迁移至底部，停止电泳。用湿转法将SDS-PAGE中的蛋 白转移至NC膜上，于4℃、100V转膜1～2h。转膜结束后，5％脱脂奶粉(PBS配 制)中，于脱色摇床上室温封闭1h。然后用一抗稀释液稀释的特异性抗体，与 膜共孵育，于室温孵育2-3h或是4℃过夜。随后用TBST洗膜三次，每次5min； 加入用含5％BSA的TBST稀释的相应二抗(1：5000)，与膜室温共孵育1-2h。最 后ECL显色(ECL显色试剂盒)，然后，通过ChemiDoc^TMXRS成像系统分析电泳 后所得的特异性条带，从而获得相应的蛋白表达图谱。

数据统计

不同实验组之间的差异由Student’st检验分析，由Graphpad5.0软件 进行统计和作图。P值<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1

干扰POH1表达的基因在肝癌细胞生长中的表达，具体步骤如下：

在肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1中分别转染POH1特异性的 siRNA序列(POH1siRNA-1:GGTCTTAGGACATGAACCA；POH1siRNA-2: GTGATTGATGTGTTTGCTA)，该两段基因单一转染到一个细胞中，具体步骤如下：

转染前一天将10⁵个肝癌细胞(PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1)种于孔 板，转染时，先将细胞培养基换成无血清的DMEM培养基，即得细胞培养液；

将20μMsiRNA与转染试剂(所述的转染试剂为lipofectamine2000 Reagent,Invitrogen)分别用Opti-MEM培养基稀释；

上述稀释所用的Opti-MEM培养基的量，按20μMsiRNA：Opti-MEM培养 基的体积比为1：50的比例计算，转染试剂：Opti-MEM培养基的体积比为1： 50的比例计算；

5分钟后将siRNA的稀释液和转染试剂的稀释液按体积比为1：1进行混合， 得到混合液，20分钟后在所得的混合液中加入上述所得的细胞培养液，得到含 siRNA和转染试剂的细胞培养液；

6小时后将含siRNA和转染试剂的细胞培养液中的细胞培养基更换为含10％ 胎牛血清的DMEM培养基，然后在37℃含5％CO2的培养条件下进行培养96h， 在培养至96h时后，分别收获转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1 和POH1siRNA-2)的肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1。

验证POH1的特异性siRNA抑制POH1蛋白的表达，从而抑制肝癌细胞 PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1的生长，步骤如下：

首先将上述所得的转染了POH1特异性的siRNA序列(POH1siRNA-1和POH1 siRNA-2)的PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1细胞用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂 的RIPA裂解液在冰浴条件下进行裂解，裂解的具体过程如下：

将细胞用细胞刷从培养皿中刮下后1000rpm离心10min收集细胞，并用PBS 洗细胞一次，去上清后在细胞中加入适量含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂 解液，冰浴裂解30-60min后，13000rpm离心15min，取上清液为细胞总蛋白溶 液，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称为GAPDH)作为对照，通过Westernblot 方法检测转染了POH1特异性的siRNA序列的肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721 和SK-Hep1中的POH1蛋白含量，结果如图1所示，从图1中可以看出POH1siRNA-1 和POH1siRNA-2可以抑制肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1中的POH1 蛋白的表达。

按MTT法测量转染了POH1siRNA-1和POH1siRNA-2之后的肝癌细胞 PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1的生长曲线，结果如图2所示，从图2中可 以看出转染了POH1siRNA-1和POH1siRNA-2的细胞生长受到抑制；转染了POH1 siRNA-1序列的肝癌细胞SK-Hep1、SMMC-7721和PLC/PRF/5，较没有转染POH1 siRNA-1序列的肝癌细胞SK-Hep1、SMMC-7721和PLC/PRF/5，其第6天的抑制 率分别为50.5％、73.9％和65.0％。

干扰POH1基因的表达引起肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1的 细胞周期阻滞和细胞凋亡的实验，步骤如下：

采用Annexin-V/7-AAD双染色方法检测转染了POH1siRNA-1和POH1 siRNA-2序列的肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1的凋亡情况，步骤 如下：

待测细胞用胰酶消化使肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1细胞悬 浮，1000rpm离心10min收集细胞，用Bindingbuffer洗细胞一次后，用 Annexin-V和7-AAD染色30min,后用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。所得的结 果如图3-1、3-2、3-3所示，从图3-1、3-2、3-3对比可以看出，在肝癌细胞 PLC/PRF/5和SMMC-7721中敲降POH1表达后能够促进细胞凋亡；

通过PI染色的方法检测转染了POH1siRNA-1和POH1siRNA-2序列的肝癌 细胞PLC/PRF/5和SMMC-7721的细胞周期，结果如图4所示，从图4中可以看 出，敲降POH1表达后引起PLC/PRF/5和SMMC-7721细胞周期的阻滞，S期减少。

动物细胞体内实验，进行验证抑制POH1基因的表达从而抑制肝癌细胞 PLC/PRF/5、SMMC-7721和SK-Hep1生长，步骤如下：

首先，利用带有四环素诱导表达原件的ptripz表达载体构建可诱导表达 POH1的shRNA(序列： CTCAGTCTCAGTTGTGCAATTATAGTGAAGCCACAGATGTATAATTGCACAACTGAGACTGAA引物 序列)的肝癌细胞SK-Hep1，步骤如下：

首先，将合成的shRNA表达原件(序列： CTCAGTCTCAGTTGTGCAATTATAGTGAAGCCACAGATGTATAATTGCACAACTGAGACTGAA)克隆 至ptripz载体，得到ptripz-shPOH1表达载体；将ptripz-shPOH1表达载体与 慢病毒包装质粒共同转染293t细胞制备慢病毒，通过病毒感染的方式制备表达 POH1的shRNA的SK-Hep1细胞(一下简称SK-Hep1-shPOH1细胞)。ptripz是一 个强力霉素(doxycycloine，四环素类似物)诱导型表达载体，为验证其表达POH1 shRNA的效率及感染效率，在SK-Hep1-shPOH1细胞培养基中加入强力霉素96h 后收集并裂解细胞,通过Westernblot检测shRNA抑制POH1蛋白表达的情况， 结果见图5。从图5中可以看出，SK-Hep1-shPOH1细胞通过强力霉素诱导POH1 的shRNA表达后,抑制POH1蛋白的表达。

在裸鼠皮下注射5×10⁶个SK-Hep1-shPOH1细胞，然后通过在饮用水中添加 强力霉素(doxycycloine，四环素类似物)诱导注射SK-Hep1细胞中POH1的shRNA 表达；

每5天测量肿瘤的体积，40天后处死裸鼠，取出肿瘤并拍照并称重，结果 见图6-1，6-2，从图6-1中可以看出，POH1表达受到抑制后，细胞在裸鼠皮下 的成瘤能力也受到抑制，从图6-2中可以看出POH1表达受到抑制后，细胞在裸 鼠皮下形成的肿瘤比对照组小。

综上所述，本发明提供的一种干扰POH1表达的基因在体内试验和体外实验 中抑制肝癌细胞的生长，特别是对抑制肝癌细胞PLC/PRF/5、SMMC-7721和 SK-Hep1的生长。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。