一种原位定向拆分制备内切菊粉酶的方法及其制备低聚果糖的工艺

摘要

本发明公开了一种原位定向拆分制备内切菊粉酶的方法，将含纤维素的底物与微生物产天然菊粉酶混合，加入pH缓冲液混合至固液质量比为1g∶7～50mL，体系pH值控制在4～6，于5～55℃条件下吸附0.5～2h，体系经固液分离，弃去固形物，保留清液，即得内切菊粉酶液。本发明方法由于原位定向拆分去除了天然菊粉酶系中大部分的外切菊粉酶，天然菊粉酶系中的外切菊粉酶含量大幅度降低，提高了低聚果糖的得率，降低了产品中无生理活性的单糖含量，为微生物天然产菊粉酶制备低聚果糖提供了一个高效、低成本的新途径。

说明书

技术领域

本发明属生物化工中的微生物酶解制糖技术领域，具体涉及菊粉原料经微生物分泌的酶生物降解后，制备功能性食品低聚果糖的技术。

背景技术

菊粉(inulin)又称菊糖、土木香粉，为天然聚合物，是由D–呋喃果糖以β-2,1糖苷键连接而成的长链多聚果糖。通常其还原端连接一个葡萄糖基，呈直链结构，聚合度2～60，分子量为3000～5000，其分子大小随植物种类、气候条件及收获季节不同而异。菊粉微溶于冷水，在热水中能很快溶解，与碘不呈颜色反应，无还原性，有旋光性，在水中为左旋。菊粉在自然界分布很广，存在于植物、海藻、真菌和细菌中；但主要来源于植物，以能量形式存在于多种植物和蔬菜，尤其大量存在于菊科植物，例如菊芋(JurusalemArtichoke，俗称洋姜)、菊苣(Chicory)、大丽花(dahliapinnata)、牛蒡(arctiumlappa)等中。工业上一般多从菊芋根中提取菊粉。

低聚果糖(Fructooligosaccharide，简称FOS)又称寡果糖或蔗果低聚糖，是在蔗糖的果糖残基的C₁位上通过β-1，2-糖苷键与1～3个分子的果糖结合而成的低聚糖，主要是由蔗果三糖(1-kestose，简称GF₂)、蔗果四糖(nystose，简称GF₃)和蔗果五糖(1-F-β-fructofranosylnystose,简称GF₄)组成的混合物。低聚果糖广泛存在于自然界中，如梨、蜂蜜、啤酒、细菌、酵母、洋葱、香葱、牛蒡、菊芋、菊苣、香蕉、小麦、黑麦、燕麦等都含有FOS。其中菊粉中的低聚果糖的含量最高，大约占92％左右。低聚果糖是功能性低聚糖的一种，其主要的生理功能是调节人体肠道微生态环境和激活相关免疫系统。目前，工业化生产低聚果糖的方法有两种。一是蔗糖经果糖转移酶催化制备，产物低聚果糖为GFn型；二是利用菊粉酶定向水解菊粉制备，产物低聚果糖为GFn与Fm的混合型。在果糖转移酶催化蔗糖制备低聚果糖中，反应副产物葡萄糖是酶的抑制剂，转化率低，产物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖仅占55～60％以下，且工艺复杂成本高。菊粉酶定向水解菊粉制备低聚果糖是一步单酶反应，工艺简单，产物中低聚果糖含量高达80％以上。因此，以菊芋为原料酶法一步水解其中的菊粉制取低聚果糖，具有工艺简单、转化率高、副产物少的特点。

菊粉酶是一类催化菊粉水解的复合酶类，由内切菊粉酶(Endoinulinase)和外切菊粉酶(Exoinulinase)组成。菊粉是在菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的协同作用下被彻底降解成单糖的。菊粉酶水解菊粉的机理是菊粉多糖首先在内切菊粉酶从菊粉分子内部随机切断β-2,1-呋喃果糖苷键，得到低聚果糖，接着外切菊粉酶从低聚果糖分子的非还原末端依次水解β-D果糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖分子的果聚糖，最终产物为果糖和葡萄糖。从菊粉酶水解菊粉机理可看出，低聚果糖是菊粉水解成果糖和葡萄糖过程的中间产物，因此控制水解过程中中间产物低聚果糖的累积，是获得高得率低聚果糖的关键。从菊粉酶协同作用机理不难看出，如果菊粉酶酶系中外切菊粉酶的量越低，则菊粉水解过程中中间产物低聚果糖进一步水解成果糖和葡萄糖的量则越少，菊粉水解成低聚果糖的得率就越高。

大多数有工业应用潜力的、能合成菊粉酶的微生物，其分泌的菊粉酶酶系中都含有一定数量的外切菊粉酶。而低聚果糖的制备，对菊粉酶的要求是其外切菊粉酶含量(或活力)越低越好，即要求低外切菊粉酶活力的菊粉酶。为了在微生物酶法制备低聚果糖的工艺中，尽可能地降低外切菊粉酶的活力，国内外主要采取以下途径开展研究并取得了一定的进展：

(1)采用物理、化学诱变或基因工程的方法改造微生物，以期获得新的突变株或工程菌，它们可以分泌低外切菊粉酶含量的菊粉酶酶系；

(2)通过调控发酵的手段改变微生物的培养条件，以降低微生物对外切菊粉酶的分泌；

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对一般的微生物分泌的菊粉酶在降解菊粉制备低聚果糖时的不足，寻找一种由微生物产天然菊粉酶系制备内切菊粉酶的新方法。

本发明还要解决的技术问题是将上述方法应用于酶法制备低聚果糖的新工艺。

研究表明，自然界中大多数微生物所产菊粉酶为由内切菊粉酶和外切菊粉酶组成的混合酶，且多数表现高外切酶活性。菊粉是在菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的协同作用下被彻底降解成单糖的，菊粉酶水解菊粉的机理是菊粉多糖首先在内切酶的作用下主要形成低聚果糖，低聚果糖继而在外切酶的作用下被彻底降解成果糖和葡萄糖。因此，以菊粉为原料制备的目标产品不同，对菊粉酶的酶系结构的要求不同，以果糖为目标产品的工艺要求菊粉酶系中内切酶和外切酶比例适当，有利于协同作用；而以低聚果糖为目标产品的工艺要求菊粉酶系中外切酶含量尽量低，以提高低聚果糖的水解得率和降低水解产物中无生理活性的单糖含量。

因此，筛选低外切酶活力的菊粉酶生产菌株、或寻找菊粉水解过程中抑制外切酶活力的方法、或开发适合工业化规模的内切菊粉酶制备方法将是利用菊粉生产低聚果糖的关键。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种原位定向拆分制备内切菊粉酶的方法，将含纤维素的底物与微生物产天然菊粉酶混合，加入pH缓冲液混合至固液质量比为1g∶7～50mL，体系pH值控制在4～6，于5～55℃条件下吸附0.5～2h，体系经固液分离，弃去固形物，保留清液，即得内切菊粉酶液。

其中，所述的含纤维素的底物为低聚木糖生产废渣、微晶纤维素、脱脂棉和含纤维素的纸浆中的任意一种或者几种的组合。上述含纤维素的底物可以进行预处理再使用，预处理的目的是提高含纤维素的底物中纤维素对菊粉酶的可及度，可以采用物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的预处理方法。

其中，所述的微生物产天然菊粉酶是由曲霉属(Aspergillussp.)或青霉属(Penicilliumsp.)分泌的菊粉酶。

其中，所述的pH缓冲液为0.1M的乙酸/乙酸钠缓冲液。

其中，所述的固液分离，其手段为离心或板框过滤。

一种制备低聚果糖的工艺，它包括如下步骤：

(1)含纤维素的底物原位定向拆分：将含纤维素的底物与微生物产天然菊粉酶混合，加入pH缓冲液混合至固液质量比为1g∶7～50mL，体系pH值控制在4～6，于5～55℃条件下吸附0.5～2h，体系经固液分离，弃去固形物，保留清液，即得内切菊粉酶液；

(2)水解制备低聚果糖：将步骤(1)得到的内切菊粉酶液中，加入菊粉和pH缓冲液，使固液质量比为1g∶7～50mL，pH值控制在4～6，内切菊粉酶酶活与菊粉质量的比例控制在1～50IU/g，在45～55℃的条件下水解24～72h，将水解混合物进行固液分离，所获得的清液即为低聚果糖溶液。

步骤(1)中，所述的含纤维素的底物为低聚木糖生产废渣、微晶纤维素、脱脂棉和含纤维素的纸浆中的任意一种或者几种的组合。上述含纤维素的底物可以进行预处理再使用，预处理的目的是提高含纤维素的底物中纤维素对菊粉酶的可及度，可以采用物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的预处理方法。

步骤(1)中，所述的微生物产天然菊粉酶是由曲霉属(Aspergillussp.)或青霉属(Penicilliumsp.)分泌的菊粉酶。一个菊粉酶活力的单位(IU/mL)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol还原糖的酶量。

步骤(1)中，优选加入pH缓冲液混合至固液质量比为1g∶10mL。

步骤(1)和(2)中，所述的pH缓冲液为0.1M的乙酸/乙酸钠缓冲液。

步骤(2)中，优选加入菊粉和pH缓冲液，使固液质量比为1g∶50mL。

步骤(1)或(2)中，所述的固液分离，其手段为离心或板框过滤。

有益效果：本发明采用含纤维素的底物原位定向拆分天然菊粉酶系中的外切菊粉酶以后，由于水解体系中的外切菊粉酶活力大幅度降低，提高制备低聚果糖的的选择性，因而进一步提高菊粉降解成低聚果糖的得率和产物中低聚果糖的含量，降低了产物中无生理活性的单糖(果糖)的含量，为微生物天然产菊粉酶制备低聚果糖工艺提供了一个高效、低成本的新途径。

附图说明

图1为底物种类对底物吸附内切菊粉酶和外切菊粉酶的影响曲线，其中，1-纸浆，2-低聚木糖生产废渣，3-微晶纤维素，4-脱脂棉，5-菊粉；其实验条件为：底物加入量为10g/100mL，酶用量0.1mL，pH值4.6，吸附时间1.5h，吸附温度为4℃；

图2为吸附时间对底物吸附内切菊粉酶和外切菊粉酶的影响曲线，其实验条件为：底物加入量为10g/100mL，酶用量0.1mL，pH值4.6，温度为4℃；

图3为温度对底物吸附内切菊粉酶和外切菊粉酶的影响曲线，其实验条件为：底物加入量为10g/100mL，酶用量0.1mL，pH值4.6，吸附时间1h。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：用黑曲霉CBS513.88制备获取天然菊粉酶。

1)黑曲霉(A.niger)活化培养基成分(g/L)：葡萄糖10.0；蛋白胨1.0；硫酸铵1.4；尿素0.3；磷酸二氢钾2.0；二水氯化钙0.4；七水硫酸镁0.3；七水硫酸亚铁0.005；一水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；氯化钴0.0037；Tween802滴/50mL。

2)黑曲霉(A.niger)菊粉酶合成培养基成分(g/L)：葡萄糖1.0；菊粉15.0；硝酸钠0.6；磷酸二氢钾2.0；无水氯化钙0.3；七水硫酸镁0.4；七水硫酸亚铁0.005；一水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；初始pH值4.6。

3)黑曲霉的活化培养：50mL菌丝体培养基置于250mL三角瓶中，于121℃下灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的黑曲霉孢子，摇瓶置于恒温摇床中于30±3℃、170rpm条件下培养24h后用于产酶。

4)黑曲霉天然菊粉酶的制备：50mL产酶培养基于250mL三角瓶中，于121℃下灭菌30min，冷却至室温，按10％接种量接入种子，于170rpm的摇床中培养，第1d温度30±3℃、第1d后温度控制在28±3℃。

5)培养3d，用离心机在3000rpm条件下离心10min将培养液中的固体物质分离除去，即菊粉酶液。

内切菊粉酶活力的测定：在25mL刻度试管中加入0.1mL适当稀释的酶液0.9mL和5％(w/v)菊粉悬浮液(用0.1mol/L、pH4.6的乙酸/乙酸钠缓冲液配制)，盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，于振幅80，55℃下保温30min，取出，加入3mLDNS试剂，在100℃沸水中煮沸5min，冷却至室温后，加水定容至25mL，充分摇匀后于520nm波长下测定吸光度A值。反应生成的果糖量根据果糖标准曲线求得。以0.1mL蒸馏水代替酶液作空白对照。每个样品做2～3个平行样，取平均值。一个菊粉酶活力的单位(IU/mL)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol还原糖的酶量。

外切菊粉酶活力的测定：在25mL刻度试管中加入0.1mL适当稀释的酶液0.9mL和5％(w/v)蔗糖液(用0.1mol/L、pH4.6的乙酸/乙酸钠缓冲液配制)，盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，于振幅80，55℃下保温30min，取出，加入3mLDNS试剂，在100℃沸水中煮沸5min，冷却至室温后，加水定容至25mL，充分摇匀后于520nm波长下测定吸光度A值。反应生成的果糖量根据果糖标准曲线求得。以0.1mL蒸馏水代替酶液作空白对照。每个样品做2～3个平行样，取平均值。一个菊粉酶活力的单位(IU/mL)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol还原糖的酶量。

结果表明，黑曲霉以菊粉为碳源合成菊粉酶，培养3d，内切菊粉酶活力为6.94IU/mL，外切菊粉酶活力为0.78IU/mL。

实施例2：用青霉TN-88制备获取天然菊粉酶。

1)青霉(Penicilliumsp.)活化培养基成分(g/L)：葡萄糖10.0；蛋白胨1.0；硫酸铵1.4；尿素0.3；磷酸二氢钾2.0；二水氯化钙0.4；七水硫酸镁0.3；七水硫酸亚铁0.005；一水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；氯化钴0.0037；Tween802滴/50mL。

2)青霉(Penicilliumsp.)菊粉酶合成培养基成分(g/L)：葡萄糖1.0；菊粉15.0；蛋白胨3；磷酸二氢钾2.0；无水氯化钙0.3；七水硫酸镁0.4；七水硫酸亚铁0.005；一水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；初始pH值4.6。

3)青霉的活化培养：50mL菌丝体培养基置于250mL三角瓶中，于121℃下灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的青霉菌中，摇瓶置于恒温摇床中于30±3℃、170rpm条件下培养24h后用于产酶。

4)青霉天然菊粉酶的制备：50mL产酶培养基于250mL三角瓶中，于121℃下灭菌30min，冷却至室温，按10％接种量接入种子，于170rpm的摇床中培养，第1d温度30±3℃、第1d后温度控制在28±3℃。

5)培养3d，用离心机在3000rpm条件下离心10min将培养液中的固体物质分离除去，即菊粉酶液。

内切菊粉酶活力的测定与外切菊粉酶活力的测定同实施例1。

结果表明，青霉以菊粉为碳源合成菊粉酶，培养3d，内切菊粉酶活力为5.45IU/mL，外切菊粉酶活力为1.24IU/mL。

实施例3：含纤维素的底物原位定向拆分黑曲霉产天然菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的影响。

1)分别称取低聚木糖生产废渣、微晶纤维素、含纤维素的纸浆、脱脂棉和菊粉2.0g于50mL三角瓶中，加入菊粉酶液0.1mL，加入pH缓冲液，控制吸附体系水分体积为20mL、pH4.6左右，置于恒温振荡水浴锅于pH值4.6左右、温度10～50℃条件下吸附0.5～2h。

2)吸附结束后，于3000rpm下离心10min，得到清液，测定液相中内切菊粉酶活力和外切菊粉酶活力，计算不同含纤维素的底物对内切菊粉酶和外切菊粉酶活力的吸附率，并与菊粉为吸附质对照的结果进行对比。吸附质底物种类、吸附时间和温度对吸附率的影响结果如附图1～3。

含纤维素的底物对内切菊粉酶和外切菊粉酶的吸附率计算方法为：

吸附率(％)＝[(初始酶活力－吸附体系液相中酶活力)/初始酶活力]×100

其中初始酶活力、吸附体系液相中酶活力以含有的总活力表示，单位IU。

附图1～3表明，含纤维素的底物对菊粉酶系中的内切菊粉酶和外切菊粉酶的吸附作用受吸附条件(温度、时间)影响较小。以对外切菊粉酶吸附率最大而对内切菊粉酶吸附率最小为考察指标，最适宜的吸附条件：含纤维素的底物为亚硫酸盐预处理过的含纤维素的纸浆、温度50℃、吸附时间1h。在此条件下，纸浆对内切菊粉酶和外切菊粉酶的吸附率分别为2.57％和97.10％。吸附后固液分离，大量外切菊粉酶可随固形物的分离而被定向去除。

表1纸浆为底物对天然黑曲霉菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的原位定向拆分

内切菊粉酶活力外切菊粉酶活力吸附前00吸附后2.57％97.10％

纸浆为底物对天然菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的原位定向拆分结果(以底物对酶的吸附率表示)如表1。

实施例4：含纤维素的底物原位定向拆分青霉产天然菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的影响。

1)分别称取低聚木糖生产废渣、微晶纤维素、含纤维素的纸浆、脱脂棉和菊粉2.0g于50mL三角瓶中，加入菊粉酶液0.1mL，加入缓冲液，控制吸附体系水分体积为20mL、pH4.6左右，置于恒温振荡水浴锅于pH值4.6左右、温度10～50℃条件下吸附0.5～2h。

2)吸附结束后，于3000rpm下离心10min，得到清液，测定液相中内切菊粉酶活力和外切菊粉酶活力，计算不同含纤维素的底物对内切菊粉酶和外切菊粉酶活力的吸附率，并与菊粉为吸附质对照的结果进行对比。

含纤维素的底物对内切菊粉酶和外切菊粉酶的吸附率计算方法为：

吸附率(％)＝[(初始酶活力－吸附体系液相中酶活力)/初始酶活力]×100

其中初始酶活力、吸附体系液相中酶活力以含有的总活力表示，单位IU。

同样，含纤维素的底物对菊粉酶系中的内切菊粉酶和外切菊粉酶的吸附作用受吸附条件(温度、时间)影响较小。以对外切菊粉酶吸附率最大而对内切菊粉酶吸附率最小为考察指标，最适宜的吸附条件：含纤维素的底物为纸浆、温度50℃、吸附时间1h。在此条件下，亚硫酸盐预处理过的纸浆对内切菊粉酶和外切菊粉酶的吸附率分别为3.08％和95.39％。吸附后固液分离，大量外切菊粉酶可随固形物的分离而被定向去除。

纸浆为底物对天然黑曲霉菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的原位定向拆分结果(以底物对酶的吸附率表示)如表2。

表2亚硫酸盐预处理过的纸浆为底物对天然菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的原位定向拆分

内切菊粉酶活力外切菊粉酶活力吸附前00吸附后3.08％95.39％

实施例5：利用原位定向拆分获得的黑曲霉内切菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖。

1)含纤维素的底物原位定向拆分：称取纸浆2g于50mL三角瓶中，加入天然黑曲霉菊粉酶酶液0.1mL，加入0.1M乙酸/乙酸钠缓冲液19.9mL，使吸附体系pH值为4.6。置于50℃的恒温水浴锅中吸附1h。

2)固液分离：上述体系吸附完成后，于3000rpm下离心10min，得到清液，弃去固形物。

3)水解制备低聚果糖：取上述离心分离后的上清液0.1mL，加入0.1M乙酸/乙酸钠缓冲液19.9mL，并加入菊粉20g/L，内切菊粉酶的加酶量为1.5IU/g菊粉，充分混合，使反应体系pH值为4.6。置于55℃、170rpm的摇床中水解24h，水解结束后水解物于3000rpm条件下离心10min，得到的清液即为低聚果糖水解糖液。经分析检测，低聚果糖水解得率为96.13％，低聚果糖水解选择性为92.19％。

低聚果糖水解得率计算方法为：

低聚果糖水解得率(％)＝(C₁/C)×100

低聚果糖水解选择性计算方法为：

低聚果糖水解选择性(％)＝[C₁/C₁+(C₂+C₃)×0.9+C₄)×100

其中：C--初始菊粉含量，g/L

C₁--酶解后酶解液中低聚果糖含量，g/L

C₂--酶解后酶解液中果糖含量，g/L

C₃--酶解后酶解液中葡萄糖含量，g/L

C₄--酶解后酶解液中蔗糖含量，g/L

0.9--聚糖与单糖的转换系数。

比较例1：未经过含纤维素的底物原位定向拆分外切菊粉酶的黑曲霉菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖

直接使用实施例1中用黑曲霉制备获取的菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖。实验方法如下：

称取菊粉0.4g于50mL三角瓶中，加入天然黑曲霉菊粉酶酶液0.1mL，加入0.1mol/L柠檬酸缓冲液19.9mL，内切菊粉酶的加酶量为1.5IU/g菊粉，充分混合，使反应体系pH值为4.6。置于55℃、170rpm的摇床中水解24h，水解结束后反应物于3000rpm条件下离心10min，得到的清液即为低聚果糖水解糖液。经分析检测，低聚果糖水解得率为30.60％，低聚果糖水解选择性为32.67％。

低聚果糖水解得率计算方法为：

低聚果糖水解得率(％)＝(C₁/C)×100

低聚果糖水解选择性计算方法为：

低聚果糖水解选择性(％)＝[C₁/C₁+(C₂+C₃)×0.9+C₄)×100

其中：C--初始菊粉含量，g/L

C₁--酶解后酶解液中低聚果糖含量，g/L

C₂--酶解后酶解液中果糖含量，g/L

C₃--酶解后酶解液中葡萄糖含量，g/L

C₄--酶解后酶解液中蔗糖含量，g/L

0.9--聚糖与单糖的转换系数。

结果表明：经含纤维素的底物原位定向拆分外切菊粉酶后获得的低外切黑曲霉菊粉酶活力菊粉酶，显著提高水解制备低聚果糖的选择性。与未拆分处理的原菊粉酶酶液相比，水解产物中低聚果糖的选择性从拆分前的32.67％提高到92.19％。

实施例6：利用原位定向拆分获得的青霉内切菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖。

1)含纤维素的底物原位定向拆分：称取纸浆2g于50mL三角瓶中，加入天然青霉菊粉酶酶液0.1mL，加入0.1M乙酸乙酸钠缓冲液19.9mL，使吸附体系pH值为4.6。置于50℃的恒温水浴锅中吸附1h。

2)固液分离：上述体系吸附完成后，于3000rpm下离心10min，得到清液，弃去固形物。

3)水解制备低聚果糖：取上述离心分离后的上清液0.1mL，加入0.1M乙酸/乙酸钠缓冲液19.9mL，并加入菊粉20g/L，内切菊粉酶的加酶量为1.5IU/g菊粉，充分混合，使反应体系pH值为4.6。置于55℃、170rpm的摇床中水解24h，水解结束后水解物于3000rpm条件下离心10min，得到的清液即为低聚果糖水解糖液。经分析检测，低聚果糖水解得率为95.25％，低聚果糖水解选择性为90.23％。

低聚果糖水解得率计算方法为：

低聚果糖水解得率(％)＝(C₁/C)×100

低聚果糖水解选择性计算方法为：

低聚果糖水解选择性(％)＝[C₁/C₁+(C₂+C₃)×0.9+C₄)×100

其中：C--初始菊粉含量，g/L

C₁--酶解后酶解液中低聚果糖含量，g/L

C₂--酶解后酶解液中果糖含量，g/L

C₃--酶解后酶解液中葡萄糖含量，g/L。

比较例2：未经过含纤维素的底物原位定向拆分外切菊粉酶的青霉菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖。

直接使用实施例2中用青霉制备获取的菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖。实验方法如下：

称取菊粉0.4g于50mL三角瓶中，加入青霉产天然菊粉酶酶液0.1mL，加入0.1mol/L柠檬酸缓冲液19.9mL，充分混合，使反应体系pH值为4.6。置于55℃、170rpm的摇床中水解24h，水解结束后反应物于3000rpm条件下离心10min，得到的清液即为低聚果糖水解糖液。经分析检测，低聚果糖水解得率为28.74％，低聚果糖水解选择性为30.29％。

低聚果糖水解得率计算方法为：

低聚果糖水解得率(％)＝(C₁/C)×100

低聚果糖水解选择性计算方法为：

低聚果糖水解选择性(％)＝[C₁/C₁+(C₂+C₃)×0.9+C₄)×100

其中：C--初始菊粉含量，g/L

C₁--酶解后酶解液中低聚果糖含量，g/L

C₂--酶解后酶解液中果糖含量，g/L

C₃--酶解后酶解液中葡萄糖含量，g/L

结果表明：经含纤维素的底物原位定向拆分外切菊粉酶后获得的低外切青霉菊粉酶活力菊粉酶，显著提高水解制备低聚果糖的选择性。与未拆分处理的原菊粉酶酶液相比，水解产物中低聚果糖的选择性从拆分前的30.29％提高到90.23％。