可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌的双重LAMP方法

摘要

本发明公开了一种双重LAMP检测方法，该方法可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌。属于分子生物学技术领域。所述LAMP检测体系中含有检测副溶血弧菌基因OmpA和创伤弧菌metalloprotease基因的引物组，该引物组分别包含OmpA基因和etalloprotease基因的一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP；内引物BIP上分别含有PstI和BamHI酶切位点。该发明方法灵敏度高，特异型好，操作简单，结果观察直观明了，检测速度快。

说明书

技术领域

本发明涉及病原弧菌的检测方法，具体的说是一种可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌的双重LAMP方法。

背景技术

创伤弧菌(Vibriovulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,主要分布于近海海洋环境中,是水产养殖虾、蟹和牡蛎等水生动物中最常见、流行最广、危害最严重的致病菌之一；副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据靶序列设计四条特异性引物，可以特异性识别靶序列的六个特定区域，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可以在1小时内对靶序列实现109倍的扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可以通过肉眼直接观察。目前，针对创伤弧菌和副溶血弧菌已经有LAMP检测方法的报道，只是这些检测方法均是针对单一致病菌进行的检测。双重或多重LAMP技术相对单重LAMP而言，操作更加快速、简便，并且节约检测成本，适合基层养殖场对病原的快速检测。

发明内容

本发明提供了一种可同时检测创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法，目的是实现对创伤弧菌和副溶血弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术只能检测单一病原的弊端。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

1、提供2组LAMP引物序列，创伤弧菌的引物长度分别为45bp，46bp，20bp，19bp，分别命名为metalloprotease-FIP、metalloprotease-BIP、metalloprotease-F3、metalloprotease-B3，副溶血弧菌引物长度分别为47bp，44bp，19bp，22bp，分别命名为ompA-FIP、ompA-BIP、ompA-F3、ompA-B3；

2、配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳反应体系和反应条件；

3、反应产物的鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。

具体包括如下步骤：

1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.vulnificus的metalloprotease基因(GenBank:U50548.1)和V.parahaemolyticus的ompA基因(GenBank:JTGT01000603.1)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于V.vulnificus，在BIP的B1c和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子；V.parahaemolyticus，在BIP的B1c和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子，设计以下两组LAMP引物：

2、配制LAMP反应体系

反应体系的终浓度为：总体系25μl,包括BstDNA聚合酶1μl(8U)，10×BstDNABuffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5μl,创伤弧菌和副溶血弧菌DNA模板共计1μl，FIP/BIP各1μl(0.8μM)，F3/B3各1μl(0.2μM)，加灭菌双蒸水使反应体系总体积达到25μl。

3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58到65℃，反应时间为15到90min。

4、扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。

附图说明

图1反应温度温度梯度从左往右依次58℃到65℃8个梯度1，3，5，7，9，11，13，15分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃的阴性对照；2，4，6，8，10，12，14，16分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃加模版。M：marker

图2反应时间1—6分别代表15min,30min,45min,60min,75min,90min；M为marker

图3双重LAMP反应的琼脂糖凝胶电泳图谱及酶切分析

图4创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度比较M:Marker；1-81.6×107CFU/ml-1.6×100CFU/mlCFU/ml；N:negativecontrol

图5特异性结果统计只有创伤弧菌和副溶血弧菌有扩增，其他菌均没有扩增

图6SYBRGreenI显色反应对人工感染的大菱鲆鱼的肝、肾、脾、血进行双重LAMP扩增，产物加入SYBRGreenI，感染组显示绿色(+),对照组无变化(-)。

图7双重LAMP检测方法的应用-平板计数法结合双重LAMP计数细菌的最低检出率。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

1.创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP方法的建立

1.1材料

dNTPs、BstDNA聚合酶(含10×缓冲液)、PCR级甜菜碱、

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

设计LAMP引物：根据GeneBank中已知V.vulnificus的metalloprotease基因(GenBank:U50548.1)和V.parahaemolyticus的ompA基因(GenBank:JTGT01000603.1)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于V.vulnificus，在BIP的B1c和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子；V.parahaemolyticus，在BIP的B1c和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子，设计以下两组LAMP引物：

1.2.2LAMP扩增条件的优化

优化反应温度和反应时间：检测所用的模板用煮沸裂解法制备。分别在温度和时间上设置的不同梯度，进行优化。温度上从58℃到65℃每隔1℃设置一个梯度；时间上15min一个梯度，设置6个梯度。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析；

分析温度电泳图：创伤弧菌在58℃到65℃均可发生反应，产生阶梯状扩增条带，且电泳条带亮度接近；副溶血弧菌在58℃和65℃均无明显阶梯状扩增条带，但在59℃到64℃有阶梯状扩增条带。(见图1-A和图1-B)

分析时间电泳图：创伤弧菌和副溶血弧菌均在45min时，出现明显的阶梯状条带，(见图2-A和图2-B)

比较V.vulnificus和V.parahaemolyticus两种弧菌的电泳图谱，选择62℃反应45min即可产生清晰的阶梯状扩增条带。

实施例2

限制性内切酶酶切分析

为了构建双重LAMP的检测方法，在V.vulnificus和V.parahaemolyticus两种弧菌的内引物BIP的B1互补链(B1c)和B2之间分别添加BamHI限制性酶切位点和PstI限制性酶切位点(两种弧菌的靶序列中都不含该两种限制性酶切位点)，利用限制性酶切分析来确定反应的正确性和特异性。在双重LAMP反应体系中只添加一种模板，并分别对扩增产物进行一种限制性酶切。结果表明：创伤弧菌的扩增产物能够被BamHI限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带见(图3-A1泳道)；副溶血弧菌能够被PstI限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带(见图3-B1泳道)，证明了双重LAMP扩增结果的正确性。

实施例3

创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法的灵敏度测定

1煮沸法提取DNA。

2为了检测LAMP方法的灵敏度，将提取创伤弧菌和副溶血弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，共8个梯度，各浓度级分别取1μL作为模版,进行优化条件后的LAMP扩增,扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

3分别取1μL作为PCR模板，F3/B3各1μl(20mM)，Taq酶0.5μl，dNTPs(2.5mMeach)1μl，Taq10×buffer2.5μl,ddH2O18μl，进行PCR扩增，94℃预变性5min；94℃变性30s,57℃退火40s，72℃延伸40s,25个循环；72℃延伸5min。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR方法对2种致病菌不同稀释度的菌悬液进行灵敏度的检测，结果发现：创伤弧菌最低均能检测到1.6x103CFU/ml，分别产生224bp的扩增条带(图4C)；副溶血弧菌最低均能检测到1.6x104CFU/ml，分别产生207bp的扩增条带(图4D)。双重LAMP检测方法灵敏度高，创伤弧菌最低能够检测到16CFU/ml，是普通PCR方法的102倍；副溶血弧菌最低能够检测到16CFU/ml，是普通PCR方法的103倍。

实施例4

1用煮沸法制备鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)，创伤弧菌(Vibriovulnificus)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，大肠杆菌(E.coli)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的DNA模板,进行LAMP扩增，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果只有创伤弧菌和副溶血弧菌有扩增条带(图5)。

实施例5

双重LAMP方法具体检测鱼体内的创伤弧菌和副溶血弧菌

1选取大菱鲆作为试验动物，通过腹腔注射方式分别人工感染2种弧菌。感染12h后，无菌操作，分别取血、肾、肝及脾组织，匀浆。匀浆液进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布LB固体培养基平板，计数。剩余血、肾、肝及脾组织的匀浆液经煮沸，进行10倍梯度稀释，双重LAMP方法检测其最低检出率，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶分析。

结果显示，双重LAMP方法可以在所有的感染组样品中，检测到2种弧菌的存在。向双重LAMP扩增反应管中加入1μl(1:10)SYBRGreenI，目测反应管中颜色的变化。结果发现，感染组的所有组织的反应管中均发生了阳性反应，颜色变为典型的绿色(+)；对照组健康大菱鲆的所有组织的反应管中颜色变为橙色(—)(图6)。

2结合平板计数和双重LAMP方法，计算各细菌感染组中所取组织细菌检出率(图7)。结果表明：感染创伤弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为21CFU/ml、25CFU/ml、19CFU/ml和23CFU/ml；感染副溶血弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为24CFU/ml、21CFU/ml、18CFU/ml和27CFU/ml。