STK39基因甲基化位点及其诊治骨性关节炎的应用

摘要

本发明涉及STK39基因甲基化位点及其诊治骨性关节炎的应用。发明基于测序分析结果筛选出候选基因STK39，基因分析显示STK39在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于正常组，进一步的蛋白分析表明STK39蛋白表达和基因甲基化呈负显著相关性。本发明提供了一种新的骨性关节炎诊治靶点，具有重要的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及STK39基因甲基化位点及其诊治 骨性关节炎的应用，更具体的涉及STK39基因、STK39基因的甲基化检测及其 在诊治骨性关节炎中的应用。

背景技术

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成 的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化 导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化 达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收 缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始， 导致基因失活。

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退行性病变和关节周围骨 质增生为主要病理特征的慢性进行性骨关节病。它是老年人中最常见的关节疾病， 也是引起中老年人关节疼痛的最常见原因。现今我国社会逐步进入老龄化，该病 的发生率也呈逐年上升趋势。已有报道表明OA发生、发展过程与软骨细胞的 DNA甲基化有一定相关性，但相关的研究还十分匮乏，亟待更多的研究揭示与 骨性关节炎相关的甲基化基因，并阐明所述甲基化位点与OA的关系。

本发明通过对5例骨性关节炎病人及2例对照的膝关节软骨组织进行高通量 甲基化测序分析及转录组测序分析，筛选出几个在病例组中呈高甲基化且基因表 达下调的候选基因及其甲基化位点。进一步的分子生物实验验证结果表明，候选 基因STK39在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝 关节软骨组织中甲基化程度明显高于正常组。本发明提供了一种新的骨性关节炎 诊治靶点，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测STK39基因的试剂在制备诊断骨性关节炎 诊断制剂中的应用。

进一步，所述诊断制剂中含有检测STK39基因表达量和/或检测STK39基因 甲基化程度的试剂。

优选的，采用下列方式中的一种或几种检测STK39基因表达量：荧光定量 PCR试剂盒、基因芯片、ELISA法和/或胶体金法，更优选的，采用引物序列为 序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2进行STK39基因表达量检测。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1) 固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段， 通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样 法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。 3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂 交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病 的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便； 三是可同时检测多种疾病。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使 酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和 特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试 剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步 法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中 生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或 组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银 显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶 体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗 体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察 和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于 膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。 (4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标 记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样 本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应， 当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特 异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发 展成为诊断试纸条，使用十分方便。

本发明的目的在于提供一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有促进 STK39基因的转录或表达的试剂或化合物。

本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的 一种和/或几种：激活STK39基因的启动子、激活STK39基因表达的蛋白或因子、 导入促进STK39基因转录或表达的载体。

本发明的目的在于提供一种检测骨性关节炎的基因检测试剂盒，所述试剂盒 检测基因STK39。

本发明目的是提供了一种骨性关节炎蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检 测STK39蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测骨性关节炎的基因芯片，所述的基因芯片包括 与STK39基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的目的在于提供一种骨性关节炎诊疗试剂，所述诊疗试剂组分中的一 种或几种用于检测或降低序列表中SEQIDNO.3的CpG岛甲基化程度。

进一步，所述诊疗试剂组分中的一种或几种用于检测或降低序列表中SEQID NO.3的第89bp处CpG岛甲基化程度。

优选的，采用BSP测序法对SEQIDNO.3的甲基化程度进行检测，更优选 的，采用引物序列为序列表SEQIDNO.4和SEQIDNO.5进行BSP测序检测。

优选的，采用甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测，甲基化特异性 PCR法包括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物。优选的，甲基化特 异性PCR法对序列表中SEQIDNO.3的第89bp处CpG岛甲基化程度进行检测。

优选的，采用引物序列为序列表SEQIDNO.6到SEQIDNO.9进行甲基化特 异性PCR法对甲基化程度进行检测。

进一步，采用下列方法中任意一种或几种的组合对甲基化程度进行检测：甲 基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSO₃法、芯片技术方法；所述NaHSO₃法包 括BSP测序法、联合NaHSO₃限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法； 所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核 苷酸芯片。

本发明的目的在于提供上述诊疗试剂在制备骨性关节炎诊疗工具中的应用。

甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限 制性内切酶不能切开甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳动物DNA 中，只有CG相连的胞嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含CG序列的 限制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶对是HPaII-Msp I(CCGG)和SmaI-XmaI(CCCGGG)。由于第二对限制酶识别序列非常罕见，所以 一般都用HPaII-MspI(CCGG)。两个酶都识别CCGG序列，而当其中的胞嘧啶 甲基化时，HPaII不能够将其切开，利用HpaII-Msp工的这种属性处理DNA， 这就使得HPaII-MspI能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行Southern或 PCR扩增分离立物，明确甲基化状态。

NaHSO₃可将非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T：A 配对，但甲基化的C则能抵抗NaHSO₃的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就 可转化为DNA序列的差异。由此发展了多种CpG岛甲基化检测方法，如BSP 测序、PCR(COBRA，MSP，Methelight等)、芯片杂交技术(microarray)，此类方 法适应于检测己知基因中一个或多个CpG岛的几个CpG位点的甲基化，属位点 特异性DNA甲基化检测技术。

芯片技术的发展为高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理 大致可分为3种:(1)基于亚硫酸氢盐处理后C/T转变的原理，(2)基于甲基化敏感 性内切酶或者甲基化依赖性内切酶的方法，(3)基于5-甲基胞嘧啶抗体或者MBD 的免疫扑获方法富集甲基化的DNA片段。

附图说明

图1骨性关节炎组和对照组中STK39基因甲基化情况

图2骨性关节炎患者组内STK39蛋白表达和基因甲基化相关性分析图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和 宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范 围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1样本的采集及测序

对照组：收集2012-2014年因交通事故在医院进行半月板损伤及交叉韧带损 伤进行关节镜手术治疗的患者，取膝关节软骨组织速存于液氮罐。

骨性关节炎患者组：收集2012-2014年在医院就诊，根据1995年美国风湿协 会骨性关节炎的诊断标准，诊断为重度骨性关节炎，有膝关节置换指征的患者病 例。

其中，临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准：

(1)1个月内大多数时间有膝痛；

(2)关节活动时响声；

(3)晨僵不大于30分钟；

(4)年龄不小于40岁；

(5)膝关节骨性肿胀伴弹响；

(6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。

最少存在((1)、(2)、(3)、(4)或(1)、(2)、(3)、(5)或(1)、(6)即可诊断OA。

样品采集后，选择5例患者组2例对照组送往美吉生物公司进行转录组测序 和全基因组甲基化测序，并提供初步的分析结果。测序结果显示候选基因STK39 在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织 中甲基化程度明显高于正常组。

实施例2骨性关节炎患者及对照滑膜组织STK39基因表达情况

1.实验材料

选取37例骨性关节炎患者滑膜组织及9例对照滑膜组织，对其进行分组及 编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节置换手术患者；对照组为 半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。

2.实验方法

2.1骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取， 实验操作按产品说明书进行。

RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA 电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保 温前的图谱无明显差异。

2.2逆转录合成cDNA

采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。 采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保 存放-20℃冰箱备用。

2.3Real-TimePCR

引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_013233.2(STK39)，内 参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

表1Real-TimePCR引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min预 反应，进行40个循环(95℃15s，60℃45s)的扩增反应。

表2Real-TimePCR反应体系

组分 加入量 2×mix 10μl 上游引物(10uM) 0.5μl 下游引物(10uM) 0.5μl 模板 2μl

加入灭菌蒸馏水 至25μl

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl 作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融 解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品Real-TimePCR检测

将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因 引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

3.实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管 的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较 高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增； 根据qRT-PCR的相对定量公式，比较STK39基因在骨性关节炎组和对照组中的 表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其STK39基因在骨性关节炎组 中的表达水平仅为对照组织的约三分之一，以上结果验证了高通量转录组表达数 据的整合分析STK39基因在骨性关节炎患者中低表达的结果。

实施例3DNA的提取及甲基化修饰

1.酚-氯仿抽提法处理DNA

基因组DNA提取采用酚-氯仿抽提法，详细步骤如下：

(1)取0.1g软骨组织置于研磨中，加入液氮进行快速研磨，待研磨至粉末状 时候，将其转入是离心管中，并加600μl消化缓冲液，再加4μl蛋白酶K(1M)， 摇匀后置于55℃水浴中至消化清透；

(2)用等体积的重蒸饱和酚，混匀，摇床慢速摇动20min，10000g离心10min， 取上清液；

(3)加氯仿/异戊醇(24:1)酚:抽提液＝1:1:2，混匀，摇床慢速摇动20min，离 心后取其上清液；

(4)加氯仿/异戊醇(24:1):抽提液＝＝1:1，混匀后再次离心取其上清液；

(5)加0.1倍体积醋酸钠(3M，pH＝5.2)和2倍体积冰冻的无水乙醇，混匀， 冷冻过夜；

(6)4℃，12000g离心15min弃上清液；

(7)沉淀用500μl冰冻的70％乙醇充分洗涤，12000g离心5min，弃上清液；

(8)重复执行步骤7，室温下自然晾干；

(9)用30-50μl双蒸水充分溶解沉淀，琼脂糖电泳检测DNA的完整性，-20℃ 冻存备用。

2.DNA样品的修饰及纯化：

DNA甲基化的修饰是采用EZDNAMethylation^TMKit(ZYMORESEARCH， 货号D5002)进行，原理和经典的亚硫酸氢钠修饰基本相似。经试剂盒处理后， 甲基化的胞嘧啶未发生变化，而未发生甲基化的胞嘧啶(C)都将变成尿嘧啶(U)。 再设计分别针对甲基化和非甲基化序列的特定引物，进行PCR的扩增，通过琼 脂糖凝胶电泳分析的方法来确定DNA的甲基化状态变化。

具体步骤：

(1)DNA的准备：将之前提取的DNA双蒸水稀释至25-100μg/ml后吸取20μl 置于PCR管中；

(2)CT转化试剂(ConversionReagent)的制备：一个CT转化试剂管中添加 900μl水，300μl的M-稀释缓冲液和50μl的M-溶解缓冲液，室温下溶解并震荡 10min；

(3)将130μlCT转化试剂、20μlDNA样品添加至PCR管中，若DNA样本体 积不足20μl，可用去离子水补足差量，通过移液枪或者轻弹试管等操作混合样品；

(4)把样品放到循环变温器中，先于98℃放置10分钟，再于64℃放置2.5小 时后，马上进行一下步骤；

(5)将600μl的M-结合缓冲液添加到Zymo-SpinIC^TM吸附柱中，并将吸附柱 放到收集管中；

(6)在含有M-缓冲液的Zymo-SpinIC^TM吸附柱中加入步骤(4)中的样品，封 盖后混匀样本；

(7)经30秒全速离心后去掉流出液；

(8)将100μlM-漂洗缓冲液添加到吸附柱中，并全速离心30秒；

(9)将200μlM-硫化缓冲液添加到吸附柱中，于室温下放置20分钟，培养后 全速离心30秒；

(10)将200μlM-漂洗缓冲液添加到柱中，全速离心30秒后再添加200μlM- 漂洗缓冲液到柱内，再次全速离心30秒；

(11)直接将l0μlM-洗脱缓冲液添加到柱中，将吸附柱放置在1.5m1的EP管 内，全速离心洗脱DNA；

(12)重复执行步骤11，EP管内即为所修饰和纯化的DNA；

(13)DNA储存在-70℃冰箱中备用。

实施例4STK39基因甲基化CpG位点的研究

选择实施例3中的5个骨性关节炎组提取的DNA和5个对照组提取的DNA (均已经进行了样品的修饰及纯化，即甲基化的胞嘧啶未发生变化，而未发生甲 基化的胞嘧啶(C)都将变成尿嘧啶(U))。以相应的BSP引物扩增SEQIDNO.3 (序列长245bp)：

>gi|224589811:169100827-169101071Homosapienschromosome2,GRCh37.p13 PrimaryAssembly

CTCTCTTAATCCTGGGGGACCAAACTCTGCCCAGAAGGAAATGAAGAAAA AGTCCTCCGTGCCCGTGCCATGCTGGAAAGTTAAAACACGGTGCCTCCTTT GGTTTTCTGTTCAGGCACATCTGAGCCTCCTGCTGCTGGTCACGGTTCACA CTGCTGGAGTCATATCATATGACACCTGCCGTATGGCGGGTAGAAGCAAAG GCTGTCAACTGGCATTCATGTTGAAACTGGTTCAGTGTTTGA(SEQIDNO.3)

所用引物见表3，用凝胶电泳验证引物设计及是否成功，结果显示均得到目 的扩增片段，其大小与预期的大小一致。

表3BSP引物

将回收纯化的PCR产物分别与pUC18-T载体连接以构建BSP-PCR产物重组 质粒，然后进行连接产物转化制备感受态细胞，选择在IPTG/X-gal平板上生长 的白色菌落。用凝胶电泳对目的片段克隆的菌落进行PCR鉴定以排除假阳性克 隆，筛选正确的克隆进行后续的测序分析。

为提高对克隆甲基化测序结果的有效性，每个实验组选取5个鉴定正确的克 隆进行测序分析。待测序列位置一共有6个CpG位点。利用SeqMan软件对无 明显干扰信号的测序结果进行序列比对，得到每个克隆中待检测6个CpG位点 的甲基化状态。分析结果表明亚硫酸盐转化效率均达到98％或以上，符合亚硫酸 盐转化实验要求，表明BSP分析结果可靠。结果显示在第3个CpG的位点(89bp) 发生了甲基化，对照组未甲基化，说明该位点的甲基化可能是骨性关节炎致病相 关的原因之一。

实施例5甲基化特异性PCR(MSP)

1.STK39基因甲基化及非甲基化引物设计与合成

引物设计后送公司合成。

表4MSP引物

2.MSP反应体系

表5MSP反应体系

试剂 体积(μl) 2×HS PCR Mix 12.5 M/U上游引物(10μM) 1 M/U下游引物(10μM) 1 模板 1 灭菌水 补平至25

反应条件：预反应：94℃5min；反应35个循环(94℃30秒，60℃30秒，72℃ 30秒)；延伸72℃5min，反应结束后取出进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3.实验结果

非甲基化特异性引物的扩增产物存在，甲基化特异性引物的扩增产物不存在 即为非甲基化；非甲基化特异性引物的扩增产物不存在，甲基化特异性引物的扩 增产物存在即为甲基化。电泳结果显示：37例骨性关节炎患者滑膜组织中，甲 基化阳性的有28例，基因甲基化率为75.68％，9例对照滑膜组织中甲基化阳性 的仅有2例，基因甲基化率为22.22％(见表6，图1)。

表6骨性关节炎组和对照组STK39基因甲基化情况

实施例6WB方法检测骨性关节炎滑膜中STK39的表达

一、蛋白质样品制备及定量

1.RIPA裂解液(Beyotime)进行蛋白质样品制备，操作步骤如下:

将滑膜组织自冰箱取出，用滤纸擦拭组织上的PBS溶液，称取重量，并将滑 膜组织置于机械组织匀浆器中，1:10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积 的裂解液进行匀浆，10000-14000g离心3-5分钟，取上清液，按1:1加入样品缓 冲液强力混匀后置于100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟， 取上清液，将其转入另一洁净的试管中。

2.利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量

采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：CW2011)，具体步骤见其 说明书。

二、SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1.蛋白质样品变性:

a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总 蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混 合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5×)。

b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

2.胶板制备:

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书 安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5ml10％的分离胶，配方如下：

表7分离胶配方

组分 用量 30％丙烯酰胺溶液 1.7ml Tris-HCl(1.5M，pH8.8) 1.3ml 10％SDS 0.05ml 10％AP 0.05ml TEMED 0.002ml 灭菌ddH2O 补充至5ml

混匀后立即灌胶，然后加lml蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后， 用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2m15％的浓缩胶，配方如下：

表8浓缩胶配方

组分 用量 30％丙烯酰胺溶液 0.33ml Tris-HCl(1.0M，pH6.8) 0.25ml 10％SDS 0.02ml 10％AP 0.02ml TEMED 0.002ml 灭菌ddH2O 补充至2ml

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳， 后用蒸馏水和1×蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

三、上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满l×蛋白电泳缓冲液，外槽中l×蛋白电 泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。 电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

四、蛋白质印迹

1.按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

2.预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶， 去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡 15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫， 再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相 同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡， 夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电 转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对 电泳槽的正极。

3.封闭：用1×TBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振 荡培养箱中进行封闭；

4.一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗(Anti-STK39antibody [EPR6394](ab128894))杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进 行杂交；

5.回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

6.弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(GoatAnti-RabbitIgG,HRP Conjugated(CW0103))杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；

7.弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

8.ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为 世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

9.以β-Actin作为内参进行数据标准化，以对照组滑膜组织中STK39作为参照 样本，计算实验组中STK39蛋白的相对表达水平。

五、实验结果

结果显示，37例骨性关节炎患者组中有13例阳性，9例对照组中有7例阳 性，STK39蛋白阳性率分别是35.13％和77.78，两组差异具有统计学意义。进一 步对骨性关节炎患者组内STK39蛋白表达和基因甲基化状态做相关性分析，结 果见图2，24例STK39蛋白表达阴性的患者里有22例都出现甲基化阳性，表明 STK39蛋白表达和基因甲基化呈负显著相关性。

表9骨性关节炎患者组内STK39蛋白表达和基因甲基化相关性分析