一种提高水稻抗干旱、盐害胁迫能力的内生烟曲霉及其应用

摘要

本发明公开了一种烟曲霉及其应用。该烟曲霉保藏名称为Aspergillus？fumigatus？SG17；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015年5月11日；保藏编号为M？2015286。本发明经实验证明，烟曲霉菌体能提高水稻的对干旱和盐害胁迫的抵抗能力，不仅可以提高水稻在上述非生物胁迫条件下的生长，同时为筛选具有新型抗胁迫活性物质的微生物奠定了良好的基础，具有很好的经济和社会效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一株内生烟曲霉及其应用，主要应用于水稻对干旱和盐害等非生物逆境胁 迫环境的耐受能力，实践证明该烟曲霉可以用于提高水稻对上述非生物胁迫因素的抗性。

背景技术

水稻(Oryzasativa)原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。世 界上近一半人口，都以大米为食，故水稻的种植与生产对国计民生有重要影响。

植物的内生菌是一类在植物生活史中的某一阶段生活于健康组织或器官内部的微生 物，近年来的研究表明，内生菌在协助寄主植物抵抗各种胁迫环境中扮演着十分重要的角 色，如病害、干旱、高盐等生物因素或非生物因素引起的氧化胁迫。由于自然界的内生真 菌的生物多样性极为丰富，提供了丰富多样的次生代谢产物及生物活性类物质，对工农业 生产、人类健康具有重要的价值，因而具有巨大的经济效益和社会效益。

烟曲霉属于半知菌类真菌，本菌主要存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，或 寄藏于种子上，能引起人、畜和禽类的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉铃和苹果等，引起 果实腐烂。本菌能产生烟曲棒麦角素(fumigaclavines)、烟曲霉震颤素(fumitremorgins)，烟 曲霉素(fumigillin)、烟曲霉毒素(fumitoxins)、疣孢青霉原(verruculogen)等多种次生代谢 产物，但关于烟曲霉对植物的促生作用，目前国内外还鲜有报道。

本发明从疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)根中分离得到一株内生烟曲霉，它能很 好地提高水稻对干旱及盐害的抗性，可服务于水稻的种植与生产。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17菌株，该烟曲霉 能很好地提高水稻的抗性，可用于水稻抗干旱和盐害胁迫方面，为开发优质的水稻提供了 新方向。

所述烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17是从疏花水柏枝(MyricariaLaxiflora)的根 中获得的内生真菌，于2015年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为： M2015286。保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17在PDA培养基上具有以下微生物学特 性：菌落开始为白色，经2-3日后转为蓝绿色，但边缘仍为白色，日久培养后变为深绿色、 烟绿色。初为绒状或絮状，随着时间的推移变为粉末状，边缘部分也出现颜色，背面无色 或带点黄褐色。仅上半部产圆筒形分生孢子，颜色为深浅不同的绿色，分生孢子梗光滑， 顶囊为烧瓶状。

本发明目的是提供一种用于提高水稻对干旱和盐害胁迫抗性的菌剂和生物改良剂， 其活性成分为烟曲霉SG17。胁迫试验表明，烟曲霉SG17能提高水稻的广谱抗性。本领 域技术人员很容易想到将本发明菌株的发酵液或发酵液提取物作为提高水稻抗性的有效 成分用于水稻抵抗干旱和盐害胁迫。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵产物的 生物改良剂。

本发明以烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17的DNA为模板，上游引物ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′，下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′， 进行菌落PCR扩增，获得560bp的18SrDNA部分序列(SEQIDNO：1)。通过Blast 与GenBank收录的序列进行比对，发现SG17与烟曲霉的同源性为100％。

附图说明

图1为本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17的菌落形态。

图2为本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17的显微形态。

图3为本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗干旱胁迫作用 效果。其中，A.胁迫前，B.干旱+SG17，C.干旱，D.干旱+脯氨酸，E.空白。脯氨酸溶液 浓度为5×10^-5mol/l空白为自来水。

图4为本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗盐害胁迫作用 效果。其中，F.胁迫前，G.盐害+SG17，H.盐害，I.盐害+脯氨酸，J.空白，脯氨酸溶液浓 度为5×10^-5mol/l空白为自来水。

具体实施方式

实施例一：烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17的分离和保存

2012年在三峡流域湖北宜昌境内胭脂坝采集疏花水柏枝根，表面消毒后接种于加工 作浓度为25μg/ml青霉素的PDA固体培养基分离真菌。

表面消毒：取疏花水柏枝根用自来水冲洗5次，无菌滤纸擦干后，75％酒精浸泡1min， 无菌水冲洗3次，再用3％次氯酸钠浸泡60S，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸洗干根 表面水分。

培养：用无菌剪刀将表面消毒后的根剪成0.5*0.5cm大小，接种于加工作浓度为 25μg/ml青霉素PDA固体培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、Ph6.0-6.5)， 置于28℃下培养。

菌株纯化：待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落接种于新的PDA固体培养基 中，置于28℃下培养。

菌株保藏：待菌株纯化后，挑取纯菌株接种于PDA斜面培养基，28℃培养4d，用 灭菌的液体石蜡封藏于4℃保藏。

将该菌株烟曲霉(Aspergillusfumigatus)进行保藏，保藏名称为SG17；保藏单位： 中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015年5月 11日；保藏编号为，M2015286。

实施例二：烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17鉴定

菌株的形态特征和显微特征见附图1.。

18SrDNA序列分析：采用通用引物进行菌落PCR扩增18SrDNA序列。上游引物 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′，下游引物ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应体系如下：

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火30sec，72℃延伸1.min， 33个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑取750bp左 右的条带进行凝胶回收，送上海生工测序。

将测得的序列提交至GenBank，并获得登录号KR812470。

实施例三：烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17菌体的制备

菌体制备：取保存4℃冰箱的烟曲霉种划线接种于PDA平板中，28℃下，培养4d， 获得菌体。

发酵液制备：用打孔器在上述菌落培养基平板上打取1个菌饼置于含100mlPDA液 体培养基的500ml的三角锥形瓶中，摇匀，然后置于28℃摇床振荡培养(120rpm)， 获得发酵液。

实施例四：烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗干旱胁迫能力作用

水稻幼苗制备：将从4℃冰箱中取出的日本晴种子置于自来水中浸泡4d，促使其生 根发芽，并每隔12h更换一次水。4d后将其种植在盛装有土壤的塑料杯中，定期浇水， 7d后即可获得水稻日本晴幼苗。

干旱胁迫试验：将发酵液超声波破壁2h后加入到日本晴幼苗中得到实验组，用5× 10^-5mol/l脯氨酸溶液代替发酵液为正对照组，自来水为空白组，不补充任何物质为干旱胁 迫，每组做三个平行，将上述幼苗放置25-30℃的室温下培养。胁迫开始前一天向各幼苗 充分浇水，在胁迫期间只定量向空白组补充水分，共胁迫12天。

实施例五：水稻干旱胁迫后幼苗生理指标检测

丙二醛含量：植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂质过氧化作用密切相 关，膜脂质过氧化的产物有脂质过氧化物、丙二醛、乙烷等，其中丙二醛是最重要的产物 之一。因此可通过测定丙二醛含量了解膜脂质过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度 以及植物的抗逆性。利用南京建成生物工程研究所的植物丙二醛测定试剂盒测定丙二醛含 量。

脯氨酸含量：在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低；但在逆 境条件下，植物体内游离脯氨酸的含量可显著增加。脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶 体及组织内的代谢过程。因此，游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性的指标。利用南京建 成生物工程研究所的脯氨酸测试盒测定脯氨酸含量。

干旱胁迫后丙二醛及脯氨酸的检测结果

表一干旱后水稻丙二醛含量

表二干旱后水稻脯氨酸含量

表1.2中的正对照是为5×10-5mol/l脯氨酸溶液，空白为自来水。

实施例六：烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗盐害胁迫能力作用

水稻幼苗制备：将从4℃冰箱中取出的日本晴种子置于自来水中浸泡4d，促使其生 根发芽，并每隔12h更换一次水。4d后将其种植在盛装有土壤的塑料杯中，定期浇水， 7d后即可获得水稻日本晴幼苗。

盐害胁迫试验：将发酵液超声波破壁2h后加入到日本晴幼苗中得到实验组，用5× 10^-5mol/l脯氨酸溶液代替发酵液为正对照组，自来水为空白组，不补充任何物质为干旱胁 迫，每组做三个平行，将上述幼苗放置25-30℃的室温下培养。胁迫开始前一天向实验组 及正对照组中充分加入7.5g/LNaCl溶液，在胁迫期间定量向各幼苗补充水分，共胁迫12 天。