重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白，氨基酸序列SEQ？ID？NO.1，其是通过大肠杆菌表达系统进行原核表达和纯化得到。本发明还公开了该重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，其包括ESAT6-CFP10融合蛋白表达菌株的构建以及ESAT6-CFP10融合蛋白的表达与纯化。本发明将蛋白ESAT6和CFP10融合在一起，通过原核表达系统表达了重组蛋白ESAT6-CFP10，该重组蛋白可用于结核菌潜伏感染人群的筛查以及结核病的辅助诊断，克服了通用的特异性γ-IFN检测方法价格昂贵、设备及操作人员要求高的缺点，使用方便、易于推广、适合于大规模普及。

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白及其制备方法，该蛋白为 大肠杆菌表达系统原核表达所得，可用于结核菌潜伏感染人群的筛查和结核病的辅 助诊断。

背景技术

我国是世界上22个结核高负担国家之一，据全国第四次结核病流行病学调查的 数据，全国受结核菌感染人数超过4亿。流行病学分析显示，在感染了结核杆菌的 人群中有10％的人结核发病率较高。因此，如何早期发现高危人群并给予预防是结 核病控制的重要问题，而其中寻找能诊断和确定患者体内是否留有存活结核杆菌应 该是实现的关键。目前结核病诊断主要依靠胸部X光片、涂片镜检、血清学检查等， 这些检查手段均难做到大规模普查和早期发现。PPD(结核杆菌精制蛋白衍生物)皮 肤试验虽可用于结核病的大规模普查，但PPD包含的抗原为结核分枝杆菌、非致病 性分枝杆菌及BCG所共有，因而不能区分BCG接种、非致病性分枝杆菌感染和结核 杆菌感染，更不能鉴别结核菌感染者体内有无存活的结核杆菌；而卡介苗在世界范 围内广泛接种。因此，寻找能区别卡介苗接种还是结核菌感染、结核菌感染者体内 有无存活结核杆菌的诊断方法非常重要。

目前对于结核菌潜伏感染患者的诊断手段主要有结核菌素蛋白衍生物(PPD) 及特异性γ-IFN检测，但PPD不能有效区分卡介苗接种与结核分枝杆菌菌感染，更 不能鉴别结核菌感染者体内有无存活的结核杆菌；特异性γ-IFN检测费用昂贵、检 测技术高等实际问题，难以在结核病高发的发展中国家实施。所以，研发一种特异 性强、价格合理、方便使用的结核菌潜伏感染用诊断试剂，是预防和治疗的前提。

结核分枝杆菌早期分泌性低分子量蛋白ESAT6，能诱导机体产生明显的T细胞 免疫应答和释放高水平IFN-γ。ESAT6蛋白具有良好的抗原刺激性并能被大多数结 核病患者所识别。另一种低分子量结核杆菌培养滤液蛋白CFP10与ESAT6同属于 ESAT6家族，也是免疫优势抗原，能诱导机体产生免疫应答。

以结核菌生长过程中早期分泌的特异性ESAT6、CFP10蛋白为研究对象，研制 一种特异性强、价格合理、方便使用的结核菌潜伏感染用诊断试剂，是近年来国内 外研究重点。研究文献资料结果显示，无论是结核病的体外诊断还是皮肤试验，联 用两种或两种以上抗原的诊断效果均好于单一抗原。专利CN200710062693.7公开了 一种ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用，该试剂盒中包含有关键试剂 CFP10-ESAT6融合蛋白，该试剂盒可通过对采集的血液样本进行检测以确定是否有 结核菌感染情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白及其制备方法，为 结核菌感染人群筛查、结核病流调提供一个稳定、安全、有效、经济、易行的措施。

本发明所提供的重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白，氨基酸序列SEQID NO.1，核苷酸序列SEQIDNO.2，其是通过大肠杆菌表达系统进行原核表达和纯化 得到。

本发明所提供的重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，包括 ESAT6-CFP10融合蛋白表达菌株的构建以及ESAT6-CFP10融合蛋白的表达与纯化。

上述所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法中，所述 ESAT6-CFP10融合蛋白表达菌株的构建包括：(1)基因ESAT6和基因CFP10的引 物设计、合成及扩增；(2)pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的构建；(3)大肠杆 菌BL21的转化。

上述所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法中，所述步骤(1)， 基因ESAT6的上游引物序列SEQIDNO.3、下游引物序列SEQIDNO.4；基因CFP10 的上游引物序列SEQIDNO.5、下游引物序列SEQIDNO.6。

上述所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法中，步骤(2) pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的构建是先以pET-30a质粒和ESAT6基因构建 pET-30a-ESAT6重组质粒，再以pET-30a-ESAT6重组质粒和CFP10基因构建 pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒。

上述所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法中，所述以pET-30a 质粒和ESAT6基因构建pET-30a-ESAT6重组质粒的方法为：用KpnⅠ及NdeⅠ限制 性内切酶分别对pET-30a质粒和ESAT6基因进行双酶切，回收双酶切产物并置于 PCR仪上，16℃，连接2小时，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取单克隆菌 落进行PCR鉴定和重组质粒的测序分析，确定阳性克隆；所述以pET-30a-ESAT6 重组质粒和CFP10基因构建pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的方法为：用KpnⅠ及 EcoRⅠ限制性内切酶分别对pET-30a-ESAT6重组质粒和CFP10基因进行双酶切，回 收双酶切产物并置于PCR仪上，16℃，连接2.5小时，转化入大肠杆菌DH5α感受 态细胞，选取单克隆菌落进行PCR鉴定和重组质粒的测序分析，确定阳性克隆。

上述所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法中，ESAT6-CFP10 融合蛋白的表达与纯化是通过IPTG诱导表达重组大肠杆菌，菌体破碎离心后上清 液通过SOURCE30Q离子交换柱层析进行纯化，并对纯化后的蛋白进行相关鉴定和 分析。

上述所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法中，步骤(3)大肠 杆菌BL21的转化是将pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受 态细胞，经PCR、测序筛选阳性转化子。

本发明所提供的重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白，可在制备用于结核菌潜 伏感染人群的筛查和结核病的辅助诊断试剂中应用。

本发明所述大肠杆菌原核表达的ESAT6-CFP10融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。该蛋白经过PCR分别扩增出具有NNNⅠ、KpKⅠ酶切位点的ESAT6 片段及具有KpKⅠ、EEoRⅠ酶切位点的CFP10片段，通过酶切、连接、转化构建重 组质粒pET30a-ESAT6-CFP10，将该质粒转化入大肠杆菌DH5α，经PCR、测序分析 筛选出阳性克隆；将扩增后的重组质粒转化大肠杆菌BL21，经PCR、测序及蛋白 表达分析筛选阳性转化子；IPTG诱导表达重组大肠杆菌BL21。发酵菌体高压均质 破碎后离心所得上清液通过离子交换层析和凝胶层析进行纯化，纯化后的蛋白经鉴 定为ESAT6-CFP10融合蛋白。

本发明以TB-PPD(结核菌素纯蛋白衍生物)、PPD-B(胞内分枝杆菌纯蛋白衍 生物)和重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白等不同变态反应原对分别建立的结核分枝 杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌以及卡介菌活菌致敏的豚鼠模型进行迟发型超敏反应 试验(即皮肤试验)，于注射后24h、48h观察局部硬结的纵径与横径，根据48h的 反应结果进行判定，平均硬结反应直径(纵径与横径相加除以2)不小于5mm判为 阳性，小于5mm判为阴性。结果显示：重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白对卡介菌 活菌致敏豚鼠和结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试均呈阴性反应，而对结核分枝杆 菌活菌致敏豚鼠的皮试呈阳性反应；TB-PPD和PPD-B对卡介菌活菌、结核分枝杆 菌活菌和结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试均呈阳性反应。ESAT6-CFP10融合蛋白 能够区别卡介苗接种还是结核菌感染以及结核菌感染者体内有无存活结核杆菌。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：将结核分枝杆菌早期分泌性低分子量 蛋白ESAT6和CFP10融合在一起，通过原核表达系统表达了重组蛋白 ESAT6-CFP10，该重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白在2～8℃环境下保存24个月均 未出现降解，安全稳定，同时本发明的重组结合杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白还克服 了单个蛋白由于分子量太小不易纯化的缺点，可经皮肤试验用于识别检测是否结核 菌潜伏感染。动物学实验显示，重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白有望用于结核菌潜 伏感染人群的筛查以及结核病的辅助诊断。同时克服了通用的特异性γ-IFN检测方 法价格昂贵、设备及操作人员要求高的的缺点，具有使用方便、易于推广、适合于 大规模普及的特点。

附图说明

图1是目的基因ESAT6扩增产物电泳图；

其中，1：DNAMarkNr(DL-2,000)，2-4：ESAT6目的基因产物。

图2是目的基因CFP10扩增产物电泳图；

其中，1：DNAMarkNr(DL-2,000)，2：CFP10目的基因产物。

图3是pET-30a-ESAT6重组质粒目的基因电泳图；

其中，1：DNAMarkNr(DL-2,000)，2-7：分别为pET-30a-ESAT6-1、2、3、4、5、 6重组质粒的菌落PCR反应产物。

图4是质粒pET-30a-ESAT6-CFP10转化DH5α菌落PCR电泳图；

其中，1：DNAMarkNr(DL-2,000)，2-7：分别为pET-30a-ESAT6-CFP10-1、2、3、 4、5、6重组质粒的菌落PCR反应产物。

图5是pET-30a-ESAT6-CFP10质粒转化BL21菌落的PCR电泳图；

其中，1：DNAMarkNr(DL-2,000)，2-7：分别为pET-30a-ESAT6-CFP10-BL21-1、 2、3、4、5、6重组质粒的菌落PCR反应产物。

图6是ESAT6-CFP10融合蛋白诱导表达电泳图；

其中，1-3：pET-30a-ESAT6-CFP10-BL21菌落1、2、3诱导表达目的蛋白，4： pET-30a-ESAT6-CFP10-BL21菌落阴性对照(未诱导)，5：蛋白MarkNr。

图7是凝胶层析后的高纯度ESAT6-CFP10融合蛋白SDS-PAGE图；

其中，01：蛋白MarkNr，02：ESAT6-CFP10融合蛋白。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释， 但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应 当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范 围。

实施例1：ESAT6-CFP10融合蛋白表达菌株的构建和鉴定

1.目的基因ESAT6、CFP10的引物设计、合成及扩增

根据GNKNBaKk中查找目的蛋白基因序列，用Oligo6.0软件设计引物， ESAT6-CFP10的ESAT6的上游引物为P1、下游引物为P2；CFP10的上游引物为P3、 下游引物为P4。其中P2删除终止密码TGA；P3删除起始密码ATG；P1、P2、P3、 P4相应添加了DNA限制性内切酶酶切位点，酶切位点(划线部分)分别是P1(NdeⅠ)、 P2(KpnⅠ)、P3(KpnⅠ)、P4(EcoRⅠ)，在酶切位点的5'端分别添加相应的保护碱基。 引物序列如下表：

备注：下划线分别为内切酶的酶切位点，斜体部分为起始密码子。

以中国食品药品检定研究院提供的结核分枝杆菌标准株H₃₇RvDNA为模板，建 立ESAT6基因的PCR扩增体系：

PCR扩增条件：96℃预变性3分钟，96℃变性45秒、62℃退火45秒、72℃延 伸1分钟，共30次循环，72℃延伸7分钟。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测 扩增效果，结果如图1所示。

以中国食品药品检定研究院提供的结核分枝杆菌标准株H₃₇RvDNA为模板，建 立CFP10基因的PCR扩增体系：

PCR扩增条件：95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟、60℃退火1分钟、72℃ 延伸1分钟，共30次循环，72℃延伸5分钟。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检 测扩增效果，结果如图2所示。

2.pET-30a-ESAT6重组质粒的构建

用KpnⅠ及NdeⅠ限制性内切酶分别对pET-30a质粒和ESAT6基因进行双酶切， 双酶切的反应体系如下：

按上述反应体系加样，然后将反应管置PCR扩增仪上，37℃酶切2小时。

用试剂盒回收双酶切产物，回收后的双酶切纯化产物置于PCR仪上，16℃，连 接2小时，转化入大肠杆菌DH5α感受态。选取6个单克隆菌落进行PCR鉴定和重 组质粒的测序分析，确定图3中泳道2和3所代表的单克隆菌落为阳性克隆。结果 如图3所示。

3.pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的构建

用KpnⅠ及EcoRⅠ限制性内切酶分别对pET-30a-ESAT6质粒和CFP10基因进 行双酶切，双酶切反应体系如下：

按上述反应体系加样，然后将反应管置PCR扩增仪上，37℃酶切2.5小时。

用试剂盒回收双酶切产物，回收后的双酶切纯化产物置于PCR仪上，16℃，连 接2.5小时，转化大肠杆菌DH5α感受态。选取6个单克隆菌落进行PCR鉴定和重 组质粒的测序分析，确定阳性克隆。PCR鉴定结果如图4所示泳道2，3，4，6，7 所代表的单克隆菌落为阳性克隆。

4.大肠杆菌BL21的转化与鉴别

取一只BL21感受态细胞与5μlpET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒混合，冰浴30 分钟，42℃热激90秒，取出冰浴1～2分钟，加入160μlSOCMNNia，置摇床中，37℃、 200rpm、1h，3000～4000rpm、室温离心1分钟，吸120μl上清弃去，将离心沉淀的 菌体轻轻吹打混匀，吸50μl菌液于含KaK(40μg/ml)的LB固体培养基上，用灭菌 的涂布棒将菌体涂布均匀。将平皿正放于37℃孵箱中，1～2小时，待液体全部吸收 后，倒置培养12小时。选取6个单克隆菌落用P1和P4引物进行PCR鉴定、重组 质粒测序分析、目的蛋白诱导表达，确定阳性克隆，获得重组结核杆菌ESAT6-CFP10 的菌种。选取图5中PCR扩增目的基因较高的泳道2,3,4所代表的3个单克隆作为 研究对象，测序，再分别进行目的蛋白的诱导表达培养，最终通过图6确定泳道2 所代表的单克隆作为阳性克隆。

实施例2：目的蛋白的表达与纯化

1.ESAT6-CFP10融合蛋白制备过程中，ESAT6的终止子和CFP10的起始密码 子换成了限制性内切酶KpnⅠ的粘性末端GGTACC。因此重组结核杆菌 ESAT6-CFP10蛋白DNA序列是通过限制性内切酶KpnⅠ的粘性末端融合而成，不 含有连接子，ESAT6和CFP10两个蛋白连接处的氨基酸序列是GlyThr(GGTACC)， ESAT6-CFP10融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO.1。

2.目的蛋白的诱导表达

取一管重组结核杆菌ESAT6-CFP10的菌种经二级扩大培养制备2L发酵用种子 液，将该种子液以5％的接种比例入含有20LM9培养基的发酵罐中，37℃，pH7.0， DO20-30％，菌体湿重达到0.1g/mL时，加入0.8M的IPTG诱导表达培养8h，发酵 结束后8000rpm，离心5分钟收集菌体。

3.菌体的破碎

PB缓冲液彻底重悬上述发酵菌体后，8000rpm，离心30分钟，弃去上清，留取 沉淀。离心获得的沉淀再次完全重悬后，用高压均质破碎菌体。菌体破碎后，8000rpm， 离心30分钟，弃去沉淀，留取上清。

4.目的蛋白的纯化

采用AKTA蛋白纯化系统对上清液进行SOURCE30Q离子交换柱层析，具体操 作如下：A液：20mMPB缓冲液，pH7.00；B液：1M氯化钠的20mMPB缓冲液， pH7.00。用A液平衡层析柱，平衡流速4ml/miK。待A液冲洗至基线平后上样，上 样结束后继续用A液冲洗至基线平。用0～100％B液进行直线梯度洗脱，洗脱流速 4ml/miK，在280Km紫外检测下收取第一个蛋白吸收峰。层析后纯化样品进行 SDS-PAGE纯度分析，最终目的蛋白的纯度达到95％以上，结果如图7所示。

试验例3：重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白的迟发型超敏反应试验

以TB-PPD(结核菌素纯蛋白衍生物，50IU/ml，中国食品药品检定研究院)、 PPD-B(胞内分枝杆菌纯蛋白衍生物，0.4mg/支，中国食品药品检定研究院)和重组 结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白(250μg/0.5ml/支)等三种不同变态反应原对分别建立的 结核分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌以及卡介菌活菌致敏的豚鼠模型进行迟发型 超敏反应试验(即皮肤试验)，于注射后24h、48h观察局部硬结的纵径与横径(纵 径×横径)，根据48h的反应结果进行判定，平均硬结反应直径(纵径与横径相加除 以2)不小于5mm判为阳性，小于5mm判为阴性。PPD-B和ESAT6-CFP10蛋白临用时 分别采用临用时用含0.0005％吐温-80及3.0g/L苯酚的pH7.2～7.4的0.01mol/L的PBS 缓冲液稀释蛋白至5μg/ml。

3.1.结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试反应结果见表1，TB-PPD、 ESAT6-CFP10蛋白、PPD-B对结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试均呈阳性反应。

表1结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠48h的皮试反应结果

3.2卡介菌活菌致敏豚鼠的皮试反应结果见表2，TB-PPD、PPD-B对卡介菌 活菌致敏豚鼠的皮试均呈阳性反应，而ESAT6-CFP10蛋白对卡介菌活菌致敏豚鼠的 皮试均呈阴性反应。

表2卡介菌活菌致敏豚鼠48h的皮试反应结果

3.3结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试反应结果见表3，TB-PPD、PPD-B对 结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试均呈阳性反应，而ESAT6-CFP10蛋白对结核分枝 杆菌死菌致敏豚鼠的皮试均呈阴性反应。

表3结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠48h的皮试反应结果

以上结果表明：重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白对卡介菌活菌致敏豚鼠和结 核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试均呈阴性反应，而对结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的 皮试呈阳性反应；TB-PPD和PPD-B对卡介菌活菌、结核分枝杆菌活菌以及结核分 枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试均呈阳性反应。可见，重组结核杆菌ESAT6-CFP10蛋白 有望成为结核菌潜伏感染人群的筛查及结核病辅助诊断的一种变态反应原。