重组结核杆菌融合蛋白(EC)的稳定性与有效性研究

摘要

目的 考察重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,“EC”为重组融合蛋白“结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)”](以下简称“EC”)原液的储存稳定性、成品储存及使用的稳定性与有效性.方法 (1)原液储存稳定性研究:将3批次EC原液储存于-70℃,观察0～36个月,保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行致敏效应试验、鉴别试验、效价检测,以及等电点、分子量、蛋白质含量、纯度(电泳法)等检测,其中致敏效应试验用豚鼠分为试验组(注射EC原液)与对照组(注射稳定剂),观察注射后动物反应,两组动物反应应无差异;鉴别试验为卡介苗致敏后豚鼠分别皮内注射EC原液和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,EC原液皮肤试验应呈阴性反应(硬结或红晕平均直径＜5 mm),而TB-PPD皮肤试验应呈阳性反应(硬结平均直径≥5 mm);效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后6只豚鼠分别皮内注射3个稀释度的EC原液及参考品,观察测量豚鼠皮肤试验检测结果,不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验局部反应的硬结或红晕平均直径总和的比值(以下简称“平均直径总和比值”)应为1.0±0.2;等电点应为3.5～5.3,分子量应为(23±2.0)kDa(1 kDa的相对分子质量为1000),蛋白质含量应不低于450.0 μg/ml,纯度(电泳法)应不低于95.0％.(2)EC成品储存稳定性研究:成品分别储存于37℃和2～8℃,分别观察0～28 d和0～36个月,37℃保存0、7、14、21、28 d时、2～8℃保存0、3、6、9、12、18、24、36个月时取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、苯酚含量等检测,其中鉴别试验方法及检测结果判定如“EC原液”.效价检测为结核分枝杆菌活菌致敏后4只豚鼠分别皮内注射EC成品及参考品,观察测量方法及平均直径总和比值判定如“EC原液”,pH值应为6.8～7.4,苯酚含量应不高于3.0 g/L.(3)EC成品使用稳定性研究:成品开启后分别放置于温度(25±2)℃、湿度(60±5)％和温度(40±2)℃、湿度(75±5)％两种条件考察使用过程的稳定性,观察时间为0～50 min,分别于0、10、20、30、40、50 min取样进行鉴别试验、效价检测,以及pH值、渗透压摩尔浓度等检测,试验方法和检测结果判定如“EC成品”,其中渗透压摩尔浓度应为(280.0±68.0)mOsmol/kg.依据定期取样检测结果是否符合EC质量标准来判断产品稳定性,并为制定EC原液、成品有效期和成品使用时的有效时间提供依据.结果 (1)EC原液-70℃观察0～36个月,在各研究时间点,致敏效应试验均表现为试验组与对照组动物反应无差异;鉴别试验结果为EC原液皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果为不同稀释度的EC原液与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9～1.1;等电点为3.7～5.2;分子量为(23.2～24.2) kDa;蛋白质含量为(501.6～616.7) μg/ml,纯度(电泳法)均为100.0％.(2)EC成品稳定性研究:在各研究时间点,鉴别试验结果为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值为0.9～1.0;pH值为7.1～7.4、苯酚含量为(2.6～2.9) g/L.(3)EC成品使用稳定性研究结果:在各研究时间点,鉴别试验结果均为EC成品皮肤试验呈阴性,而TB-PPD皮肤试验呈阳性;效价检测结果显示EC成品与参考品皮肤试验的平均直径总和比值均为1.0;pH值为7.1～7.2;渗透压摩尔浓度为(302.4～307.4)mOsmol/kg.结论 EC原液-70℃储存36个月质量稳定;成品37℃储存28 d、2～8℃储存36个月质量稳定;成品在开启后50min内使用,质量稳定.