基于垂直有序胶束富集的电化学检测牛奶中抗生素的方法

摘要

本发明公开了一种基于垂直有序胶束富集的电化学检测牛奶中抗生素的方法，其特征在于，包括：首先将牛奶用电解质溶液稀释作为检测溶液，然后以垂直有序CTAB胶束修饰的电极作为工作电极，采用电化学伏安法，对牛奶溶液中的抗生素先富集后进行检测。本发明以垂直有序胶束修饰的电极为工作电极，通过疏水作用，水溶液中疏水、电中性的抗生素被萃取/富集到表面活性剂胶束的疏水纳米腔中，以抗生素的还原峰电流为检测信号，从而实现在牛奶的复杂背景下的定量检测。本发明构建的传感器将预富集和电化学检测于一体，灵敏度高、检测线性范围宽、检测限低，在食品安全监测领域具有较大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于电化学传感领域，尤其涉及一种牛奶中抗生素的检测方 法。

背景技术

当前社会食品安全引起了人们的广泛关注，其中乳品安全问题是一大 焦点，探索快速、准确、便捷、灵敏的分析方法成为乳制品质量安全研究 的重点方向之一。抗生素是一类具有抑制细菌生长或杀死细菌的物质，被 作为动物药物和饲料添加剂而广泛应用。研究表明，牛奶中抗生素的残留 对人体有严重的危害，如产生过敏反应、产生耐药性菌株、造成人体肠道 内的菌群失调等。目前，美国、欧盟和日本等国家已对原料奶中抗生素的 最大残留量作了明确的规定，最大残留量为4μg/kg。因此，牛奶中抗生 素的快速、高灵敏检测是严格控制防止食品中非法添加抗生素、保障消费 者健康权益的重要工作，同时拓展了对生理和病理的研究。

迄今为止，研究者利用各种技术分析检测牛奶中的抗生素，如微生物 检测法、气相色谱法、液相色谱法、免疫分析法、电化学法等。其中，电 化学法由于具有灵敏度高、价格低廉、操作简单等优点，而受到研究者们 的青睐。分子印迹聚合物、纳米粒子、碳纳米管等纳米材料可修饰在电极 上，用于富集抗生素，提高检测性能。

另外，专利文献报道的方法主要有：申请号为200410013741.X的中 国专利文献报道了一种用pH计检测牛奶中抗生素的方法。其采用将乳酸 菌接种于奶样中利用用pH计在一定时间间隔内测定奶样中的pH值，通 过pH值的变化，来确定是否含有抗生素。申请号为201310069037.5的专 利文献报道了一种基于纳米金的可视化快速检测牛奶中抗生素的方法，其 利用邻苯二酚紫还原氯金酸来制备纳米金。在纳米金合成的过程中因抗生 素的加入影响了纳米金的合成，使其颜色发生变化，利用肉眼和紫外可见 吸收光谱仪可以对抗生素进行定量检测。上述这些方法，是通过检测间接 参数确定是否含有抗生素，检测准确度低，且容易受外界调节影响。

介孔二氧化硅(SiO₂，孔径2-50nm)是由孔径高度均一并呈周期性排布 的纳米孔道及其周围无定形的二氧化硅组成。近年来，研究者采用电化学 辅助自组装(Nat.Mater.2007,6,602-608)和溶液生长(Angew.Chem. Int.Ed.2012,51,2173-2177)等方法，诱导表面活性剂分子自组装和有机硅 烷分子水解/缩聚反应的协同发生，在固体表面成功地制备了高度有序排列 且通道垂直于表面的SiO₂纳米通道薄膜。该薄膜具有十分优异的性能： 超薄且厚度可调(20-200nm)，孔径大小和孔道分布高度均匀，孔隙率极高 (可达7.5×10¹²cm^-2)，优良的机械、化学、热稳定性和生物相容性，而且 成本低、可较大面积批量制备，是一种理想的分子识别和分离的纳米通道 薄膜，在催化、吸附、分析、传感等领域具有巨大的应用潜力。此法中， 在合成垂直有序介孔二氧化硅的同时，模板分子即表面活性剂十六烷基三 甲基溴化铵(CTAB)均匀排布在介孔二氧化硅的孔道内部，形成垂直有序胶 束。在每个胶束中，CTAB的带电极性基团朝外，而烷基链通过疏水作用 聚集在一起形成一个疏水纳米腔。通过疏水作用，水溶液中疏水、电中性 的电化学活性有机小分子可以被萃取/富集到表面活性剂胶束的纳米腔中， 并在胶束/电极界面发生电化学氧化或还原。

发明内容

本发明提供了一种基于垂直有序胶束富集的电化学检测牛奶中抗生 素的方法，该方法检测灵敏度高。垂直有序CTAB胶束对牛奶中的抗生素 具有吸附作用，可以提高抗生素在胶束内的浓度，从而提高抗生素的电化 学检测性能。

本发明所提出的牛奶中抗生素的电化学检测方法的具体步骤如下：

首先将牛奶用电解质溶液稀释作为检测溶液，然后以垂直有序 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)胶束修饰的电极作为工作电极，采用电化学 伏安法，对牛奶溶液中的芳香硝基抗生素先富集后进行检测。

本发明采用电化学伏安法，以垂直有序胶束修饰的电极为工作电极， 铂电极和银/氯化银分别为对电极和参比电极，对牛奶中抗生素进行快速检 测。

作为优选，所述电解质溶液选自氯化钠水溶液、硫酸钠水溶液、氯化 钾水溶液、磷酸缓冲溶液、醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的一种；进一步优选 为氯化钠水溶液或磷酸缓冲溶液。所述电解质溶液浓度为0.02～0.5mol/L， 进一步优选为0.08～0.2mol/L；所述电解质溶液的pH值为6～8；进一步优 选为6～7。作为优选，可在检测之前，向电解质溶液中通入惰性气体、氮 气等，以排除电解质溶液中氧气对检测的干扰；通入惰性气体、氮气等时 间可根据实际需要确定，一般3～30分钟即可。作为优选，牛奶的稀释倍 数为1～100倍，进一步优选为5～10倍。

作为优选，所述工作电极选自氧化铟锡(ITO)电极、氟掺杂氧化锡 (FTO)电极、金电极、玻碳电极(GCE)或丝网印刷电极中的一种；进一步 优选为氧化铟锡(ITO)电极。

作为优选，所述垂直有序CTAB胶束修饰的电极可采用现有的方法制 备得到，例如，可由下述两种方法制备得到：

第一种方法，溶液生长法：具体步骤为将工作电极放入CTAB、 水、乙醇、氨水和TEOS所组成的溶液中，40～70℃下静置生长3–48小 时。

第一种制备方法中，以1gCTAB计算，需要加入的水、乙醇、氨水、 TEOS的体积分别为400～550ml、150～200ml、50～80μL、450～550μL。

第二种方法，电化学辅助自组装法：具体步骤为将工作电极放入 CTAB、TEOS、水、乙醇、硝酸钠和盐酸所组成的溶液(事先搅拌1～3小 时)，施加恒电流密度-0.1mAcm^-2～-1mAcm^-2生长3–30秒。

第二种制备方法中，以1gCTAB计算，加入的TEOS、水、乙醇、硝 酸钠、盐酸的量分别为：1.5～2.0g、10～15ml、10～15ml、0.08～0.15g、2～3μL。

所述垂直有序CTAB胶束修饰的电极中，介孔二氧化硅的孔径为2～3 nm；自上而下依次包括垂直介孔二氧化硅层，电极基底层和玻璃层。垂直 介孔二氧化硅层的厚度为20～200nm，进一步优选为80～120nm。

作为优选，所述富集方法为搅拌富集或恒电位富集。搅拌富集为机械 搅拌0～20min；进一步优选为8～15分钟；所述恒电位富集为-1.0～0.4V条 件下富集0～20min；进一步优选的恒电位富集条件为-0.5～0V电位下富集 25～35s。

作为优选，所述芳香硝基抗生素为氯霉素、呋喃妥因中的一种或者两 种。所述芳香硝基抗生素在牛奶中的含量为0.4～50ppm，在该含量范围内， 采用本发明方法，均具有较高的精确度。

本发明以垂直有序胶束修饰的电极为工作电极，通过疏水作用，水溶 液中疏水、电中性的抗生素被萃取/富集到表面活性剂胶束的疏水纳米腔 中，以抗生素的还原峰电流为检测信号，从而实现在牛奶的复杂背景下的 定量检测。本发明构建的传感器将预富集和电化学检测于一体，灵敏度高、 检测线性范围宽、检测限低，在食品安全监测领域具有较大的应用潜力。

相对于现有技术，本发明的有益效果具体体现在：

1、本发明采用电化学辅助自组装和溶液生长方法所制备的垂 直有序介孔二氧化硅作为硬模板，在电极表面支撑高度有序排列的圆柱形 CTAB胶束，每个胶束均与基底电极表面有效接触，有利于传质，拓展了 其在分析传感中的应用空间。

2、垂直有序CTAB胶束的硬模板介孔二氧化硅的孔径在2～3nm，具 有尺寸选择性，可以排阻尺寸大于胶束直径的分子进入到电极表面。因此， 可以实现对抗生素的选择性富集。

3、该方法检测迅速，只要数秒即可得到检测结果。

4、该方法无需对牛奶进行预处理，电极抗污染和抗干扰性好，灵敏 度高。

5、本发明的检测方法可以拓展到对其他疏水、中性的电化学活性有 机小分子的灵敏检测，如环境污染物、农药、爆炸物、抗氧化剂等。

附图说明

图1为本发明实施例1中牛奶稀释后的待检测溶液。

图2为本发明实施例1中垂直介孔二氧化硅的透射电镜图(俯视图(a)、 截面图(b))和扫描电镜图(c)。

图3为本发明实施例1中裸ITO电极(a)、垂直有序CTAB胶束修饰 的ITO电极(b)和垂直有序介孔二氧化硅修饰的ITO电极(c)在含有5ppm 氯霉素的牛奶溶液中的差示脉冲伏安曲线。

图4为本发明实施例1中垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极在不 同扫速下的循环伏安图(a)和峰电流与扫速平方根的线性关系图(b)。电解质 溶液为含有10ppm氯霉素的牛奶溶液。扫描速率分别为10、50、100、150、 200mV/s。

图5为本发明实施例1中垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极在含 有不同浓度氯霉素的牛奶中的差示脉冲伏安曲线。

图6为本发明的中垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极的结构示意 图。

图7为本发明的电化学伏安法的检测装置图。

具体实施方式

实施例1

使用垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极，检测牛奶中氯霉素的电 化学过程：

(1)用0.1mol/L、pH值为6的氯化钠水溶液将直接超市购买的牛奶 稀释10倍，作为待检测溶液，如图1所示。在该待测溶液中通入氩气， 以排除溶液中的氧气的干扰。采用简单的三电极系统，如图7所示，垂直 有序CTAB修饰的ITO电极、铂电极及银/氯化银电极分别作为工作电极、 对电极和参比电极。

(2)将氯霉素溶于无水乙醇中配置成储备液，在待测溶液中加入不同 体积的氯霉素储备液得到一系列待测溶液(氯霉素的浓度分别是0.4ppm， 0.7ppm，1ppm，2ppm，3ppm，5ppm，7ppm，10ppm，15ppm，20ppm， 30ppm，35ppm)，搅拌10s后进行差示脉冲伏安测试。

垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极的制备方法为溶液生长 法，具体步骤如下：

将ITO电极放入0.16gCTAB、70mL水、30mL乙醇、10μL氨水 和80μLTEOS所组成的溶液中，60℃下静置生长24小时。

由上述方法制备得到的垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极的电镜 图为图2。

图2所示垂直有序介孔二氧化硅(实际上检测的为垂直有序CTAB胶 束修饰的ITO电极，垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极在做电镜的时 候需要分散在乙醇中，CTAB在乙醇中会溶解在乙醇中)的透射电镜图俯 视图，图2(a)中，白色亮点即为孔，也就是CTAB胶束所处位置，可以 看出介孔二氧化硅的孔径为2～3nm；透射电镜的截面图表明孔道的有序 性(图2中(b))，从扫描电镜图中可以清晰地看到三层(图2中(c))， 从上至下分别为垂直介孔二氧化硅层，ITO层和玻璃层，且垂直介孔二氧 化硅层的厚度为95nm。

图3为裸ITO电极(a)、垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极(b)和垂 直有序介孔二氧化硅修饰的ITO电极(c)在含有5ppm氯霉素的牛奶中的 差示脉冲伏安曲线，可以看出，垂直有序介孔二氧化硅修饰ITO电极和裸 ITO电极上几乎观察不到氯霉素的还原峰电流，而垂直有序CTAB胶束修 饰的ITO电极上还原峰明显而尖锐，证明存在于介孔二氧化硅孔道中的 CTAB胶束在氯霉素的检测中起到了富集作用，有效提高电极表面分析物 浓度，从而增强了检测的灵敏度。

图4为垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极在不同扫速(扫描速率 分别为10、50、100、150、200mV/s)下的循环伏安图(图4中(a))和 峰电流与扫速平方根的线性关系图(图4中(b))。峰电流与扫速的平方 根具有线性关系，表明氯霉素在电极表面的电化学反应为扩散控制，进一 步证明氯霉素可以进入CTAB胶束并顺利到达电极表面。

图5为垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极在含有不同浓度氯霉素 的牛奶中的差示脉冲伏安曲线，可以看出，还原峰电流随着氯霉素浓度的 增加而增加。

图6为垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极的结构示意图。

以上结果分析结果证明了垂直有序CTAB修饰的电极可以成功用来 检测牛奶中的氯霉素含量。

实施例2

使用垂直有序CTAB胶束修饰的ITO电极，检测牛奶中呋喃妥因的 电化学过程：

(1)用0.1mol/L、pH值为7的磷酸缓冲溶液将直接超市购买的牛奶 稀释5倍，作为待检测溶液。在该待测溶液中通入氮气，以排除溶液中的 氧气的干扰。采用简单的三电极系统，垂直有序CTAB修饰的FTO电极、 铂电极及银/氯化银电极分别作为工作电极、对电极和参比电极。

(2)将呋喃妥因溶于无水乙醇中配置成储备液，在待测溶液中加入不 同体积的呋喃妥因储备液得到一系列待测溶液，-0.4V电位下富集30s后 进行差示脉冲伏安测试。

垂直有序CTAB胶束修饰的FTO电极的制备方法为电化学辅助自组 装法，具体步骤如下：

将FTO电极放入1.585gCTAB、2.833gTEOS、20mL水、20mL乙 醇、0.17g硝酸钠和4.18μL盐酸所组成的溶液(事先搅拌2.5小时)，施 加恒电流密度-0.5mAcm^-2生长10秒。经测试证明，实施例2检测方法 对牛奶中的呋喃妥因同样具有良好的检测效果。