纳米硒作为碘-125粒子放疗增敏剂的应用

摘要

本发明公开了纳米硒作为碘-125粒子放疗增敏剂的应用。本发明利用PEG溶解单质硒制备得到纳米硒、多糖及壳聚糖修饰的纳米硒、叶酸及转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒(SeNPs)。SeNPs具有碘-125刺激响应特性，并能与碘-125产生的γ射线形成协同作用，在体外细胞实验和小鼠体内实验中对MCF-7乳腺癌细胞有高效的抑制效果，同时也能够明显抑制人宫颈癌细胞Hela、黑色素瘤细胞A375、乳腺癌细胞MCF-7及脑胶质瘤细胞C6等多种细胞的增殖。其机制主要是通过增强细胞内活性氧的累积，进而诱导细胞周期阻滞及肿瘤细胞凋亡。结果提示，SeNPs可作为新型放疗增敏剂进行开发。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其是纳米硒作为碘-125粒子放疗增敏剂的应用。

背景技术

在过去的几十年里，放射治疗作为临床上治疗肿瘤的重要手段得到了迅速的发展，有研究表明，大约 50％的肿瘤病人接受过单独放疗或者放疗与其他手段联合的治疗。其中碘-125粒子植入放疗作为一种新兴 的放疗方法，其疗效得到了广泛的认可。碘-125放射性粒子亦称为粒子刀，指的是癌症治疗中(微创)组 织间三维立体定向放射治疗系统，是目前国际医药界对外科手术以及外放疗的缺陷进行互补的一种新型的 肿瘤治疗方法。其主要特点是可以将难以根治的肿瘤瘤体、亚肿瘤区域以及可能转移的淋巴途径永久埋入 碘125放射性粒子进行持续治疗，或者在B超、CT等引导下应用微创技术将碘125放射性粒子植入对的肿 瘤进行持续的放射性治疗。

目前临床上使用的化疗药物普遍具有较大的毒副作用，从而极大地限制了其应用。因此，人们急需寻 找新的有效药物。在研发有效的抗肿瘤药物的过程中，如何在抑制消灭肿瘤的同时尽可能减少其副作用依 然是有待解决的重点和难点。其中基于肿瘤细胞与正常细胞之前的差异对其进行靶向治疗是目前研究颇多 然而进展非常有限的方向。例如，有研究人员设计了靶向叶酸受体或者整合素受体的靶向药物或者以肿瘤 细胞内特性激活的前药等。在上述靶向策略中，光动力疗法和射线增敏剂的治疗方案相对于外科手术治疗 化疗来说是一种微创且行之有效的方法。其中，因利用临床上使用的剂量、位置可控的碘-125粒子作为协 同增敏手段，射线增敏剂协同增敏粒子放疗的方法较控制难、难以穿透机体的光动力疗法更具有现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提出了纳米硒作为碘-125粒子放疗增敏剂的应用， 包括制备放疗增敏剂的应用、制备具有放疗增敏效果的抗肿瘤药物的应用以及制备具有放疗增敏效果的抗 肿瘤药物载体的应用。

本发明的技术方案：

纳米硒作为碘-125放疗增敏剂的应用。纳米硒在制备碘-125放疗增敏剂中的应用。纳米硒在制备具有 碘-125放疗增敏效果的抗肿瘤药物中的应用。纳米硒在制备具有碘-125放疗增敏效果的抗肿瘤药物载体中 的应用。

上述任一所述的应用中，所述纳米硒具有碘-125刺激响应特性，所述纳米硒能通过I-125粒子刺激高效 抑制癌细胞增殖。上述任一所述的应用中，所述癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7、乳腺癌、黑色素瘤、成骨肉 瘤、宫颈癌及脑胶质瘤。上述任一所述的应用中，所述纳米硒是利用PEG溶解单质硒制备得到的纳米硒 PEG-SeNPs。上述任一所述的应用中，纳米硒还包括多糖及壳聚糖修饰的纳米硒、叶酸及转铁蛋白修饰的肿 瘤靶向性纳米硒。上述任一所述的应用中，适应的肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、成骨肉瘤、宫颈癌及脑胶 质瘤。

本发明利用PEG溶解单质硒制备得到纳米硒(PEG-SeNPs)。PEG-SeNPs具有对碘-125粒子(I-125) 产生的γ射线刺激响应特性并能通过其刺激高效抑制人宫颈癌细胞Hela增殖，而对照组PEGW-SeNPs、 PVP-SeNPs不具备这种特性。PEG-SeNPs与碘-125粒子协同作用上调ROS的产生并激活p53的磷酸化、抑 制p21的方式通过凋亡和进程最终诱导Hela细胞凋亡和G2/M抑制。抑制通过调控与治疗耐受相关的蛋白， 如VEGF、VEGF2和XRCC-1等抑制Hela增殖。结果提示，PEG-SeNPs具有潜在的作为有效的新型CRT 改善宫颈癌的治疗效果。

本发明通过PEG的修饰，制备了碘-125粒子放疗响应的PEG-SeNPs，增强了碘-125粒子的对Hela细 胞增殖抑制效果。进一步的研究表明，PEG-SeNPs与I-125共同作用在Hela细胞内产生过量的活性氧造成 氧化损伤，进而抑制Akt、Erk的磷酸化并活化JNK，同时也激活ATM并最终汇聚放大激活p53，再分别通 过p21产生G2/M期周期抑制及通过线粒体信号通路诱导Hela细胞凋亡。

本发明还发现：多糖及壳聚糖修饰的纳米硒、叶酸及转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒(以下简称SeNPs) 均有碘-125粒子放疗刺激响应特性，并能与其协同作用，高效抑制人宫颈癌细胞Hela、黑色素瘤细胞A375、 成骨肉瘤细胞MG-63、乳腺癌细胞MCF-7及脑胶质瘤细胞C6等多种细胞的增殖。其机制主要是通过增强 细胞内活性氧的累积，进而诱导细胞周期阻滞剂肿瘤细胞凋亡。

附图说明

图1为三种纳米硒即PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs、PVP-SeNPs的TEM形貌表征；

图2为电子束对三种纳米硒形貌的影响(A1-A3)PEG-SeNPs，A3为A1的局部放大；(B)PEGW-SeNPs； (C)PVP-SeNPs：

图3为PEG-SeNPs的元素分析(A)及晶形表征(B)；

图4为HeLa细胞在接受单独X射线放疗，I-125粒子放疗，纳米硒处理以及纳米硒放疗联合处理48 小时后细胞存活率的对比。X射线的放射剂量分别为(A)2Gy，(B)4Gy和(C)6Gy，(D)图采用的 是放射性粒子I-125处理。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；

图5为SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对为HeLa细胞数量与形貌的影响；

图6：(A)为用克隆形成法检测SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对HeLa细胞数量与形貌 的影响。(B)为SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对为HeLa细胞生长相对生长率影响的定量分 析。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。

图7为流式细胞术分析PEG-SeNPs与X-ray以及I-125共同作用后对Hela细胞周期的影响；

图8为纳米硒分别与X-ray和I-125共同作用对Hela细胞内ROS水平的影响；

图9为纳米硒分别与X-ray和I-125共同作用对Hela细胞内Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表达 水平的影响；

图10为Westernblotting分析；(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对Hela细胞PARP、p53、P-p53、 BRCA1、pChk1、JNK和p-JNK表达水平评估。(B)PEG-SeNPs与1125共同作用对Hela细胞PARP、p53、 P-p53、BRCA1、pChk1、JNK和p-JNK表达水平评估；

图11为MCF-7细胞在接受单独X射线放疗，I-125粒子放疗，纳米硒处理以及纳米硒放疗联合处理 48小时后细胞存活率的对比。X射线的放射剂量分别为(A)2Gy，(B)4Gy和(C)6Gy，(D)图采用 的是放射性粒子I-125处理。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；

图12为SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对为MCF-7细胞数量与形貌的影响；

图13：(A)为用克隆形成法检测SeNPs分别于X射线和I-125粒子共同作用对MCF-7细胞数量与形 貌的影响。(B)为SeNPs分别于X射线和I-125粒子共同作用对为MCF-7细胞生长抑制率的定量分析。处 理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。

图14为流式细胞术分析PEG-SeNPs与X-ray以及I-125粒子共同作用后对MCF-7细胞周期的影响；

图15为纳米硒分别与X-ray和I-125粒子共同作用对MCF-7细胞内ROS水平的影响；

图16为Westernblotting分析；(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对MCF-7细胞MAPKs家族蛋白的 影响。(B)PEG-SeNPs与I125共同作用对MCF-7细胞MAPKs家族蛋白的影响；

图17为Westernblotting分析；(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对MCF-7细胞p53、P-p53、P-Histone、 XRCC1、MGMT和PARP蛋白表达水平的影响。(B)PEG-SeNPs与I125共同作用对MCF-7细胞p53、P-p53、 P-Histone、XRCC1、MGMT和PARP蛋白表达水平的影响；

图18为A375细胞在接受单独X射线放疗，I-125粒子放疗，纳米硒处理以及纳米硒放疗联合处理48 小时后细胞存活率的对比。X射线的放射剂量分别为(A)2Gy，(B)4Gy和(C)6Gy，(D)图采用的 是放射性粒子I-125处理。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；

图19为SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对A375细胞数量与形貌的影响；

图20：(A)为用克隆形成法检测SeNPs分别于X射线和I125粒子共同作用对A375细胞数量与形貌 的影响。(B)为SeNPs分别于X射线和I125粒子共同作用对A375细胞生长抑制率的定量分析。处理组与 对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。

图21为为流式细胞术分析PEG-SeNPs与X-ray以及I-125粒子共同作用后对A375细胞周期的影响；

图22为纳米硒分别与X-ray和I-125粒子共同作用对A375细胞内ROS水平的影响；

图23Westernblotting分析；(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对A375细胞P-p38、PARP、BRCA1、 P-JNK、T-JNK、P-p53和T-p53蛋白表达水平的影响。(B)PEG-SeNPs与I-125共同作用对A375细胞P-p38、 PARP、BRCA1、P-JNK、T-JNK、P-p53和T-p53蛋白表达水平的影响；

图24为MG-63细胞在接受单独X射线放疗，I-125粒子放疗，纳米硒处理以及纳米硒放疗联合处理 48小时后细胞存活率的对比。X射线的放射剂量分别为(A)2Gy，(B)4Gy和(C)6Gy，(D)图采用 的是放射性粒子I-I-125处理。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；

图25为SeNPs分别与X射线和I125粒子共同作用对MG-63细胞数量与形貌的影响；

图26：(A)为用克隆形成法检测SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对MG-63细胞数量与形 貌的影响。(B)为SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对MG-63细胞相对生长率的定量分析。处理 组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。

图27为流式细胞术分析PEG-SeNPs与X-ray以及I-125粒子共同作用后对MG-63细胞周期的影响；

图28为纳米硒分别与X-ray和I-125粒子共同作用对MG-63细胞内ROS水平的影响；

图29为Westernblotting分析；(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对MG-63细胞P-p38、PARP、BRCA1、 P-JNK、T-JNK、ATM、P-ERK、P-His、P-p53和p53蛋白表达水平的影响。(B)PEG-SeNPs与I-125共同 作用对A375细胞P-p38、PARP、BRCA1、P-JNK、T-JNK、ATM、P-ERK、P-His、P-p53和p53蛋白表达 水平的影响；

图30为C-6细胞在接受单独X射线放疗，I-125粒子放疗，纳米硒处理以及纳米硒放疗联合处理48 小时后细胞存活率的对比。X射线的放射剂量分别为(A)2Gy，(B)4Gy和(C)6Gy，(D)图采用的 是放射性粒子I-I-125处理。处理组与对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)；

图31为SeNPs分别与X射线和I125粒子共同作用对C-6细胞数量与形貌的影响；

图32：(A)为用克隆形成法检测SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对C-6细胞数量与形貌 的影响。(B)为SeNPs分别与X射线和I-125粒子共同作用对C-6细胞相对抑制率的定量分析。处理组与 对照组的显著性差异：P＜0.05(*)和P＜0.01(**)。

图33为流式细胞术分析PEG-SeNPs与X-ray以及I125粒子共同作用后对C-6细胞周期的影响；

图34为X-ray和I125粒子分别与纳米硒共同作用对C-6细胞内ROS水平的影响；

图35为Westernblotting分析(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对C-6细胞MAPKs家族蛋白表达水 平的影响。(B)PEG-SeNPs与I125共同作用对A375细胞MAPKs家族蛋白表达水平的影响；

图36为Westernblotting分析；(A)PEG-SeNPs与X-ray共同作用对C-6细胞P-p53、p53、P-Histonee、 P-ATM和PARP蛋白表达水平的影响。(B)PEG-SeNPs与I-125共同作用对A375细胞P-p53、p53、P-Histonee、 P-ATM和PARP蛋白表达水平的影响；

图37为PEG-SeNPs与I-125共同作用对人乳腺癌细胞MCF-7异种移植肿瘤裸鼠体重变化的影响；

图38为PEG-SeNPs与I-125共同作用对人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响；

图39为PEG-SeNPs与I-125共同作用对人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1纳米硒的制备及表征

本实施例设计合成了三种纳米硒，分别是物理法溶解单质灰硒制备的聚乙二醇(PEG)分散的纳米硒 (PEG-SeNPs)，利用维生素C(VC)还原亚硒酸(H₂SeO₃)或者亚硒酸钠(Na₂SeO₃)，再利用PEG或聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰纳米硒，即制得(PEGW-SeNPs，PVP-SeNPs)，并分别检测它们对射线的响应性， 选择最优材料进行进一步的活性筛选，并研究其与X射线共作用机制。以下纳米硒的制备方法均为目前公 知公用的常规方法，并不用于限制本发明。

(1)PEG-SeNPs制备：参考文献[ZhengSY，LiXL，ZhangYB，XieQ，WongYS，ZhengWJ，etal. PEG-nanolizedultrasmallseleniumnanoparticlesovercomedrugresistanceinhepatocellularcarcinomaHepG2 cellsthroughinductionofmitochondriadysfunction.IhtJNanomed.2012；7：3939-49]。具体的，在磁力搅拌下， 将一定量的灰硒分散于PEG中(比例为1∶10-100)，加热至150-250℃，并维持10-120min，高温体系迅速 冷却，得到产物经过透析后得到PEG-SeNPs。

(2)PEGW-SeNPs制备：将H₂SeO₃或者Na₂SeO₃(终浓度1-5mM)与PEG(0.5-10mg/ml)混合均 匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物PEGW-SeNPs。

根据以上条件，也可将PEG先与Vc混合，再滴入H₂SeO₃或者Na₂SeO₃，同样可制得产物PEGW-SeNPs。

(3)PVP-SeNPs制备：将H₂SeO₃或者Na₂SeO₃(终浓度1-5mM)与PVP(0.5-10mg/ml)混合均匀 后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物PVP-SeNPs。

根据以上条件，也可将PVP先与Vc混合，再滴入H₂SeO₃或者Na₂SeO₃，同样可制得产物PVP-SeNPs。

从图1可见，三种纳米硒(PEG-SeNPs、PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs)分散较均匀，粒径较均一，为 进一步的研究提供了基础。

通过TEM电镜的观察，我们发现PEG-SeNPs对TEM的电子束不稳定。从图2中A1-A3可见，PEG-SeNPs 在电子束的照射下，从黑色光滑的圆球变成形状不规则且中空的结构。从图2中B，C可见，在相同的条件 下，PEGW-SeNPs和PVP-SeNPs却能在电子束的照射下能稳定存在，且保持原有的形貌。通过这一观察， 我们发现了所制备了PEG-SeNPs独特的光电性质即对电子束不稳定。

我们通过HR-TEMEDX-mapping的方法，对所制备的PEG-SeNPs作了进一步的分析。从图3A可见， PEG-SeNPs在元素分析测试过程中依然不稳定，出现了形貌的改变也出现了中空结构，这一现象与前面TEM 观测相吻合，且从元素的分析的结果可见，PEG-SeNPs主要含有C、O和Se，其中C布满整个元素分析的 选取，这可能是由于背景是碳膜的原因。而氧与硒元素交错在一起，表明了PEG对PEG-SeNPs的修饰和稳 定作用，且从图可见氧较硒元素分布更广，我们推测从图2中观察到的空腔白膜可能是由PEG等外层修饰 剂构成。进一步通过XRD分析，PEG-SeNPs从作为硒源的灰硒转变成为无定形结构，这可能是由于PEG 在体系中穿插造成的。

实施例2PEG-SeNPs与放射性粒子I-125共作用体外抗宫颈癌肿瘤活性研究

本实施例子使用的是PEG-SeNPs。基于SeNPs的电子射线的敏感性特征，我们期待开发SeNPs在放疗 领域的应用。但是普通放疗有其局限性和不足，如达到最大剂量后即使病变未完全控制或出现新生转移灶， 短期内仍不宜再次行放射治疗。一些肿瘤生长在重要脏器或对射线敏感组织附近，亦限制了放疗的使用。 于是，放射性粒子植入近距离治疗作为一种新式的放疗手段诞生了。本实验我们研究了功能化的纳米硒 (SeNPs)与放射性粒子I-I-125、放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研究。在HeLa细胞培养24h后，分别 加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，将其置于放射性粒子上进行近距离的处理，同样的，纳米硒预处理后， 在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和6Gy的放疗处理。从图4可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处 理后，细胞存活率下降至55.95％。当细胞经X-ray处理后发现，对HeLa细胞的抑制率相近，没有显著差别。 SeNPs与X-ray联合处理(8μM)组中，放射剂量在2和4Gy无明显的增敏效果。当X-ray的剂量达到6 Gy时，联合处理组显现出了细胞抑制作用。而SeNPs与放射性粒子I-I-125共同作用时，处理组显现出了 更明显的抑制作用。从图4C可见，SeNPs(8μM)联合X-ray处理后导致细胞存活率由55.95％降至27.35％， 而从图4D可见联合放射性粒子I-I-125处理后降低到19.89％，呈现出更好的抗肿瘤效果。由图5观测得出， 细胞经不同放射剂量、放射性粒子I-I-125和不同浓度的SeNPs联合处理，其密度和形貌发生不同程度的改 变。

我们通过平板克隆实验来评估SeNPs与放射性粒子联合作用对Hela生长的抑制效果。研究结果如图6 所示，对Hela细胞，单独SeNPs(4μM)抑制克隆形成率为20.2％，单独的2Gy放疗及联合放疗抑制克 隆形成率分别为20％和55.5％，而SeNPs与放射性粒子I-125联合作用抑制克隆形成率达到了94.2％，说明 了SeNPs与放射性粒子I-I-125共同作用有效的抑制了细胞的生长。

通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray、放射性粒子I-I-125处理的HeLa的细 胞周期。从图7可知，单独X-ray处理组只是引起了轻微的改变，可见单独的放疗处理作用效果不明显。而 单独的SeNPs处理组引起了凋亡峰，即凋亡峰从对照组的0.3％增加至15.2％。联合放疗与SeNPs的处理组， Sub-G1峰增加至43.3％，且引起了G2/M期的阻滞，G2/M峰从对照组的16.7％增加至42.7％。联合放射性 粒子I-125与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至47.0％，且引起了G2/M期的阻滞，G2/M峰增加至56.9％。 流式细胞周期分析的结果提示联合放射性粒子I-I-125与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的 方式抑制HeLa细胞的增殖。

HeLa细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量、放射性粒子I-125联合处理后，细胞内活性氧(ROS) 水平呈现不同程度的改变。细胞经处理后，加入DHE探针孵育30min后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS 水平。从图8可知，细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS水平只有小幅度的升高。相对于2Gy 和4Gy，SeNPs(32μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水平提升，最高达到206.2％。ROS水 平先急剧升高，后随着时间而下降。从图8D可知SeNPs(32μM)联合放射性粒子处理时，细胞内ROS水 平更高达236.34％，而且是有一直上升的趋势。

而为了确定细胞的凋亡是否与caspase的激活有关，我们检测了SeNPs与放疗(2Gy)、放射性粒子联 合作用下caspase-3，-8，-9活性表达变化。如图9表明，SeNPs与放射性粒子联合作用时，caspase-3，-8，-9明显 被激活，说明细胞凋亡与两条关键的信号通路即死亡受体通路和线粒体通路有关。

我们又通过Westernblotting检测了SeNPs与放射性粒子联合作用后细胞内蛋白表达的改变。P53的调 控对线粒体介导的细胞凋亡和死亡受体介导的凋亡都起着重要的作用，是细胞凋亡过程中的中枢蛋白。从 图10可知，SeNPs与放射性粒子联合作用与单独用药及放疗联合(2Gy)处理后相比，细胞内p-p53表达 量明显上调。而且在放射性粒子与PEG-SeNPs联合作用时，PARP切割增强，与DNA损伤有关的BrCA1，JNK 发生了磷酸化。

实施例3功能化纳米硒FACS-SeNPs与放射性粒子I-I-125共作用体外抗乳腺癌肿瘤活性研究

纳米硒的制备：参考以下文献

BoYu，XiaolingLi，WenjieZheng，*YanxianFeng，Yum-ShingWongandTianfengChen*.pH-Responsive Cancer-targetedSeleniumNanoparticles：ATransformableDrugCarrierwithEnhancedTheranosticEffects，J. Mater.Chem.B，2014，2(33)，5409-5418。反应步骤如下：

(1)CS偶联叶酸(CS-FA)的制备：称取适量的FA溶解于DMSO中(FA终浓度为10-50毫克/毫升)， 加入适量的NHS和EDC(FA∶NHS∶EDC＝1∶0.5-2∶0.5-2)搅拌反应2-24小时以活化叶酸，后加入壳聚 糖溶液(终浓度为0.1-10毫克/毫升)混合均匀，搅拌反应12-48小时后，透析12-48小时，得到FACS 溶液。

(2)将H₂SeO₃或者Na₂SeO₃(终浓度1-5mM)与FACS(0.1-10mg/ml)混合均匀后，加入Vc(Vc 与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物FACS-SeNPs。该产物具有叶酸靶 向及pH控释的双重功能。

根据以上条件，也可将FACS先与Vc混合，再滴入H₂SeO₃或者Na₂SeO₃，同样可制得产物 FACS-SeNPs。

纳米硒对X-ray的增敏活性：本实验研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放射性粒子I-I-125、放疗共同 作用的体外抗肿瘤活性研究。在MCF-7细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，将其 至于放射性粒子上进行近距离的处理，同样的，纳米硒预处理后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、 4和6Gy的放疗处理。从图11可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处理后，细胞存活率下降至43.61％。当 细胞经X-ray处理后发现，对MCF-7细胞的抑制率不明显。当细胞接受6Gy的X-ray放疗后，存活率为71.7％。 SeNPs与X-ray联合处理(8μM)组中，放射剂量在2和4Gy无明显的增敏效果。当X-ray的剂量达到6 Gy时，联合处理组显现出了细胞抑制作用。从图11C可见，SeNPs(8μM)联合X-ray处理后导致细胞存 活率降至20.27％，而SeNPs与放射性粒子I-125共同作用时，处理组显现出了更明显的抑制作用。而从图 11D可见联合放射性粒子I-125处理后降低到1.49％，呈现出更好的抗肿瘤效果。由图12观测得出，细胞 经不同放射剂量、放射性粒子I-125和不同浓度的SeNPs，其密度和形貌发生不同程度的改变。

我们通过平板克隆实验来评估SeNPs与放射性粒子联合作用对MCF-7生长的抑制效果。研究结果如图 13所示，对MCF-7细胞，单独SeNPs(2μM)处理后没有明显抑制克隆形成，单独的2Gy放疗及联合 放疗抑制克隆形成率分别为8.2％和30.1％，而SeNPs及放射性粒子联合作用抑制克隆形成率达到了90.3％ 和96.5％，说明了SeNPs与放射性粒子I-125共同作用有效的抑制了细胞的生长。

通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray、放射性粒子I-125处理的MCF-7的细 胞周期。从图14可知，单独X-ray处理组只是引起了轻微的改变，可见单独的放疗处理作用效果不明显。 而单独的SeNPs处理组引起了凋亡峰，即凋亡峰从对照组的2.3％增加至12.2％。联合放疗(6Gy)与SeNPs 的处理组，Sub-G1峰增加至27.5％，且引起了轻微G2/M期的阻滞。联合放射性粒子I-125与SeNPs的处 理组，Sub-G1峰增加至50.5％，且引起了G2/M期的阻滞，G2/M峰增加至56.9％。流式细胞周期分析的结 果提示联合放射性粒子I-125与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式抑制MCF-7细胞的 增殖。

MCF-7细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量、放射性粒子I-125联合处理后，细胞内活性氧(ROS) 水平呈现不同程度的改变。细胞经处理后，加入DHE探针孵育30min后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS 水平。从图15可知，细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS水平只有小幅度的升高。相对于2 和4Gy，SeNPs(32μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水平提升，最高达到221.6％。ROS水 平先急剧升高，后随着时间而下降。从图15D可知SeNPs(32μM)联合放射性粒子处理时，细胞内ROS 水平高达210.3％，而且在一定时间内保持稳定。

我们又通过Westernblotting检测了SeNPs与放射性粒子联合作用后细胞内蛋白表达的改变。上述结果 表明，放疗或放射性粒子联合SeNps作用能促使细胞内的ROS水平上升。因此我们检测里经处理后细胞内 作为主要氧化应激性信号的MAPKs家族激酶的表达水平。如图16A所示，粒子I-125和SeNPs联合作用后， 细胞内MAPKs家族蛋白(JNK，ERK，p38)的表达水平发生变化。其中，经粒子I-125处理后，能显著地 上调磷酸化p-JNK的水平，而总的T-JNK的表达保持不变。此外，联合作用后能显著下调磷酸化p-ERK的 表达水平。然而，我们发现经过同等放射剂量(2Gy)的X-ray及联合作用后，细胞内的各种蛋白表达无显 著变化。

P53的调控对线粒体介导的细胞凋亡和死亡受体介导的凋亡都起着重要的作用，是细胞凋亡过程中的中 枢蛋白。从图17A可知，SeNPs与放射性粒子联合作用与单独用药及放疗联合(2Gy)处理后相比，细胞 内p-p53表达量明显上调。而且在放射性粒子heSeNPs联合作用时，克服了逆转放疗损伤的XRCC1和MGMT 的DNA修复酶的保护作用(图17B)。最终，SeNPs与放射性粒子联合作用能显著激活PARP切割增强， 导致细胞凋亡。

实施例4PTR-SeNPs与放射性粒子I-125共作用体外抗黑色素瘤活性研究

纳米硒的制备：参考文献：HualianWu，XiaolingLi，WenLiu，TianfengChen*，YinghuaLi，WenjieZheng andKa-HingWong*.Surfacedecorationofseleniumnanoparticlesbymushroompolysaccharides-protein complexestoachieveenhancedcellularuptakeandanticanceractivity.JournalofMaterialsChemistry，2012，22， 9602-9610。

将H₂SeO₃或者Na₂SeO₃(终浓度1-5mM)与虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物(PTR，0.1-10mg/ml)混合 均匀后，加入Vc(Vc与Se的摩尔比为3-10∶1)反应0.5-24小时，透析12-48小时，即得产物PTR-SeNPs。

根据以上条件，也可将PTR先与Vc混合，再滴入H₂SeO₃或者Na₂SeO₃，同样可制得产物PTR-SeNPs。

在常温常压下，在虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物(PTR)水溶液中加入维生素C溶液，混合均匀，然后 滴加亚硒酸钠溶液，边滴加边混匀，定容后待产物中所出现的红色不再加深，即可得到具有抗肿瘤活性的 虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物功能化纳米硒溶胶。此合成方法中反应体系简单、条件温和、反应时间，都是 绿色合成方法。通过TEM、SEM、HR-TEM等电镜手段观察对纳米粒子的形貌，用粒度分析仪测试纳米硒 稳定性。

纳米硒的放疗增敏活性：本实验研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放疗共同作用的体外抗肿瘤活性研 究。在A375细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，在临床的X-ray放疗仪器上分别 施加2、4和6Gy和临床的I-125粒子射线施加2Gy的放疗处理。从图18A可见，细胞经单独SeNPs(4μM) 处理后，细胞存活率下降至33.7％。当细胞经X-ray处理后发现，经X-ray2Gy、4Gy、6Gy和I-125粒子 照射后，细胞存活率分别下降至29.3％、8.2％、3.1％、5.6％。SeNPs与X-ray联合处理组中，放射剂量在2 Gy无明显的增敏效果。但当与2Gy剂量的I-125粒子联合处理时，联合处理组显现出明显的细胞抑制作 用。从图18D可见，SeNPs(8μM)联合X-ray处理后导致细胞存活率由33.7％降至5.6％且呈现剂量效应。 由图19观测得出，细胞经不同放射剂量和不同浓度的SeNPs处理后，其密度和形貌发成不同程度的改变。 我们通过平板克隆实验来评估SeNPs与放射性粒子联合作用对A375细胞生长的抑制效果。研究结果如图 20所示，对A375细胞，单独SeNPs(4μM)抑制克隆形成率为17.7％，单独的2Gy放疗及联合放疗抑制 克隆形成率分别为18.1％和29.4％，而SeNPs与放射性粒子联合作用抑制克隆形成率达到了66.5％，说明了 SeNPs与放射性粒子I-125共同作用有效的抑制了细胞的生长。通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析 经过SeNPs和X-ray及I-125粒子处理的A375的细胞周期。从图21可知，单独X-ray处理组同时引起了凋 亡峰与G2/M峰增加，Sub-G1峰从对照组的1.3％增加至3.1％，而G2/M峰从对照组的15.9％增加至24.8％。 单独I-125粒子处理组Sub-G峰从1.3％增加到5.2％，而G2/M峰无明显变化。单独的SeNPs处理组也同时 引起了凋亡峰与G2/M峰增加，即凋亡峰从对照组的1.3％增加至7.3％，G2/M峰从从对照组的15.9％增加 至29.4％。可见单独的放疗处理和单独SeNPs处理都同时引起A375细胞的凋亡和阻滞。联合X-ray放疗与 SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至5.2％，G2/M峰增加至46.6％。而联合I-125粒子放疗与SeNPs的处理 组，Sub-G1峰从1.3％明显增加到57.2％，G2/M峰从29.3％增加到36.0％。流式细胞周期分析的结果提示联 合X-ray放疗与SeNPs可能是通过诱导G2/M期阻滞的方式抑制A375细胞的增殖，而联合I-125粒子放疗 与SeNPs可能是通过诱导凋亡的方式抑制细胞增殖。A375细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量联 合处理后，细胞内活性氧(ROS)水平呈现不同程度的改变。细胞经处理后，加入DHE探针孵育30min 后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平。图22显示，细胞经单独的SeNPs、X-ray或I-125粒子处理后， 细胞内ROS水平无线性变化。在联合X-ray放疗剂量为2Gy与SeNPs(32μM)时，可使细胞内ROS水平 轻微提升，最高达到133.8％。ROS水平先升高，后随着时间而下降。而在I-125粒子放疗剂量为2Gy时， 细胞内ROS水平大幅提高到153.8％。通过Westernblotting检测细胞内蛋白表达的改变，我们确认了细胞凋 亡和G2/M期周期阻滞的发生。图23表明，联合I-125粒子放疗与SeNPs的体系即能更有效激活PARP和 T-JNK，且通过活化p53产生凋亡。上述结果与前述结果相符合即联合I-125粒子放疗与SeNPs能有效诱导 A375细胞凋亡从而抑制A375细胞增殖。

实施例5PEG-SeNPs与放射性粒子I-125共作用体外抗成骨肉瘤活性研究

PEG-SeNPs制备：参考文献[ZhengSY，LiXL，ZhangYB，XieQ，WongYS，ZhengWJ，etal. PEG-nanolizedultrasmallseleniumnanoparticlesovercomedrugresistanceinhepatocellularcarcinomaHepG2 cellsthroughinductionofmitochondriadysfunction.IntJNanomed.2012；7：3939-49]。具体的，在磁力搅拌下， 将一定量的灰硒分散于PEG中(灰硒和PEG摩尔比例为1∶10-100，以下为作说明的均为摩尔比例)，加热 至150-250℃，并维持10-120min，高温体系迅速冷却，得到产物经过透析后得到PEG-SeNPs。

纳米硒的放疗增敏活性：本实验研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放射性粒子I-125、放疗共同作用 的体外抗肿瘤活性研究。在MG-63细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，将其至于 放射性粒子上进行近距离的处理，同样的，纳米硒预处理后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和 6Gy的放疗处理。从图24-A可见，细胞经单独SeNPs(2μM)处理后，细胞存活率下降至69％。当细胞 经X-ray处理后发现，对MG-63细胞的抑制率下降到50％左右。SeNPs与X-ray联合处理(4μM)组中， 放射剂量在4和6Gy条件下，均出现较为明显的增敏效果。而SeNPs与放射性粒子I-125共同作用时，在 低剂量(1μM)处理下，就显现出了明显的增敏效果。从图24-D可见，SeNPs(1μM)联合I-125处理后导致 细胞存活率由78％降至22％，呈现出更好的抗肿瘤效果。由图25观测得出，细胞经不同放射剂量、放射性 粒子I-125和不同浓度的SeNPs，MG-63密度和形貌发生不同程度的改变。

我们通过平板克隆实验来评估SeNPs与放射性粒子联合作用对MG-63生长的抑制效果。研究结果如图 26所示，对MG-63细胞，单独SeNPs(4μM)抑制克隆形成率为20.2％，单独的2Gy放疗及联合放疗 抑制克隆形成率分别为20％和55.5％，而SeNPs与放射性粒子联合作用抑制克隆形成率达到了94.2％，说 明了SeNPs与放射性粒子I-125共同作用有效的抑制了细胞的生长。通过PI染色固定后，再用流式细胞术 分析经过SeNPs和X-ray、放射性粒子I-125处理的MG-63的细胞周期。从图27可知，单独X-ray处理组 只是引起了Sub-G1峰轻微的改变，而单独的SeNPs处理组引起了凋亡峰，但是凋亡峰在低剂量条件下非常 低。联合放疗与SeNPs的处理组，Sub-G1峰在低剂量的SeNPs下也出现较明显的增高，并且引起了G2/M 期的普遍阻滞，表明放疗和SeNPs具有较好的协同作用。联合放射性粒子I-125与SeNPs的处理组，Sub-G1 峰增加至22％，并且G2/M期的阻滞可增加至44％。流式细胞周期分析的结果提示放射性粒子I-125可以明 显提升SeNPs处理后MG-63细胞的凋亡趋势，且主要是通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式抑制MG-63 细胞的增殖。MG-63细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量、放射性粒子I-125联合处理后，细胞内 活性氧(ROS)水平是一个很重要凋亡参数。具体实验是：细胞经处理后，加入DHE探针孵育30min后， 用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平。从图28可知，细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS 水平只有小幅度的升高。相对于2和4Gy，SeNPs(32μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水 平提升，最高达到150％。ROS水平先急剧升高，后随着时间而下降。从图28D可知SeNPs(32μM)联合 放射性粒子处理时，细胞内ROS水平可以达到180％，进一步确定了X-ray和粒子I-125均可以协同纳米 硒粒子诱导MG-63细胞内活性氧的产生，与其抑制细胞增殖的效果是一致的。我们又通过Westemblotting 检测了SeNPs与放射性粒子联合作用后细胞内蛋白表达的改变。P53的调控对线粒体介导的细胞凋亡和死 亡受体介导的凋亡都起着重要的作用，是细胞凋亡过程中的中枢蛋白。从图29可知，SeNPs与放射性粒子 联合作用与单独用药及放疗联合(2Gy)处理后相比，细胞内p-p53表达量明显上调。而且在放射性粒子与 PEG-SeNPs联合作用时，PARP切割增强，与DNA损伤有关的BrCA1，JNK发生了磷酸化。

实施例6SeNPs与放射性粒子I-125共作用体外抗脑胶质瘤活性研究

纳米硒的制备：参考文献

YanyuHuang，LizhenHe，WenLiu，CundongFan，WenjieZheng*，Yum-ShingWong，TianfengChen*. SelectiveCellularUptakeandInductionofApoptosisofCancer-targetedSeleniumNanoparticles.Biomaterials， 2013，34，7106-7116.

(1)将Na₂SeO₃溶液(终浓度为1-10mM)、CS储备液(终浓度为0.01-0.1mg/mL)和阿霉素的DMSO 储备液(终浓度为10mM-100mM)均匀混合后，缓慢滴入Vc溶液(Na₂SeO₃与Vc的摩尔比为1∶3-10)中， 得到CS-SeNPs-DOX溶液。

(2)制备Tf-EDC：EDC溶液与转铁蛋白(Tf)溶液混合(EDC∶Tf＝0.5-4∶1)，在磁力搅拌下充分反应 2-24h，透析12-48小时，得到Tf-EDC溶液。

(3)将CS-SeNPs-DOX与Tf-EDC按1∶1-4充分混合反应12-48，透析12-48小时，即得产物TfSeNPs/Dox。

纳米硒的放疗增敏活性：本实验我们研究了功能化的纳米硒(SeNPs)与放射性粒子I-125、放疗共同 作用的体外抗肿瘤活性研究。在C6细胞培养24h后，分别加入不同浓度的纳米硒预处理6h后，将其至于 放射性粒子上进行近距离的处理，同样的，纳米硒预处理后，在临床的X-ray放疗仪器上分别施加2、4和 6Gy的放疗处理。从图30可见，细胞经单独SeNPs(8μM)处理后，细胞存活率下降至45.37％。当细胞 经X-ray处理后发现，对C6细胞的抑制率不明显。当细胞接受6Gy的X-ray放疗后，存活率为85.37％。 SeNPs与X-ray联合处理(8μM)组中，放射剂量在2和4Gy无明显的增敏效果。当X-ray的剂量达到6 Gy时，联合处理组显现出了细胞抑制作用。从图30C可见，SeNPs(8μM)联合X-ray处理后导致细胞存 活率降至14.63％，而SeNPs与放射性粒子I-125共同作用时，处理组显现出了更明显的抑制作用。而从图 30D可见联合放射性粒子I-125处理后降低到9.23％，呈现出更好的抗肿瘤效果。由图31观测得出，细胞 经不同放射剂量、放射性粒子I-125和不同浓度的SeNPs，其密度和形貌发生不同程度的改变。

我们通过平板克隆实验来评估SeNPs与放射性粒子联合作用对C6生长的抑制效果。研究结果如图32 所示，对C6细胞，单独SeNPs(2μM)处理后没有明显抑制克隆形成，单独的2Gy放疗及联合放疗抑 制克隆形成率分别为9.68％和28.68％，而SeNPs及放射性粒子联合作用抑制克隆形成率达到了89.69％和 97.08％，说明了SeNPs与放射性粒子I-125共同作用有效的抑制了细胞的生长。

通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过SeNPs和X-ray、放射性粒子I-125处理的C6的细胞周 期。从图33可知，单独X-ray处理组只是引起了轻微的改变，可见单独的放疗处理作用效果不明显。而单 独的SeNPs处理组引起了凋亡峰，即凋亡峰从对照组的0.2％增加至6.6％。联合放疗(6Gy)与SeNPs的 处理组，Sub-G1峰增加至56.1％。联合放射性粒子I-125与SeNPs的处理组，Sub-G1峰增加至71.7％.流 式细胞周期分析的结果提示联合放射性粒子I-125与SeNPs可能是通过诱导细胞凋亡抑制C6细胞的增殖。

C6细胞经SeNPs预处理6h后，经不同放射剂量、放射性粒子I-125联合处理后，细胞内活性氧(ROS) 水平呈现不同程度的改变。细胞经处理后，加入DHE探针孵育30min后，用多功能酶标仪检测细胞内ROS 水平。从图34可知，细胞经单独的SeNPs或X-ray处理后，细胞内ROS水平只有小幅度的升高。相对于2 和4Gy，SeNPs(32μM)在放疗剂量为6Gy时，可使细胞内ROS水平提升，最高达到190.08％。ROS 水平先急剧升高，后随着时间而下降。从图34D可知SeNPs(32μM)联合放射性粒子处理时，细胞内ROS 水平高达199.79％，而且在一定时间内保持稳定。

我们又通过Westernblotting检测了SeNPs与放射性粒子联合作用后细胞内蛋白表达的改变。上述结果 表明，放疗或放射性粒子联合SeNps作用能促使细胞内的ROS水平上升。因此我们检测里经处理后细胞内 作为主要氧化应激性信号的MAPKs家族激酶的表达水平。如图35A所示，粒子I-125和SeNPs联合作用后， 细胞内MAPKs家族蛋白(JNK，ERK，p38)的表达水平发生变化。其中，经粒子I-125处理后，能显著地 上调磷酸化p-JNK的水平，而总的T-JNK的表达保持不变(图35B)。此外，联合作用后能显著下调磷酸化 p-ERK的表达水平。然而，我们发现经过同等放射剂量(2Gy)的X-ray及联合作用后，细胞内的各种蛋白 表达无显著变化。

P53的调控对线粒体介导的细胞凋亡和死亡受体介导的凋亡都起着重要的作用，是细胞凋亡过程中的中 枢蛋白。从图36A可知，SeNPs与放射性粒子联合作用与单独用药及放疗联合(2Gy)处理后相比，细胞 内p-p53表达量明显上调。而且在放射性粒子和SeNPs联合作用时，促进了ATM蛋白的磷酸化，引起DNA 的损伤(图36B)。最终，SeNPs与放射性粒子联合作用能显著激活PARP切割增强，导致细胞凋亡。

实施例7PEG-SeNPs与放射性粒子I-125共作用对人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用

制备模型：收集体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7，计数，调整细胞悬液浓度为1×107个/ml，接种0.1ml 细胞悬液于裸鼠右侧腋窝皮下；

分组与给药：裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至75-100mm3后将动物随机分组， 每组6只。同时开始给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的 效应，给药22天后小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

观测指标：

肿瘤体积(tumorvolume，TV)的计算公式为：

TV＝1/2×a×b²其中a、b分别表示长宽

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，RTV)，计算公式为：

RTV＝V_t/V₀其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。

抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：

$T/C\left(\%\right)=\frac{T_{RTV}}{C_{RTV}}\times 100$

T_RTv：治疗组RTV；C_RTV：模型对照组RTV

抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：

本实验研究了功能化的纳米硒(PEG-SeNPs)与放射性粒子I-125共同作用人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠 异种移植瘤生长的抑制作用。从图37可见，SeNPs处理组的小鼠在接受给药后的22天内体重与对照组没 有明显区别，表明SeNPs对小鼠的正常生长没有产生明显的影响，其毒副作用较小。同时从图38可以看到， 处理组的小鼠体内肿瘤体积在接受处理第六天后与模型对照组有一定程度减小。22天后SeNPs与I125粒子 单独处理组和联合处理组的小鼠体内肿瘤体积与模型对照组相比分别减小了45.5％，27.9％和59.1％，证明 SeNPs明显增强I125粒子对裸鼠异种移植的MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制效果。在图39中，模型对照组， SeNPs和I125组的小鼠在接受处理22天后，其体内肿瘤重量分别是9.18g、5.58g和6.40g，而SeNPs和I125 粒子联合处理22天后，裸鼠体内肿瘤的重量降低为2.73g，进一步证明SeNPs能够有效增敏I125粒子体内 放疗效果，是一种高效低毒的粒子放疗增敏剂。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和 变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。