锌指蛋白394（ZNF394）在治疗心肌肥厚中的应用

摘要

本发明公开了锌指蛋白394在保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚中的应用，属于基因的应用领域。本发明确定了在发生心肌肥厚的模型中，ZNF394的表达和正常组相比显著降低；抑制ZNF394表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进ZNF394过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。ZNF394可作为药物靶标，用于在筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物；ZNF394可作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物和/或生物学试剂，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

说明书

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种锌指蛋白394（ZNF394）在治疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。

背景技术

心肌肥厚（hypertrophiccardiomyopathy，HCM）是心肌对长期生物力学压力或容积负荷增加的代偿性反应，常见于高血压、主动脉瓣狭窄等心血管疾病，其主要表现为心肌细胞体积增大、蛋白合成增多、细胞外基质增多等特征[1-3]。高血压、老年退行性主动脉瓣疾病在我国呈逐年上升趋势。由高血压等疾病所致的心肌肥厚、高血压心脏病发病率也随之增加。尽管心肌肥厚最初可以使心肌细胞增大，心肌收缩力加强，是一种维持正常心输出量的代偿机制，但长期持续性的压力或容积负荷过重则会引起心肌重构，同时由于心肌需氧量增大，而冠状动脉血供相对不足，引起心肌缺血、心肌细胞凋亡，进而导致失代偿，从而引起心力衰竭、恶性心律失常、甚至猝死等[4,5]。研究表明随着心脏左室肥厚的发生发展，心肌缺血、室性心律失常、心力衰竭、猝死等心血管事件的发生率增加了6～10倍[6]。

目前认为心肌肥厚是一种多种因素参与调节的复杂的动态过程。研究发现长期的生物力学压力和/或容积负荷过度，使心室壁应力增加，导致心肌肥厚。此外，血管紧张素II(AngII)、内皮素(ET)、儿茶酚胺、转化生长因子-β(TGF-β)等各种胞外刺激信号可诱导核内基因表达的改变，从而导致心肌细胞肥大[7-11]。从分子水平上看心肌肥厚的病变过程分三个环节：胞外肥厚刺激信号的出现、胞内信号转导及核内基因转录活化，最终诱发细胞发生肥大表型变化。目前研究已经显示多种信号通路参与心肌肥厚的过程。其中，钙调神经磷酸酶calcineurin/NFAT、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路以及由这三条通路所调节的下游转录因子MCIP1.4、NF-κB、AP-1、MEF2、mTOR等在心肌肥厚的发生发展中起着重要作用[1,2,12-17]。钙调神经磷酸酶(calcineurin)是一种受钙离子及钙调素调节的多功能信号酶，可通过使活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells，NFAT)转位入核，调节核内肥大基因(ANP、BNP)的表达[18,19]。MAPK包括三个亚家族[20]：ERKs，JNKs和p38-MAPK。磷酸化的MAPKs激活促进与心肌肥厚有关的下游转录因子NF-κB，AP-1,MEF2,NFAT等的转录活性，而调节细胞基因转录和蛋白合成，引起心肌细胞肥大，导致心肌肥厚[20]。PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路是心肌细胞肥大发生发展中另一条重要的信号通路。研究发现压力负荷引起的机械刺激可激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路。磷酸脂酰肌醇-3激酶(PI3K)活化后激活下游重要靶点AKT,AKT通过3个下游底物：雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)和糖原合成激酶(GSK3β)的激活以及FoxO的失活而增加蛋白合成，促进转录因子易位，调节肥大基因，从而引起心肌细胞肥大。到目前为止，众多的研究说明了HCM发病复杂，但其机制仍不十分明确，且临床也没因此而有特殊有效的治疗药物及方案。因此，进一步研究心肌肥厚的发生发展机制，对改善HCM患者心脏功能和降低或延缓心衰的发病、降低猝死率具有重要的意义。

锌指蛋白394(ZNF394)是2004年发现的一种C2H2型锌指蛋白，其基因定位于人类7号染色体长臂，含有3个外显子，其中2、3号外显子为编码外显子，编码出含有561个氨基酸的蛋白质，该蛋白质含有3个明确的结构域，其中N末端具有LER、KRAB2个结构域，而C末端具有7个C2H2锌指结构域，但各结构域的功能仍不明确[21]。该蛋白在人体内主要表达于心脏、骨骼肌及脑内，细胞内主要定位于细胞核内[21]。目前关于ZNF394的相关研究仍非常有限，

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发明内容

HuangCX等通过荧光素酶报告基因技术发现在COS-7细胞中过表达ZNF394可降低转录因子c-jun、AP-1的转录活性[21]。AP-1作为重要的心肌肥厚调节因子，可促进心肌肥厚的发生发展[22]，因此，我们推测ZNF394可能通过调控AP-1从而调控心肌肥厚的进程。

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于确定ZNF394的表达和心肌肥厚的相互关系，提供一种ZNF394作为药物靶标在筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明首先通过试验确定ZNF394表达与心肌肥厚之间的关系：

1、发生心肌肥厚时心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，ZNF394的表达明显下调

本发明分别选用正常人和扩张型心肌病患者心脏，正常假手术小鼠和通过主动脉弓缩窄手术造成心肌肥厚的小鼠心脏，以及分别通过对照组（PBS）或血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞，分别检测了ANP、β-MHC、ZNF394的蛋白表达情况。结果表明，扩张型心肌病患者和发生心肌肥厚的小鼠心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，ZNF394的表达明显下调，同样在经血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞中ANP、β-MHC的表达也明显上调，ZNF394的表达明显下调（图1、图2、图3）。

2、ZNF394干扰（AdshZNF394）及过表达（AdZNF394）腺病毒对经AngII诱导的心肌细胞肥大模型的影响

本发明发现在经血管紧张素II（AngII）诱导的体外心肌肥厚模型中，ZNF394过表达心肌细胞的肥大明显被抑制，ZNF394不表达心肌细胞出现明显肥大（图4）。

3、ZNF394基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能

本发明选用野生型小鼠、ZNF394基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ZNF394基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除ZNF394基因所致的ZNF394缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能(图5、图6、图7、图8)。

4、ZNF394基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能

本发明选用心脏特异性ZNF394转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究ZNF394基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达ZNF394基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能(图9、图10、图11、图12)。

由以上结果可知在发生心肌肥厚的模型中，ZNF394的表达和正常组相比显著降低；抑制ZNF394表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进ZNF394过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。ZNF394为心肌肥厚疾病发生的抑制因子。因此ZNF394具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ZNF394能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

针对ZNF394的上述功能，提供一种ZNF394的应用，主要体现为ZNF394在制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。

一种保护心脏功能的药物，包含ZNF394。

一种抗心脏纤维化的药物，包含ZNF394。

一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含ZNF394。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明发现ZNF394基因的新功能，即ZNF394基因具有能够保护心脏功能、抗心脏纤维化和抑制心肌肥厚的作用。

（2）基于ZNF394在保护心脏功能、抗心脏纤维化和抑制心肌肥厚疾病中的作用，其可以用于制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物。

附图说明

图1是正常人（Donor）和扩张性心肌病患者（DCM）心脏中ANP、β-MHC、ZNF394的蛋白表达情况；

扩张性心肌病患者心脏ZNF394的表达下调。(*：p＜0.05vs正常人组)；

图2是小鼠在假手术（Sham）和主动脉弓缩窄手术（AB）后心脏中ANP、β-MHC、ZNF394的表达；

说明发生心肌肥厚的心脏ZNF394的表达下调，GAPDH作为内参；其中4W表示4周，8W表示8周（*：p＜0.05vs野生型小鼠Sham组）。

图3是体外培养乳鼠原代心肌细胞中对照组（PBS）和血管紧张素II（AngII）、苯肾上腺素（PE）刺激后ANP、β-MHC、ZNF394的蛋白表达情况；

AngII、PE刺激后ZNF394表达下调，GAPDH作为内参（*：p<0.05vsPBS组）

图4是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshZNF394、AdGFP和AdZNF394感染，经AngⅡ刺激后的免疫荧光图；

结果表明ZNF394的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，ZNF394的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大，其中48hours表示48小时(*：p＜0.05vsPBS组，#：p＜0.05vsAngⅡ组)

图5是野生型小鼠（WT）和ZNF394基因敲除小鼠（ZNF394-KO）AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；

其中HW：心脏质量；BW：体重；LW：肺脏总量；TL：胫骨长度（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）

图6是野生型小鼠（WT）和ZNF394基因敲除小鼠（ZNF394-KO）AB模型4周后心脏组织HE染色、WGA染色及心肌细胞横截面积统计柱状图；

其中4weeks表示4周（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图7是野生型小鼠（WT）和ZNF394基因敲除小鼠（ZNF394-KO）AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图；

其中4weeks表示4周（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图8是野生型小鼠（WT）和ZNF394基因敲除小鼠（ZNF394-KO）AB模型4周后心功能检测结果的统计柱状图；

FS为短轴缩短率、EF为射血分数、LVEDd为左室舒张末期内径（*：p＜0.05vs野生型Sham组，#：p＜0.05vs野生型AB组）。

图9NTG和ZNF394-TG小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；

其中HW：心脏质量；BW：体重；LW：肺脏总量；TL：胫骨长度（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图10是NTG和ZNF394-TG小鼠AB模型4周后心脏组织HE染色、WGA染色及心肌细胞横截面积统计柱状图；

其中4weeks表示4周（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图11是NTG和ZNF394-TG小鼠AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计柱状图；

其中4weeks表示4周（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

图12是NTG和ZNF394-TG小鼠AB模型4周后心功能检测结果的统计柱状图；

FS为短轴缩短率、EF为射血分数、LVEDd为左室舒张末期内径、（*：p＜0.05vsNTGSham组，#：p＜0.05vsNTGAB组）。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版（NewYork:ColdSpringHarborlaboratoryPress,2005)中所述的条件进行。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的野生型小鼠（命名WT）、全身性ZNF394敲除小鼠（ZNF394-KO）、心脏特异性ZNF394转基因小鼠（TG）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

全身性ZNF394基因敲除小鼠的构建：

我们利用CRISPR-Cas9技术构建全身性ZNF394基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）预测小鼠ZNF394的引导序列。然后通过引物(oligo1:TAAGGGTTCTGCCAATCTCCGGAACandoligo2:AAACGTTCCGGAGATTGGCAGAACC)克隆相关序列并插入Puc57-sgRNA表达载体中（Addgene5132）。含有T7启动子及引导序列RNA的引物通过PCR进行扩增（Forwardprimer:GATCCCTAATACGACTCACTATAGReverseprimer:AAAAAAAGCACCGACTCGGT）。随后使用MEGAshortscriptKit(Amibion,AM1354)andmiRNeasyMicroKit(Qiaen,217084)转录并纯化引导序列RNA。Cas9质粒（Addgene44758）通过T7Ultrakit（Ambion，Am1345）进行转录。Cas9和引导序列RNA的mRNA通过FemtoJet5247显微注射系统注射入单细胞受精卵内。F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定（PrimersZNF394-124-F(5’-CTGGGCTTTGTACGGTGAA-3’)andZNF394-124-R(5’-ACTTCCTGGTAGCGCAACTG-3’)）野生型小鼠包含一段长124bp的DNA序列，而突变小鼠含有99bp的DNA序列。最终蛋白产物通过westernblot进行检测鉴定。

心脏特异性ZNF394转基因小鼠的构建：

用引物（上游引物：TGCTCTAGAGCCACCATGGCTGCAGGCTCTG；下游引物：TGCTCTAGACTAGGAGACTGAATTTTGATG）扩增小鼠ZNF394全长基因（NCBI，ZNF394musNM_023322.2），接着，扩增的ZNF394全长基因连接于我们构建的pCAG-loxP-CAT-loxP质粒后，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-ZNF394-hGHpA载体(CAG(chickenbeta-actin)-CAT(chloramphenicolacetyltransferase)-ZNF394-hGHpA)，将构建的质粒通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景），将得到的小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交，并通过他莫昔芬诱导（他莫昔芬80mg/KG/天，腹腔注射，连续刺激5天）得到心脏特异性ZNF394转基因老鼠。此后通过westernblot鉴定蛋白表达情况。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在SPF级实验动物中心，SRF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】ZNF394在正常人和心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏（非心脏原因的死亡捐献的个体）、扩张型心肌病患者心脏（做心脏移植手术病人置换的受体，DCM），对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识ZNF394蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP（Millipore，AB2232）、β-MHC（santacruz，sc53090）的抗体进行检测，测定其ZNF394（AVIVA，ARP37322_P050的表达，GAPDH（CellSignalingTechnology，2128）做内参。检测结果如图1所示，扩张型心肌病患者心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的表达明显上调，ZNF394的表达明显下调（图1）；

【实施例２】ZNF394在野生型小鼠Sham组和AB手术4W、8W心脏中的表达

1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程：

1.1术前准备

（1）麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准（一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间）。

（2）术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

（3）气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上（加热垫需提前预热），然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

1.2主动脉弓缩窄术

取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G（25.0-27.5g小鼠）或者27G（23.5-25.0g）注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组（Sham）在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚主动脉弓缩窄手术（AB）模型组。

1.3术后护理

主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

2.取材：

打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80℃冰箱保存后用于分子生物学检测。

3.ZNF394在Sham小鼠和AB小鼠心脏中的表达：

分别选野生型Sham小鼠和AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别ZNF394蛋白及心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的抗体进行检测，测定其ZNF394的表达，检测结果如图2所示。如图2所示，心肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、β-MHC的表达明显上调，ZNF394的表达在AB术后明显下调。

【实施例３】ZNF394在对照组（PBS）或血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞中的表达

分离培养新生1天Sprague-Dawley乳鼠心肌细胞，培养原代心肌细胞48h后换液，加入无血清的DMEM/F12饥饿心肌细胞12h使细胞同步化后，分别给予PBS、血管紧张素II（AngII,1μM）、苯肾上腺素（PE,1μM）刺激48小时,对心肌细胞提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot），结合特异性识别ZNF394蛋白及心肌细胞肥大标志物ANP、β-MHC的抗体进行检测，测定其ZNF394的表达，检测结果如图3所示。如图3所示，经血管紧张素II（AngII）或苯肾上腺素（PE）刺激后的心肌细胞中ANP、β-MHC的表达明显上调，ZNF394的表达明显下调。

【实施例４】ZNF394干扰（AdshZNF394）及过表达（AdZNF394）腺病毒对AngII刺激的原代心肌细胞ZNF394表达的影响

1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

分离培养新生1天Sprague-Dawley乳鼠心肌细胞，培养原代心肌细胞48h后换液。

2.ZNF394干扰（AdshZNF394）及过表达（AdZNF394）腺病毒对经AngII诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA（含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照）、AdshZNF394（含shRNA-ZNF394(沉默RNA-ZNF394融合蛋白)的腺病毒）、AdGFP（含GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒，用作对照）及AdZNF394（含GFP-ZNF394绿色荧光蛋白-ZNF394融合蛋白)的腺病毒）腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II（AngII）（购自Sigma公司，A9525）或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明AdshZNF394腺病毒感染后的心肌细胞表面面积较AdshRNA对照组增加，而经AdZNF394感染的心肌细胞表面面积则比对照组AdGFP明显减少（图4）。

【实施例５】小鼠心肌肥厚（AB）模型心肌肥厚及纤维化检测

1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程：

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g的野生型小鼠、ZNF394基因敲除小鼠、心脏特异性ZNF394转基因小鼠及非转基因小鼠各分成假手术组和心肌肥厚模型组，每组10只小鼠。造模方法同实施例2。

2.取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满质量分数10%KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用，再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10%KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL）。

3.病理学检测

3.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

3.2苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-ProPlus6.0软件圈细胞面积。

3.3麦胚凝聚素（WGA）染色

主要步骤为：先切片脱蜡，再用胰蛋白酶（DIG-3008，福州迈新）进行抗原修复，后用WGA-AF488（1mg/ml，W11261，Invitrogen）染色，最后封固剂封片（封固剂中包含DAPI，直接染核），显微镜拍照。

3.4天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计（Image-ProPlus6.0软件）：胶原比例=胶原面积/（总面积-空白面积）×100%。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

WT及ZNF394-KO小鼠AB模型后的表型结果见图5-7。Sham（假手术）组中WT及ZNF394-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，ZNF394-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠上升（图5）。HE及WGA染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，ZNF394-KO小鼠的心脏明显大于WT组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，ZNF394-KO组则比WT组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图6）。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；ZNF394-KO小鼠AB术后胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB术后增加较多（图7）。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ZNF394-KO小鼠的心肌肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。

图9-11是NTG和ZNF394-TG小鼠AB模型后的表型结果。同样TG小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL低于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图9）。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠。HE及WGA染色切片可观察到：TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组（图10）。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量小于NTG小鼠AB组（图11）。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ZNF394-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。

【实施例６】心肌肥厚（AB）模型小鼠心功能检测

1超声检测心功能

1.1前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

1.2心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂（天津成信公司）。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）、射血分数（EF）及短轴缩短率（FS）。

图8是WT和ZNF394-KO小鼠AB模型后心功能检测结果图。与WTSham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD增加，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，ZNF394-KO小鼠的心功能恶化程度大于WT小鼠（图8）。这些结果与ZNF394-KO小鼠心肌肥厚程度较大的结果一致。

图12是NTG和ZNF394-TG小鼠AB模型后的超声检测结果。与NTGSham组相比，NTG小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD增大，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则小于NTG组（图12）。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，ZNF394基因缺陷显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ZNF394基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此ZNF394基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是ZNF394基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>武汉大学

<120>锌指蛋白394（ZNF394）在治疗心肌肥厚中的应用

<130>1

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<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

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<223>全身性ZNF394基因敲除小鼠的构建上游引物

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<212>DNA

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<223>全身性ZNF394基因敲除小鼠的构建下游引物

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<212>DNA

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<223>含有T7启动子及引导序列RNA的上游引物

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<223>含有T7启动子及引导序列RNA的下游引物

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<223>全身性ZNF394基因敲除小鼠PCR鉴定上游引物

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<223>全身性ZNF394基因敲除小鼠PCR鉴定下游引物

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<223>小鼠ZNF394全长基因扩增上游引物

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<212>DNA

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<223>小鼠ZNF394全长基因扩增下游引物

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