提高L-半胱氨酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌

摘要

本发明提供一种被改造以降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性的属于肠杆菌科的细菌，其特征在于，所述属于肠杆菌科的细菌被改造以使硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域缺失，且在硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力，通过使用该属于肠杆菌科的细菌，能够廉价高效地制造L-半胱氨酸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力的属于肠杆菌科 的细菌、以及使用该细菌制造L-半胱氨酸的方法。

背景技术

半胱氨酸、胱氨酸类被广泛应用于医药品、化妆品、食品等多个领域。由 于半胱氨酸是主要由人类和动物的毛发较多含有的氨基酸，因此过去是通过水 解这些毛发来制造半胱氨酸。然而从进一步提高产品的安全性以及减少对环境 影响的观点出发，人们期待与其他很多氨基酸相同的发酵法进行制造。

目前已报告了多种通过使用属于肠杆菌科的细菌的发酵法制造半胱氨酸的 方法(专利文献1和2)。对于属于肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌，作为生物合 成半胱氨酸的途径存在两种途径，即硫酸盐作为硫源使用的途径(硫酸途径) 和硫代硫酸盐作为硫源使用的途径(硫代硫酸途径)(非专利文献1)。

已知使用属于肠杆菌科的细菌制造半胱氨酸时，一般作为硫源使用仅包含 硫酸盐的培养基也不能有效制造半胱氨酸，但是作为硫源使用硫酸盐的基础上 还包含硫代硫酸盐的培养基，则更有效制造半胱氨酸。

然而作为硫源使用的硫代硫酸盐，相比于硫酸盐非常昂贵。因此人们寻求 研发出作为硫源使用廉价的硫酸盐且有效制造半胱氨酸的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2009/104731

专利文献2：特开2010-193788号公报

非专利文献

非专利文献1：Nakatanietal.,‘Enhancementof thioredoxin/glutaredoxin-mediatedL-cysteinesynthesisfromS-sulfocysteine increasesL-cysteineproductioninEscherichiacolo’,MicrobialCellFactories,2012, 11:62

发明内容

本发明的目的在于提供一种在硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力的属 于肠杆菌科的细菌、以及使用该细菌廉价且有效地制造L-半胱氨酸的方法。

本发明人经过深入研究发现，O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B缺乏且硫代硫酸 结合蛋白质的C末端区域缺失的大肠杆菌突变株在仅含硫酸盐作为硫源的培养 基中也发挥很高的L-半胱氨酸生产能力。基于这些认识进一步研究后完成了本 发明。

即，本发明包含以下方面。

项1、一种属于肠杆菌科的细菌，所述属于肠杆菌科的细菌被改造以降低 O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的活性，其特征在于，

所述属于肠杆菌科的细菌被改造，以使硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域 缺失，且在硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力。

项2、根据项1所述的细菌，其特征在于，所述硫代硫酸结合蛋白质是下 述(a)或(b)中记载的蛋白质：

(a)由序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者

(b)由与序列号1所示的氨基酸序列具有85％以上同一性的氨基酸序列组 成，且具有硫代硫酸结合活性的蛋白质。

项3、根据项2所述的细菌，其特征在于，所述C末端区域是下述(c)或 (d)中记载的区域：

(c)包含由序列号1所示的氨基酸序列中第274～300位的氨基酸组成的区 域的区域；或者

(d)在与序列号1所示的氨基酸序列具有85％以上同一性的氨基酸序列 中，与包含由序列号1所示的氨基酸序列中第274～300位的氨基酸组成的区域 的区域相对应的区域。

项4、根据项1～3中任一项所述的细菌，其特征在于，所述O-乙酰丝氨酸 硫化氢解酶B是下述(e)或(f)中记载的蛋白质：

(e)由序列号3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者

(f)由与序列号3所示的氨基酸序列具有85％以上同一性的氨基酸序列组 成，且具有O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性的蛋白质。

项5、根据项1～4中任一项所述的细菌，其特征在于，对所述O-乙酰丝氨 酸硫化氢解酶B编码的基因被破坏。

项6、根据项1～5中任一项所述的细菌，其特征在于，所述属于肠杆菌科 的细菌是埃希氏菌属细菌。

项7、一种L-半胱氨酸的制造方法，其特征在于，从培养基中培养权利要 求1～6中任一项所述的细菌所得的培养物中采集L-半胱氨酸。

项8、根据项7所述的制造方法，所述培养基包含硫酸盐作为硫源。

项9、根据项8所述的制造方法，所述培养基还包含硫代硫酸盐作为硫源。

发明效果

根据本发明，能够提供一种在硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力的属 于肠杆菌科的细菌。通过使用该细菌，即使是仅含硫酸盐作为硫源的培养基， 也能很有效地制造L-半胱氨酸。由于硫酸盐相比硫代硫酸盐非常廉价，因此该 制造方法在成本方面优异。此外，在作为硫源除硫酸盐外还包含硫代硫酸盐的 培养基中培养，从而能够更高效地制造L-半胱氨酸。由于本发明的制造方法使 用微生物发酵，因此从所得产品的安全性或环境影响的观点出发，也是优异的 方法。

附图说明

图1是表示半胱氨酸的生物合成途径的示意图；

图2表示由硫代硫酸盐阻碍(硫代硫酸阻遏)以硫酸途径进行的半胱氨酸 生物合成；

图3表示不发生硫代硫酸阻遏的突变株(抑制基因突变株)的增殖曲线；

图4表示仅含硫酸盐作为硫源的培养基中的抑制基因突变株的半胱氨酸生 产能力；

图5表示除硫酸盐外还包含硫代硫酸盐作为硫源的培养基中的抑制基因突 变株的半胱氨酸生产能力。

具体实施例

1、细菌

本发明涉及一种属于肠杆菌科的细菌，为被改造以降低O-乙酰丝氨酸硫化 氢解酶B活性的属于肠杆菌科的细菌，其特征在于，所述属于肠杆菌科的细菌 被改造以使硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域缺失，且在硫酸盐存在下提高L- 半胱氨酸生产能力。

没有特别限定属于肠杆菌科的细菌，只要具有L-半胱氨酸生产能力，可以 是野生株，也可以是改造株。在这里，本发明中的L-半胱氨酸生产能力是指在 含有硫源的培养基中培养时，在培养基中积累L-半胱氨酸的能力。具体地，可 列举国家生物技术信息中心(NCBI：NationalCenterforBiotechnology Information)数据库中记载的按分类属于肠杆菌科的埃希氏菌属细菌、肠杆菌 属细菌、泛菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、沙雷氏菌属细菌，欧文氏菌属细菌， 沙门氏菌属细菌，摩根氏菌属细菌等、以及这些细菌的改造株(或突变株) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)，优选 可列举埃希氏菌属细菌及其改造株(或突变株)。

没有特别限定埃希氏菌属细菌，具体可使用奈德哈特(Neidhardt)等人的 著作(Backmann,B.J.1996.DerivationsandGenotypesofsomemutantderivatives ofEscherichiacoliK-12,p.2460-2488.Table1.InF.D.Neidhardt(ed.), EscherichiacoliandSalmonellaCellularandMolecularBiology/SecondEdition, AmericanSocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.)中列举的埃希氏菌属 细菌。其中，列举有大肠杆菌。大肠杆菌具体可列举来自原形野生株K12株的 大肠杆菌W3110(ATCC27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。

属于肠杆菌科的细菌的改造株中，优选进行改造以增强L-半胱氨酸生产能 力。可根据公知的方法进行这种改造。

对于细菌增强L-半胱氨酸生产能力时，可应用现有的育种棒状杆菌细菌或 埃希氏菌属细菌等时采用的方法，例如，获取营养缺陷型突变株、类似物抗性 株、代谢调控突变株、或创制L-半胱氨酸的生物合成基酶的表达增强的重组菌 株等(参照氨基酸发酵，学会出版中心有限公司，1986年5月30日初版发行， 第77～100页)。在这里，在L-半胱氨酸生产菌的育种中所提供的营养缺陷型、 类似物抗性、代谢调控突变等性质可以是一种，也可以是两种或三种以上。此 外，表达增强的L-半胱氨酸生物合成基酶也可以是一种，还可以是两种或三种 以上。进一步地，还可以将提供营养缺陷型、类似物抗性、代谢调控突变等性 质与生物合成基酶增强组合。

对于获取具有L-半胱氨酸生产能力的营养缺陷型突变株、L-半胱氨酸的类 似物抗性株或代谢调控突变株，可通过对亲株或野生株进行一般的诱变处理， 即照射X线或紫外线，或者通过N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸 乙酯(EMS)等诱变剂进行处理而得到的突变株中，选择表现出营养缺陷型、 类似物抗性或代谢调控突变，且具有L-氨基酸生产能力的细菌。

进行改造以增强L-半胱氨酸生产能力的具体例子包括但不限于下述属于大 肠杆菌属的细菌：大肠杆菌JM15(美国专利第6218168号)，其用对抗反馈抑 制的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)编码的多种cysE等位基因进行转型；大肠杆菌 W3110(美国专利第5972663号)，其具有对适合排除细胞中毒性物质的蛋白质 编码的过表达基因；半胱氨酸脱巯基酶活性降低的大肠杆菌株(特开平 11-155571号公报)；大肠杆菌W3110(WO01/27307)，其中通过cysB基因编 码的半胱氨酸调节子的阳性转录调控因子的活性上升等。

O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B是属于肠杆菌科的细菌中作为半胱氨酸生物合 成途径之一的硫代硫酸途径中起作用的酶，是具有将O-乙酰丝氨酸和硫代硫酸 盐作为底物合成S-磺基半胱氨酸(半胱氨酸前体)的活性的酶。除此以外，没 有特别限定O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B。具体地，可列举如序列号3所示的氨 基酸序列组成的蛋白质(大肠杆菌(Escherichiacoli)的cysM基因编码的蛋白 质)。

优选地，O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶可列举下述(e)或(f)中记载的蛋白 质。

(e)序列号3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者

(f)与序列号3所示的氨基酸序列具有85％以上同一性的氨基酸序列组成， 且具有O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性的蛋白质。

上述(f)中，同一性优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％ 以上，进一步还优选98％以上，尤其优选99％以上。

此外，作为上述(f)记载的蛋白质的一例，可列举如，

(f′)由对序列号3所示的氨基酸序列取代、缺失、附加或插入1个或多个 氨基酸的氨基酸序列组成，且具有O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性的蛋白质。

上述(f′)中，多个是指例如2～30个，优选2～15个，更优选2～8个，进 一步更优选2～5个，尤其优选2～3个。

上述(f)或(f′)中记载的蛋白质中，对于序列号3所示的氨基酸序列发 生突变的位点，只要该蛋白质具有O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性，则没有特 别限定。突变的位点优选不影响O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性的位点。例如 通过在属于肠杆菌科的细菌之间比较O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的氨基酸序 列，将细菌之间的同一性或相似性作为指标可确定这种位点。即，可推测同一 性或相似性低的位点是对O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性影响低(或无影响) 的位点。

O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性可按照公知方法，例如以下进行测定。通 过从属于肠杆菌科的细菌中纯化或从导入编码目标蛋白质的基因的细菌中纯化 等方法在属于肠杆菌科的细菌中表达的目标蛋白质，并在得到的目标蛋白质的 存在下，使O-乙酰丝氨酸和硫代硫酸盐起反应，通过检测是否生成S-磺基半胱 氨酸以及生成程度，从而可以进行测定。

“降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性”是指O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B 活性变得比非改造株，如属于野生株的肠杆菌科的细菌的活性低的状态。这种 状态具体地可列举每个细胞的O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的分子数下降的情 况，或每个分子的O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性降低的情况等。O-乙酰丝氨 酸硫化氢解酶B的活性与改造株相比较，优选每菌体降低到50％以下，优选降 低到30％以下，更优选降低到10％以下。此外“降低”还包含O-乙酰丝氨酸硫 化氢解酶B活性完全消失的情况。

对于“被改造以降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的活性”，只要是被改造 为“降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的活性”的状态，就没有特别限定，例如 对染色体上编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的基因进行改造，从而突变为该基 因中表达的蛋白质不发挥O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B活性(或者活性降低)的 状态；或者对染色体上编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的基因的转录调控区域 进行改造，从而使该基因处于不表达(或者使该基因的表达量减少)状态等。 这种改造可按照公知的方法进行，例如破坏编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的 基因，或者，改造启动子序列或夏因-达尔加诺(SD)序列等的转录调控区域。 更具体地，例如破坏编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的基因时，基于编码O- 乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的基因，使用公知的基因工程技术使部分序列缺失， 从而制成编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的缺失型基因，使用含有该缺失型基 因的DNA转化属于肠杆菌科的细菌，以导致该缺失型基因和染色体上编码O- 乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的基因之间进行同源重组，从而可以破坏基因。利用 这种利用同源重组的基因取代进行的基因破坏已被确立，有使用线性DNA的 方法或使用包含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(美国专利第6303383号 说明书，或特开平05-007491号公报)。此外，上述利用同源重组的基因取代进 行的基因破坏，还可以使用在宿主中无复制能力的质粒进行。

作为编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的基因，只要是上述编码O-乙酰丝 氨酸硫化氢解酶B的基因就没有特别限定，例如可列举包含序列号4所示的碱 基序列的DNA(大肠杆菌(Escherichiacoli)的cysM基因)。此外，还可以是 在严格条件下与序列号4所示的碱基序列或由该碱基序列制得的探针杂交的 DNA。“严格条件”是指形成所谓特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。 这种条件可列举60℃，1×SSC，0.1％SDS；优选对应于0.1×SSC、0.1％SDS 的盐浓度中清洗比1次更优选的2～3次的条件。

对于“被改造以降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的活性的属于肠杆菌科的 细菌”，可以基于上述“属于肠杆菌科的细菌”，使用通过如上所述“被改造以 降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的活性”而得到的细菌，也可以使用已进行这 种改造的属于肠杆菌科的细菌。这种细菌可列举国家生物资源项目(NBRP： http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/top/top.jsp)的大肠杆菌K-12的非必需基 因缺乏菌株库的JW2414株。

硫代硫酸结合蛋白质是属于肠杆菌科的细菌中作为半胱氨酸合成途径之一 的硫代硫酸途径中起作用的酶，是在细胞膜外具有与硫代硫酸盐结合的活性的 酶。没有特别限定硫代硫酸结合蛋白质。具体地，可列举如序列号1所示的氨 基酸序列组成蛋白质(大肠杆菌(Escherichiacoli)的cysP基因编码的蛋白质)； 序列号5所示的氨基酸序列组成蛋白质(由鼠伤寒沙门氏菌的cysP基因编码的 蛋白质)；以及序列号6所示的氨基酸序列组成蛋白质(克雷白氏杆菌的cysP 基因编码的蛋白质)。

优选地，O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶可列举下述(a)或(b)中记载的蛋白 质。

(a)序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者

(b)与序列号1所示的氨基酸序列具有85％以上同一性的氨基酸序列组 成，且具有硫代硫酸结合活性的蛋白质。

上述(b)中，同一性优选90％以上，更优先95％以上，进一步优选97％ 以上，进一步还优选98％以上，尤其优选99％以上。此外，序列号5或6所示 的氨基酸序列组成的蛋白质与序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有约 95％的同一性。

此外，作为上述(b)中记载的蛋白质的一例，可列举例如(b′)，

(b′)由对序列号1所示的氨基酸序列取代、缺失、附加或插入1个或多 个氨基酸的氨基酸序列组成，且具有硫代硫酸盐结合活性的蛋白质。

上述(b′)中，多个是指例如2～30个，优选2～15个，更优选2～8个，进 一步更优选2～5个，尤其优选2～3个。

上述(b)或(b′)中记载的蛋白质中，对于序列号1所示的氨基酸序列发 生突变的位点，只要该蛋白质具有硫代硫酸结合活性，则没有特别限定。突变 的位点优选不影响硫代硫酸结合活性的位点。例如通过在属于肠杆菌科的细菌 之间比较硫代硫酸结合蛋白质的氨基酸序列，将细菌之间的同一性或相似性作 为指标可确定这种位点。即，可推测同一性或相似性低的位点是对硫代硫酸结 合活性影响低(或无影响)的位点。

可通过公知方法测定硫代硫酸结合活性。

硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域只要是硫代硫酸结合蛋白质的C末端侧 的区域就没有特别限定。具体地可列举下述(c)或(d)中记载的区域。

(c)包含由序列号1所示的氨基酸序列中第274～300位氨基酸组成的区域 的区域；或者

(d)在与序列号1所示的氨基酸序列具有85％以上同一性的氨基酸序列 中，与包含由序列号1所示的氨基酸序列中第274～300位氨基酸组成的区域的 区域相对应的区域。

上述(c)和(d)中，对于“包含由序列号1所示的氨基酸序列中第274～300 位氨基酸组成的区域的区域”，只要包含由序列号1所示的氨基酸序列中第 274～300位氨基酸组成的区域，就没有特别限定，例如可列举包含由序列号1 所示的氨基酸序列中第274～300位氨基酸组成的区域，且由序列号1所示的氨 基酸序列第200～338位，优选第220～330位，更优选第240～320位，进一步优 选第260～310位，尤其优选第270～310位的氨基酸组成的区域内的任意区域。 此外“相对应的区域”是指将两个序列用BLAST比较时相对应的区域。

“被改造以使硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域缺失”是指被改造为菌体 内表达的硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域缺失的状态。这种状态具体可列举 通过对编码染色体上硫代硫酸结合蛋白质的基因进行改造，从而由该基因表达 C末端区域缺失的硫代硫酸结合蛋白质的状态。这种改造与对上述O-乙酰丝氨 酸硫化氢解酶B编码的基因的改造相同，可根据使用同源重组的公知的基因破 坏方法进行。

对于编码硫代硫酸结合蛋白质的基因，只要是编码上述硫代硫酸结合蛋白 质的基因，就没有做特别限定，例如可列举包含序列号2所示的碱基序列的DNA (大肠杆菌(Escherichiacoli)的cysP基因)。此外，还可以是在严格条件下与 序列号2所示的碱基序列或由该碱基序列制得的探针杂交的DNA。“严格条件” 是指形成所谓特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。这种条件可列举 60℃，1×SSC，0.1％SDS；优选对应于0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度中清洗 比1次更优选的2～3次的条件。

硫酸盐存在下的L-半胱氨酸生产能力是指在作为硫源包含硫酸盐的培养基 中培养时的L-半胱氨酸生产能力。优选地，是指仅含硫酸盐作为硫源的培养基 中培养时的L-半胱氨酸生产能力。硫酸盐的浓度可列举0.1～100mM，优选 1～80mM，更优选5～80mM，进一步优选10～50mM。

硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力是指与未被改造以使硫代硫酸结合 蛋白质的C末端区域缺失的“被改造以降低O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B的活 性的属于肠杆菌科的细菌”相比，在硫酸盐存在下提高了L-半胱氨酸生产能力。

由于本发明的细菌在硫酸盐存在下提高L-半胱氨酸生产能力，因此即使在 仅含廉价的硫酸盐作为硫源的培养基中，也可以高效生产L-半胱氨酸。

2、L-半胱氨酸的制造方法

本发明涉及一种制造L-半胱氨酸的方法，其特征在于，在培养基中培养上 述本发明的细菌所得到的培养物中，采集L-半胱氨酸。本发明还涉及一种制造 L-半胱氨酸的方法，包括：在培养基中培养上述本发明的细菌得到培养液；以 及从所得培养液中采集L-半胱氨酸。

培养基可以使用含有碳源、氮源、硫源、无机离子、以及根据需要的其他 有机成分的培养基，例如作为培养属于肠杆菌科的细菌的培养基的公知培养基。

碳源可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜和淀粉水解物等糖类、富马酸、 柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。碳源可以单独使用一种，也可以组合使用两种以 上。

氮源可以使用硫酸铵、氯化铵、磷铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮、 氨气、氨水等。氮源可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。

硫源可列举硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物盐、次硫酸盐、硫代硫酸盐等无机 硫化合物。从廉价的观点出发，可列举这些中的硫酸盐；在硫酸盐中也优选硫 酸钠、硫酸镁。此外，作为硫源使用除硫酸盐外还包含硫代硫酸盐的培养基， 从而可以更高效生产L-半胱氨酸。硫源可以单独使用一种，也可以组合使用两 种以上。

对于属于肠杆菌科的细菌，作为生产L-半胱氨酸的硫源不能有效使用硫酸 盐，但根据本发明的制造方法，使用包含硫酸盐的培养基也可以高效制造L-半 胱氨酸。

优选地，作为有机微量营养源可适量含有维生素B1等所需物质或酵母提 取物等。除这些之外，根据需要可少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子 等。

优选地，在有氧条件下实施30～90小时培养；优选地控制培养温度在25℃ ～37℃，培养中pH控制在5～8。此外pH的调节可使用无机或有机的酸性或碱 性物质、还有氨气等。

从培养物中采集L-半胱氨酸可通过组合通常的离子交换树脂法、沉淀法及 其他公知的方法实施。

根据本发明的制造方法，可以廉价且高效地制造L-半胱氨酸。此外，通过 上述方法得到L-半胱氨酸可以用于L-半胱氨酸衍生物的制造。作为半胱氨酸衍 生物包含半胱氨酸甲酯、半胱氨酸乙酯、羧甲司坦、S-磺基半胱氨酸、乙酰半 胱氨酸等。

实施例

下面根据实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限于这些实施例。

参考例1、分析大肠杆菌使用的硫源的选择性使用机制

大肠杆菌生物合成L-半胱氨酸的途径存在两个途径，即作为硫源使用硫酸 盐的途径(硫酸途径)和作为硫源使用硫代硫酸盐的途径(硫代硫酸途径)(图 1)。为了弄清楚这两个途径的选择性使用机制的一部分，在硫代硫酸途径中研 究了对于与半胱氨酸的前体S-磺基半胱氨酸的合成有关的酶(O-乙酰丝氨酸硫 化氢解酶B，图1)进行编码的基因(cysM)的缺陷株的硫源选择性。研究了 cysM缺陷株在仅含硫酸盐作为硫源的培养基，或包含硫酸盐和硫代硫酸盐二者 作为硫源的培养基中的生长性，具体如下所述。

在5mL的M9基本培养基(6g/LNa₂HPO₄、3g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、 6g/L葡萄糖、1mMMgCl₂、0.04％盐酸硫胺素、pH7.0)中接种大肠杆菌的野 生株(BW25113株)或大肠杆菌的cysM缺陷株(JW2414株(国立遗传学研 究所国家生物资源项目：http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/top/top.jsp))，并 在37℃中培养一个晚上。对得到的培养液使用生理盐水或水逐次以10倍进行 稀释，制作稀释系列(10^－2～10^－6)。将稀释菌液逐次以5μL点样至只添加MgSO₄(终浓度0.12g/L)作为硫源的M9基本琼脂培养基(1.5％琼脂)、添加MgSO₄(终浓度0.12g/L)和Na₂S₂O₃(终浓度0.16g/L)作为硫源的M9基本琼脂培养 基或者除这两种硫源外还添加胱氨酸(终浓度0.24g/L)的M9基本琼脂培养基， 并在37℃中培养一个晚上。结果如图1所示。

根据图2所示，cysM缺陷株(ΔcysM)在仅含硫酸盐作为硫源的培养基中 呈现与野生株(WT)相同的生长性(图2中的上段)。然而cysM缺陷株在包 含硫酸盐和硫代硫酸盐作为硫源的培养基中呈现相比野生株显著低的生长性 (图2的中段)。该生长性的降低是因为通过除硫酸盐和硫代硫酸盐外还加入胱 氨酸而恢复(图2的下段)，可知原因是缺乏半胱氨酸。

由cysM编码的O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B是由进入菌体内的硫代硫酸盐 和O-乙酰丝氨酸合成S-磺基半胱氨酸(半胱氨酸前体)的酶，因此在硫代硫酸 盐存在下培养不存在上述酶的cysM缺陷株时，则不发生通过硫代硫酸途径进 行的半胱氨酸合成，所以菌体内中积累硫代硫酸盐。另一方面，由于cysM缺 陷株在硫酸途径中不引起任何突变，因此应能正常进行基于硫酸途径的半胱氨 酸合成。然而如图2所示，cysM缺陷株在仅含硫酸盐作为硫源的培养基中正常 生长，但是在包含硫酸盐和硫代硫酸盐作为硫源的培养基中，由于缺乏半胱氨 酸从而显著降低生长性。这表示cysM缺陷株中积累在菌体内的硫代硫酸盐妨 碍通过硫酸途径合成半胱氨酸。

根据上述内容，即使在作为硫源包含硫酸盐和硫代硫酸盐二者的培养基中 培养野生株，也由于进入到菌体内的硫代硫酸盐妨碍通过硫酸途径合成半胱氨 酸(下面也可以将这一机制表示为“硫代硫酸阻遏(TSR)”)，这强烈表明主要 通过硫代硫酸途径合成半胱氨酸。

实施例1、获得不发生硫代硫酸阻遏的突变株

即使作为硫源同时存在硫酸盐和硫代硫酸盐，但在半胱氨酸合成中实际表 明只使用了硫代硫酸盐(参考例1)。据此认为，同时包含硫酸盐和硫代硫酸盐 作为硫源的状态中，如果能获得通过硫酸途径和硫代硫酸途径合成半胱氨酸的 突变株(不发生硫代硫酸阻遏的突变株)，则可通过该突变株有效地合成半胱氨 酸。因此尝试获得这种突变株。具体进行下述尝试。

在添加MgSO₄(终浓度0.12g/L)和Na₂S₂O₃(终浓度0.16g/L)作为硫源 的5mL的M9基本培养基(以下称为“M9基本培养基(SO₄+、S₂O₃+)”)中 接种大肠杆菌的cysM缺陷株，并在37℃中培养40小时。图3示出了该培养中 的cysM缺陷株的增殖曲线(图3的cysM)。根据图3，即使在硫酸盐和硫代硫 酸盐的存在下培养cysM缺陷株，从开始培养经过22小时几乎没有增殖，但是 之后慢慢增殖，最终增殖至与野生型相同程度的浊度。这认为在培养中，由cysM 缺陷株生成不发生硫代硫酸阻遏的突变株。因此，在M9基本培养基(SO₄+、 S₂O₃+)的琼脂培养基上接种培养液，培养一个晚上之后，从琼脂培养基中分 离突变株的单菌落。将分离的突变株接种到5mL的M9基本培养基(SO₄+、 S₂O₃+)，在37℃中培养40小时。图3示出了该培养中的突变株的增殖曲线(图 3的Sup1)。根据图3，开始培养后约4个小时，突变株的培养液的浊度上升。 这与野生株(图3的WT)的生长性相同。如此，由于得到的突变株即使在硫 酸盐和硫代硫酸盐存在下培养也表现出与野生株相同的生长性，因此是不发生 硫代硫酸阻遏的突变株(下面称该突变株为“抑制基因突变株(Sup1)”)。

实施例2、抑制基因突变株的突变点解析

在实施例1中得到的抑制基因突变株中，为了鉴定从cysM缺陷株突变的 部分，使用下一代测序仪分析这些菌株的基因组。具体进行如下：

抽取并纯化抑制基因突变株和cysM缺陷株的基因组，并使用454GSjunior 深度测序仪(Roche公司制造)对得到的基因组进行重新定序。其结果是这两 株共同得到平均约480bp的长解码物(read)约20万条，cysM缺陷株可得到 约84Mbp的序列信息，抑制基因突变株可得到约98Mbp的序列信息(表9)。 考虑到大肠杆菌基因组是约5Mbp，而cysM缺陷株中是约大肠杆菌的16倍的 量，抑制基因突变株中是约20倍的量，因此认为这些量的基因组信息足以分析 突变点。此外，解码物平均长度为480bp，这比使用如Solid等其他下一代测序 仪时的解码物长。

cysM缺陷株的亲株野生株(BW25113株)的基因组尚未被确定。因此， 对认为与BW25113株近缘的MG1655株的基因组信息映象通过454GSjunior 获得的基因组信息，比较了两个基因组之间的SNPs以及20bp以上的突变。

SNPs分析结果对于MG1655、cysM缺陷株与抑制基因突变株之间产生的 SNPs没有差异。接着比较20bp以上突变的结果，有意思的是，确认了只有抑 制基因突变株中作为Cys合成相关基因的cysP基因内发生81bp的缺失。具体 地，表示cysP基因的ORF的序列号2中，第820～900位(81bp)缺失。该缺 失区域相当于在表示编码cysP基因的硫代硫酸结合蛋白质的氨基酸序列的序 列号1中的第274～300位的氨基酸区域。

实施例3、抑制基因突变株的半胱氨酸生产能力

研究了抑制基因突变株的半胱氨酸生产能力。具体进行如下：

对于CysM缺陷株和抑制基因突变株引入提高半胱氨酸生产能力的质粒 (pDES)。pDES具有在OmpA启动子的控制下对pACYC184质粒插入突变为 第410位的氨基酸(苏氨酸)转换成终止密码子的serA基因、ydeD基因以及 突变为第167号的氨基酸(苏氨酸)转换成丙氨酸的cysE基因。通过突变型serA 基因和突变型cysE基因，减轻反馈抑制，由基因ydeD促进半胱氨酸排出到细 胞外。将得到的菌株(cysM缺陷株(pDES+)、抑制基因突变株(pDES+)) 接种在20mL的LB(+Tet)培养基(1％胰蛋白胨(Bactotrypton)、0.5％酵母 提取物(Yeastextract)、1％NaCl、10μg/ml四环素)中，在30℃中进行预培养 18～22小时，直到稳定期。测定稳定期的培养液的OD₆₆₀，OD₆₆₀＝0.4→1％菌种 接种在30mL的SM1(+10％LB+Tet)培养基(0.1MKH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液 (pH7.0),30g/L葡萄糖,10g/L(NH₄)₂SO₄,0.1g/LNaCl,7.2μMFeSO₄·7H₂O, 0.6μMNa₂MoO₄,40.4μMH₃BO₃,2.9μMCoCl₂,1μMCuSO₄,8.1μMMnCl₂,1mM MgSO₄,0.1mMCaCl₂，10％LB培养基，12.5μg/ml四环素)中。接种后，为 了防止与Cys同时合成的醋酸引起pH降低，添加0.6g的CaCO₃。将单独MgSO₄， 或Na₂S₂O₃和MgSO₄二者作为硫源，在培养后的第6个小时添加Na₂S₂O₃，以 使终浓度达到20mM。开始培养后每12小时取样600μL。将各样品40μL悬浮 于1mL的0.1N盐酸中(为了溶解包含于培养基中的CaCO₃)，测定OD₅₆₂确认 生长。对剩余的样品以12000rpm进行离心分离，并收回培养基上清液，测定 Cys积累量。通过酸性茚三酮法(Gaitondeetal.,1967)测定Cys积累量。使50μL 培养基上清液与10mMDTT(pH8.6)50μL反应10分钟，加入100μL醋酸、 100μL的12N盐酸并搅拌，在105℃中加热20分钟。加热后进行冷却，加入 1.5mL的乙醇，测定OD₅₆₀，并根据预先制成的Cys的校正曲线确认Cys积累 量。图4示出了单独加入MgSO₄作为硫源时的结果，图5示出了加入Na₂S₂O₃和MgSO₄二者作为硫源时的结果。

根据图4，抑制基因突变株(图4的sup1_pDES(+SO₄))在仅含硫酸盐 作为硫源的培养基中显示出远高于亲株cysM缺陷株(图4的ΔcysM_pDES(+ SO₄))的半胱氨酸生产能力。根据不发生硫代硫酸阻遏的指标筛选的抑制基因 突变株，即使在硫代硫酸盐不存在(原本不发生硫代硫酸阻遏)下也显示比cysM 缺陷株高的半胱氨酸生产能力，这完全出乎预想之外。此外，cysM缺陷株由于 硫酸途径合成半胱氨酸是完整的，因此仅含硫酸盐作为硫源的培养基中的半胱 氨酸生产能力为与野生株同等程度。因此，根据图4的结果表明，相比野生株， 抑制基因突变株有效地进行硫酸盐作为硫源的半胱氨酸生产。

根据图5，抑制基因突变株(图5的sup1_pDES(+S₂O₃+SO₄))在包含 硫酸盐和硫代硫酸盐二者作为硫源的培养基中显示出远高于亲株cysM缺陷株 (图5的ΔcysM_pDES(+S₂O₃+SO₄))的半胱氨酸生产能力。并且，相比仅 含硫酸盐作为硫源时的抑制基因突变株的半胱氨酸生产能力，包含硫酸盐和硫 代硫酸盐二者作为硫源时更高(图4和图5的纵轴比较)。即通过除硫酸盐外进 一步添加硫代硫酸盐，提高了抑制基因突变株的半胱氨酸生产能力。抑制基因 突变株是硫代硫酸途径中起作用的两个基因突变(一个基因缺乏)形成的，而 通过硫代硫酸盐提高半胱氨酸生产能力是完全预想之外的。