银包钯纳米制剂在制备抗隐球菌感染药物中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体涉及银包钯纳米制剂(Pd@Ag)在制备抗隐球菌感染药物中的应用。本发明经细胞实验表明，在多种常见的侵袭性真菌病原体之中，不同直径银包钯纳米制剂仅对隐球菌具有良好的抑制活性，其抗真菌活性显著高于氟康唑(FCZ)。本发明还进一步提供了银包钯纳米制剂与两性霉素B联合在制备抗隐球菌感染药物中的应用。本发明经实验证明Pd@Ag纳米制剂与AmB具有协同抗隐球菌效应。本发明为银包钯纳米制剂开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物或抗真菌药物的增效剂，不仅能提高药物的抗真菌作用，而且在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋严重的情况，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，具有良好的临床应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及银包钯纳米制剂在制备抗隐球菌感染药物中的应用。

背景技术

隐球菌(Cryptococcosus)是遍布自然界的一种重要酵母菌，隐球菌属包括70余种，其中临床致病感染以新生隐球菌和格特隐球菌最为常见。隐球菌主要经宿主呼吸道吸入侵犯肺部，临床多表现为无症状性肺炎，常为宿主正常免疫功能所清除或转化为潜伏感染状态；当机体免疫功能严重抑制或削弱时，潜伏在肺部的隐球菌活化入血循环、播散引发系统性感染，尤嗜感染中枢神经系统。隐球菌感染的临床结局主要取决于其毒性因子表达与宿主免疫应答能力之间的相互作用，当机体免疫力下降时，病原菌可直接侵入并引起血行传播，故长期使用免疫抑制剂或糖皮质激素的患者、艾滋病、白血病等患者易患本病。隐球菌感染依照临床表现可分为肺隐球菌病、中枢神经系统隐球菌病、皮肤黏膜隐球菌病、骨隐球菌病及内脏隐球菌病五型。

隐球菌病的临床治疗主要依赖于抗真菌药物，通常可选用的药物主要包括两性霉素B及其脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶等。然而，这些抗真菌药物具有显著的毒副作用和日趋上升的耐药性，是当前困扰侵袭性真菌病临床治疗的重要挑战。两性霉素B疗效确切，但剂量相关的药物毒副作用(如肝肾毒性、溶血性贫血等)对基础情况不佳的患者考验重大，令很多临床医师望而生畏；氟康唑可以透过血脑屏障进入中枢神经系统，是临床为数不多可用于隐球菌感染治疗的可选药物，然而其临床耐药株已然出现，且单独用药时疗效不佳；氟胞嘧啶单药治疗可迅速诱导临床耐药。因此，尽快研发出新型安全高效的抗真菌药物或联合用药方案已然迫在眉睫。

近十年来，纳米科技在全球范围内掀起了一场新的工业革命，推动了生物、医药、信息、化工、国防等领域科技的巨大发展。纳米银材料，具有稳定的物理化学性能(表面等离子体共振效应SPR)，可有效杀灭多数细菌、真菌以及肿瘤细胞，已广泛应用于医疗卫生、医疗器械、纺织、涂料、日用品、生态环境等领域。然而，纳米银材料的光热稳定性较差，经强光照射后物理生物特性可发生改变，在此基础上新合成的银包钯纳米材料(Pd@Ag)显著克服了该缺点。银包钯纳米材料以理化特性良好的钯纳米制剂为“种子”，加入不同比例的还原态银离子后形成不同直径的Pd-Ag核心-外壳双金属纳米材料，其大小形状均匀，光热转化效率高，光热稳定性和生物兼容性极佳，目前已成功应用于抗恶性肿瘤及抗细菌感染治疗研究(HuangX,TangS,LiuB,RenB,ZhengN.Enhancingthephotothermalstabilityofplasmonicmetalnanoplatesbyacore-shellarchitecture.AdvMater.2011.23(30):3420-5.；MoS,ChenX,ChenM,HeC,LuY，ZhengN.Two-dimensionalAntibaterialPd@AgNanosheetswithaSynergeticEffectofPlasmonicHeatingandAg+Release.JMaterChemB.2015(Accepted).)。

但目前尚未见有关银包钯纳米制剂用于抗隐球菌治疗的相关报道，也未见有关银包钯纳米制剂和其他抗隐球菌药物联用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供银包钯纳米制剂的新用途，具体是银包钯纳米制剂在制备抗隐球菌感染药物中的应用。

本发明的第一方面，提供了银包钯纳米制剂在制备抗隐球菌感染药物中的应用。

所述的银包钯Pd@Ag纳米制剂，粒径为1-120nm。

所述的银包钯Pd@Ag纳米制剂，粒径为5-120nm具有较佳的抗隐球菌效应；最佳的，粒径为80nm。

本发明经细胞实验表明，在多种常见的侵袭性真菌病原体之中，不同直径银包钯纳米制剂仅对隐球菌具有良好的抑制活性，其抗真菌活性略次于两性霉素B(AmB)，但显著高于氟康唑(FCZ)。

而且，低浓度(≤5μg/ml)不同直径的Pd@Ag纳米制剂对HeLa细胞的毒副作用较小。

在本发明的一个优选实施例中，Pd@Ag纳米制剂(80nm)对不同基因型新生/格特隐球菌的临床株或分离株均有良好的抑菌效应。

本发明所述的抗隐球菌感染药物，是以Pd@Ag纳米制剂作为唯一活性成份，或者包含Pd@Ag纳米制剂的药物组合物。

所述的抗隐球菌感染药物中Pd@Ag纳米制剂的含量为0.1-99wt％。

较佳地，所述的抗隐球菌感染药物中Pd@Ag纳米制剂的含量为0.5-51wt％。

所述的抗隐球菌感染药物，为Pd@Ag纳米制剂和常用的药学辅料制备得到的药物制剂。

本发明的Pd@Ag纳米制剂可以按常规药剂学制备成药物制剂，如口服制剂、注射制剂、输液制剂或透皮吸收的药物制剂等。

本发明的第二方面，提供了银包钯纳米制剂与两性霉素B联合在制备抗隐球菌感染药物中的应用。

进一步地，本发明提供了一种联合用药方法，具体为一种抗隐球菌联合用金属纳米药物，所述的联合用药物其活性成分为银包钯纳米制剂与两性霉素B。

本发明所述的联合用药方案，可同时或序贯施用有效量的银包钯纳米制剂与有效量的两性霉素B。所述的顺序可以是先用银包钯纳米制剂，再用两性霉素B；也可以是先用两性霉素B，再用银包钯纳米制剂。

本发明经实验证明，Pd@Ag纳米制剂与AmB具有协同抗隐球菌效应。在对常见隐球菌标准株的药敏试验中，单独作用时，Pd@Ag纳米制剂的MIC值为0.25-2μg/ml，AmB的MIC值为0.125-1μg/ml,而联合作用后Pd@Ag纳米制剂(80nm)和AmB的MIC值分别降为0.06和0.004μg/ml，联用指数FICI均小于0.5，可见二者合用对隐球菌有显著的协同抗菌作用。

本发明所述的药用载体，即药学上可接受的载体，是指药学领域中常用的除活性成分以外添加物，例如稀释剂(淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐类)、赋形剂等，填充剂如淀粉蔗糖、粘合剂如水、乙醇、纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮，崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠，增溶剂如聚山梨酯类和聚氧乙烯脂肪酸酯类等，吸收促进剂、表面活性剂如吐温、司盘，吸附载体、润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等。另外，还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明为银包钯纳米制剂开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物或抗真菌药物的增效剂，不仅能提高药物的抗真菌作用，而且在临床治病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋严重的情况，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为Pd@Ag纳米制剂对HeLa细胞的毒性检测。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1.不同直径的银包钯Pd@Ag纳米制剂对多种常见的侵袭性真菌病原体的抑制实验

实验材料：

银包钯纳米制剂所需的合成原料：2,4-戊二酸钯Pd(acac)2(99％)购自AlfaAesar公司，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW＝30000)、二甲基甲酰胺(DMF)、溴化钠(NaBr)和硝酸盐(AgNO₃)购自国药集团化学试剂有限公司，四丁基溴化铵(TBAB)购自AcrosOrganics公司。氟康唑(FCZ)购自辉瑞制药有限公司，抗真菌药物两性霉素B(AmB)、RPMI1640液体培养液以及PDA培养基均购自Sigma-Aldrich公司。

研究所用的常见病原真菌标准株均由上海市医学真菌分子生物学重点实验室提供，除H99、R265、SC5314保留原始标准号外，其它标准株采用ATCC编号。

仪器设备：

MultiskanMK3型酶标检测仪(芬兰Labsystems产品)

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)

THZ－82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)

SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)

实验方法：

一、纳米材料合成

不同直径(5，11，30，80，120nm)的银包钯纳米制剂均委托厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室合成，具体方法参照参考文献(HuangX,TangS,LiuB,RenB,ZhengN.Enhancingthephotothermalstabilityofplasmonicmetalnanoplatesbyacore-shellarchitecture.AdvMater.2011.23(30):3420-5.)。

二抗真菌药敏实验

本实验采用美国临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)CLSI-M27A3(SafdarA,HannaHA,BoktourM,etal.Impactofhigh-dosegranulocytetransfusionsinpatientswithcancerwithcandidemia:retrospectivecase-controlanalysisof491episodesofCandidaspeciesbloodstreaminfections.Cancer.2004.101(12):2859-65.)和M38A2(RomaniL.Immunitytofungalinfections.NatRevImmunol.2011.11(4):275-88.)文件所推荐的微量液基稀释法(BrothMicrodilution)配制上述药物的贮存液及倍比稀释液(0.125mg/L-64mg/L)。

试验前所有受试菌均接种在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上28℃培养7d使其活化。在孵育7d的菌落上加入含有0.01mL吐温20(1滴)的0.85％盐水1mL，制备菌悬液；菌悬液静置3-5min后，大颗粒沉于底部，取上层均质液体(含孢囊孢子或分生孢子以及菌丝片段)；用血细胞计数板将菌悬液浓度用RPMI1640培养液调整至2×10⁶-1×10CFU⁷/mL。最后将上述已经配置好的菌悬液用RPMI1640培养液稀释1000倍。使其浓度介于2×10³-1×10⁴CFU/mL之间。常见的酵母菌病原体如隐球菌、念珠菌采用CLSI-M27A3法，常见的丝状真菌病原体如曲霉、毛霉则采用CLSI-M38A2法(具体操作见参考文献)。静置培养4-7d后观察判读结果，最低抑菌浓度(MIC)的判定标准：结果判定在显微镜下进行，与阳性对照孔对比完全抑制，无生长的最低浓度。所有菌株均进行2次重复试验，每次试验均包含标准菌株的测定以保证试验准确。

实验结果：

结果如表1所示，结果显示在多种常见的侵袭性真菌病原体之中，不同直径银包钯纳米制剂均对隐球菌具有良好的抑制活性，其MIC值约为0.25-1mg/L，其抗菌活性略次于两性霉素B(AmB，MIC＝0.125-0.5mg/L)，但显著高于氟康唑(FCZ，MIC＝16mg/L)。

表1：Pd@Ag纳米制剂对常见侵袭性致病酵母和丝状病原真菌的抗真菌活性检测结果

注：FCZ为氟康唑；AmB为两性霉素B。

实施例2.不同浓度的银包钯Pd@Ag纳米制剂对HeLa细胞的毒性实验

实验材料：

银包钯Pd@Ag纳米制剂(5，11，30，80，120nm)同实施例1。人宫颈癌细胞(HeLa)，购自中科院细胞所。

需要的试剂：

DMEM培养基购自美国LifeTechnologies公司

CCK-8试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司

仪器设备：

Synergy2多功能检测仪(德国BioTek产品)

二氧化碳细胞培养箱(日本Sanyo电器公司)

SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)

实验方法：

实验前将HeLa细胞(1×10⁴cells/ml)接种于96孔板中，DMEM培养基，37℃，5％CO₂细胞培养箱中预培养24小时。细胞铺满孔底后，将细胞于不同浓度(0、1、2、5、10、20mg/L)不同直径的银包钯Pd@Ag纳米制剂中再次孵育24小时(37℃，5％CO₂)。作用24小时后，向每孔加入10ulCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2小时，随后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。在不含细胞的培养基中加入CCK-8检测作为空白对照。处理组通过和不加药物的对照组对比获得细胞活性。

实验结果：

结果如图1所示，总体上随着药物浓度的增加，银包钯纳米制剂对HeLa细胞的毒性逐步增强。在同等浓度时，5nm直径的Pd@Ag纳米制剂相对而言毒性最强，而其余四种(11，30，80，120nm)Pd@Ag纳米制剂对HeLa细胞的抑制作用无显著差异(P＞0.05)。在较高药物浓度时，不同直径纳米制剂对HeLa细胞具有明显的抑制效应，如与10μg/mL纳米制剂共孵育时HeLa细胞的生存率约为原始的60％-69％。

当银包钯纳米制剂浓度低于5μg/mL，则对HeLa细胞无明显抑制作用，5μg/mL时HeLa细胞生存率约为90％-98％，而1-2μg/mL时HeLa细胞生存率正常。因此，低浓度(≤5μg/mL)Pd@Ag纳米制剂(11-120nm)对HeLa细胞毒副作用较小，而最低抑菌浓度时基本无毒副作用。

实施例3.Pd@Ag纳米制剂(80nm)对不同基因型新生/格特隐球菌的临床株或分离株的抑菌实验

实验材料：

银包钯Pd@Ag纳米制剂(80nm)同实施例1。

研究所用不同基因型的所有隐球菌临床或环境分离株均由上海市医学真菌分子生物学重点实验室提供，其菌种保藏号依次为SCZ9001-SCZ9045。

实验方法：

结合实施例1与例2的结果，我们发现11nm、30nm、80nm直径的Pd@Ag纳米制剂均具有较好的抑隐球菌效应(MIC＝0.5μg/mL)、低浓度时对HeLa细胞无明显毒副作用，而较之11nm和30nm纳米制剂，80nm纳米制剂对其它病原真菌抑菌作用更强，因此本发明进一步评估了Pd@Ag纳米制剂(80nm)对不同基因型、不同来源隐球菌的干预效应。

本实验采用美国临床实验室标准化协会CLSI-M27A3法检测Pd@Ag纳米制剂(80nm)对不同隐球菌的抑菌效应，其具体方法步骤详见实施例1。

实验结果：

结果如表2所示，结果显示Pd@Ag纳米制剂(80nm)对不同基因型新生/格特隐球菌的临床株或分离株均有良好的抑菌效应。对于新生隐球菌而言，不同基因型的临床或环境分离株，Pd@Ag纳米制剂(80nm)的最小抑菌浓度约为0.25-2μg/mL(平均MIC90＝2μg/mL)；银包钯对格特隐球菌的抑菌效应相近，MIC为0.25-2μg/mL(平均MIC90＝1μg/mL)。

上述研究结果提示，Pd@Ag纳米制剂(80nm)对各种基因型及不同来源的隐球菌病原菌均具有良好的抑制效应，其抑菌作用略次于两性霉素B，具备成为抗隐球菌感染治疗药物的潜质。

表2Pd@Ag纳米制剂(80nm)对不同基因型及不同来源隐球菌的抗真菌活性检测结果。

备注：*为隐球菌的基因型或来源，Cn为新生隐球菌，其基因型(VNI，II，III，IV)，Cg为格特隐球菌，其基因型(VGI，II，III，IV)；来源包括临床患者分离(clinical)、动物标本分离(animal)及环境标本分离(environmental)。

实施例4.Pd@Ag纳米制剂(80nm)与两性霉素AmB具有协同抗隐球菌效应实验

实验材料：

银包钯Pd@Ag纳米制剂(80)、两性霉素B同实施例1。不同基因型的新生/格特隐球菌均由上海市医学真菌分子生物学重点实验室提供。

实验方法：

菌液制备、结果判读等方法同实施例1。

药敏板制备方法如下：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液99μl；2号孔分别加菌液196μl和银包钯Pd@Ag纳米制剂(80nm)2μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。调配不同浓度的AmB0.128、0.064、0.032、0.016、0.008、0.004μg/mL,在每排的2号孔加相应浓度的AmB2μl，3～11号孔各加1μl。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终银包钯Pd@Ag纳米制剂(80)浓度分别2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03、0.015、0.008、0.004μg/ml。而AmB的浓度保持恒定，各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

实验结果：

结果如表3所示，结果显示Pd@Ag纳米制剂(80nm)与AmB具有协同抗隐球菌效应。在对常见隐球菌标准株的药敏试验中，单独作用时，Pd@Ag纳米制剂(80nm)的MIC值为0.25-2μg/ml，AmB的MIC值为0.125-1μg/ml,而联合作用后Pd@Ag纳米制剂(80nm)和AmB的MIC值分别降为0.06和0.004μg/ml，联用指数FICI均小于0.5，可见二者合用对隐球菌有显著的协同抗菌作用。

表3Pd@Ag纳米制剂(80nm)与AmB的联合抗真菌活性检测。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。