一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用

摘要

一种具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用，本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，它为了解决现有缺少从乳铁蛋白中获取促进成骨细胞增殖活性的蛋白肽的方法。制备方法：一、乳铁蛋白与去离子水混合，调节pH；二、胃蛋白酶加入到乳铁蛋白溶液中，水浴反应；三、过滤后采用阳离子交换柱分离纯化，然后透析冻干；四、过滤后采用凝胶过滤层析柱进行纯化；五、最后进行干燥处理得到该乳铁蛋白肽。本发明以牛乳铁蛋白为原料，制备得到的乳铁蛋白肽对成骨细胞具有良好的促进其增殖的效果。制备得到的该乳铁蛋白肽可以应用于保健食品或功能性食品中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，具体涉及一种以牛乳铁蛋白为原料制备具有 促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法及应用。

背景技术

骨质疏松症在我国是一种常见的多发疾病，它对中老年人，尤其是绝经后妇女的身体 健康造成了十分严重的影响。骨质疏松可以引起骨折胸廓畸形等多种并发症，不仅使患者 本人饱受病痛折磨，还会使患者及家庭承受沉重的生活和经济压力。据预计，到2020年 我国骨质疏松和低骨量患者人数将增加至2.8亿。全国性大规模流行病学调查也显示，国 内骨质疏松症总患病率为12.4％，老年人患病比例超过50％。骨质疏松症已严重威胁中老 年人健康，因此，有关骨质疏松防治的功能性食品开发已经成为当今食品界的热点问题。

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种具有转铁功能的糖蛋白，分子量大小约为78kDa， 主要存在于乳清蛋白中，是乳中重要的功能性成分。目前研究表明，乳铁蛋白在生理浓度 下可以促进骨的合成代谢，LF可以诱导原代成骨细胞体外分化，也可促进成骨细胞系的增 殖，而且还可以作为存活因子，防止由于血清剥夺导致的成骨细胞凋亡，通过抑制破骨细 胞的发育和活性从而抑制骨吸收，因此LF可以作为一种潜在的骨质疏松治疗剂和骨修复 因子。

乳铁蛋白在被人体摄入后，必须要经过胃肠道消化吸收。现代生物代谢研究表明，人 体摄取的蛋白质经消化道多种酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、肠蛋白酶 等水解后，不是仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式直接吸收，且乳铁蛋白小 肽的生物活性可能要远高于整个乳铁蛋白分子。而且目前对乳铁蛋白生物活性肽的研究， 主要集中在乳铁蛋白肽的抗菌活性、抗病毒活性以及降血压功能，但对促进成骨细胞增殖 活性的乳铁蛋白肽却未有报道。所以，研究开发一种具有更高促进成骨细胞增殖活性的乳 铁蛋白肽具有良好的开发和应用潜力。

乳铁蛋白作为牛乳中重要的功能性成分，对其生物活性肽的研究较多，目前，骨质疏 松症的治疗方法较多，但仍以药物治疗为主。常用的药物有骨吸收抑制剂、骨形成促进剂 和骨矿化物。骨吸收抑制剂是主要针对破骨细胞的药物，通过抑制破骨细胞的活动而减少 骨的重吸收；骨形成促进剂则是主要针对成骨细胞的药物，能够增强成骨细胞的活性，促 进新骨的合成；矿化物是治疗骨质疏松的基础用药，包括钙剂和维生素D，可以起到补充 骨基质成分的作用。但当前治疗骨质疏松的药物绝大多数为骨吸收抑制剂(如雌激素、双 膦酸盐、降钙素等)，而骨形成促进剂的种类却非常少。而具有促进成骨细胞增殖活性的 乳铁蛋白肽可作为一种潜在的骨形成促进剂用于治疗和预防骨质疏松剂。所以，对乳铁蛋 白促进成骨细胞增殖活性肽的研究开发具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有缺少从乳铁蛋白中获取促进成骨细胞增殖活性的蛋白 肽的方法，从而提供一种具有促进成骨细胞增殖分化活性的乳铁蛋白肽及其制备方法。

本发明具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法按以下步骤实现：

一、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为2％～8％的乳铁蛋白水溶液，然 后用HCl调节体系的pH至1.2～2.5，得到乳铁蛋白溶液；

二、将胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，在35℃～40℃水浴3～10min 后冰浴冷却，加入碱性调节剂调节体系的pH至6～7终止反应，然后离心处理获取上清液， 除盐后得到乳铁蛋白活性肽的酶解液；

三、将乳铁蛋白活性肽的酶解液进行膜过滤，然后通过SPSepharoseFastFlow阳离 子交换柱分离纯化，采用缓冲溶液A和缓冲溶液B线性梯度洗脱，检测波长为215nm和 280nm，收集第5个峰的洗脱组分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁 蛋白活性肽；

四、用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为1～3mg/mL的乳铁蛋 白活性肽溶液，经滤膜过滤后采用SuperdexPeptide10/300GL凝胶过滤层析柱进行纯化， 采用缓冲溶液A洗脱，检测波长为215nm和280nm，收集第1个峰的洗脱组分，超滤 浓缩后得到乳铁蛋白肽溶液；

五、通过真空冷冻干燥或低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，得到具有促 进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽；

其中所述的缓冲溶液A为pH＝7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，向缓冲溶液A中 添加NaCl，得到含有0.5～2mol/LNaCl的缓冲溶液B。

本发明制备得到的具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的应用是将该具有促进 成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽作为功能性组分应用于保健食品或功能性食品中。

本发明具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法，是以牛乳铁蛋白为原 料，利用胃蛋白酶对牛乳铁蛋白进行一定时间的消化处理，制成具有促进成骨细胞增殖活 性的乳铁蛋白肽粗产品，再经阳离子交换层析和凝胶层析对乳铁蛋白肽进行分离纯化，并 采用真空冷冻干燥或低温喷雾干燥法进行最终产品的制备。本发明对乳铁蛋白肽在功能性 食品或者预防骨质疏松药品中的开发利用具有重要的意义。

与现有技术相比，本发明具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法包含以 下有益效果：

1、本发明中所述的制备牛乳铁蛋白肽的方法简单、安全，可大规模生产，且所产生 的乳铁蛋白肽具有比完整乳铁蛋白分子更高的促进成骨细胞增殖的活性。

2、本发明采用阳离子交换层析梯度洗脱的方法，结合超滤浓缩、凝胶过滤层析等方 法分离出高活性的乳铁蛋白肽。

3、本发明所涉及的牛乳铁蛋白为天然可食用成分，对人体无害，对成骨细胞具有良 好的促进其增殖的效果，可作为一种骨质疏松症治疗剂，具备实际开发的应用前景。

附图说明

图1为实施例一阳离子交换层析的洗脱曲线图，1—吸光度，2—电导率；

图2为实施例一凝胶过滤层析的洗脱曲线图；

图3为不同浓度的乳铁蛋白肽对成骨细胞增殖活性的柱状图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法按 以下步骤实现：

一、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为2％～8％的乳铁蛋白水溶液，然 后用HCl调节体系的pH至1.2～2.5，得到乳铁蛋白溶液；

二、将胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，在35℃～40℃水浴3～10min 后冰浴冷却，加入碱性调节剂调节体系的pH至6～7终止反应，然后离心处理获取上清液， 除盐后得到乳铁蛋白活性肽的酶解液；

三、将乳铁蛋白活性肽的酶解液进行膜过滤，然后通过SPSepharoseFastFlow阳离 子交换柱分离纯化，采用缓冲溶液A和缓冲溶液B线性梯度洗脱，检测波长为215nm和 280nm，收集第5个峰的洗脱组分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁 蛋白活性肽；

四、用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为1～3mg/mL的乳铁蛋 白活性肽溶液，经滤膜过滤后采用SuperdexPeptide10/300GL凝胶过滤层析柱进行纯化， 采用缓冲溶液A洗脱，检测波长为215nm和280nm，收集第1个峰的洗脱组分，超滤 浓缩后得到乳铁蛋白肽溶液；

五、通过真空冷冻干燥或低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，得到具有促 进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽；

其中所述的缓冲溶液A为pH＝7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，向缓冲溶液A中 添加NaCl，得到含有0.5～2mol/LNaCl的缓冲溶液B。

本实施方式所述的碱性调节剂为NaOH溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二将胃蛋白酶添加到步 骤一得到的乳铁蛋白溶液中，使酶活力与乳铁蛋白的比值为100U/g～250U/g。其它步骤 及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二在37℃水浴 5min。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二以 5000～10000rpm的速度离心处理获取上清液。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之 一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三所述的膜过 滤的孔径为0.1μm或者0.22μm。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三所述的阳离 子交换柱分离纯化过程如下：先使用缓冲溶液A洗脱3～7个柱体积(CV)，再用缓冲溶 液B洗脱3～5个柱体积，洗脱流速控制为3～7mL/min。其它步骤及参数与具体实施方式 一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤四所述的凝胶 过滤层析进行纯化过程如下：先使用缓冲溶液A进行平衡，然后再使用缓冲溶液A洗脱 1～3个柱体积，洗脱流速为0.2～1mL/min。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相 同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤四所述的超滤 浓缩是采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。其它步骤及参数与具体实施方 式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤五所述的真空 冷冻干燥过程中控制冷阱温度为-73～-40℃，真空度为0.01～0.5mbar，干燥时间为3～24h。 其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤五所述的低温 喷雾干燥控制乳铁蛋白肽溶液中的固形物质量含量范围为15～40％，真空度达到 -0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。其它步骤及参数与具 体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式将具体实施方式一制备得到的具有促进成骨细胞增殖 活性的乳铁蛋白肽作为功能性组分应用于保健食品或功能性食品中。

实施例一：本实施例具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的制备方法按以下步骤 实现：

一、将乳铁蛋白与去离子水混合，制备成质量浓度为5％(w/v)的乳铁蛋白水溶液， 然后用HCl调节体系的pH至2.0，得到乳铁蛋白溶液；

二、将26.1mg胃蛋白酶添加到步骤一得到的乳铁蛋白溶液中，使酶活力与乳铁蛋白 的比值为238U/g，在37℃水浴5min后冰浴冷却，加入NaHCO₃溶液调节体系的pH＝6.5 终止反应，然后以10000rpm的速度离心处理获取上清液，透析除盐后得到乳铁蛋白活性 肽的酶解液；

三、调整乳铁蛋白活性肽的酶解液中的蛋白质浓度为2mg/mL，经0.22μm膜过滤， 然后通过SPSepharoseFastFlow阳离子交换柱分离纯化，离子交换柱预先用pH＝7.4的 PBS溶液(缓冲溶液A)平衡，采用线性梯度洗脱，结合到树脂上的蛋白利用50mmol/L PBS缓冲溶液A洗脱5个柱体积(CV)，再用含有1mol/LNaCl的缓冲溶液B洗脱5个 柱体积，洗脱流速为5mL/min，检测波长为215nm和280nm，收集第5个峰(图1中 的峰5)的洗脱组分，再经过透析除盐后冻干，得到初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽；

四、用去离子水将初步分离纯化的乳铁蛋白活性肽配制成浓度为2mg/mL的乳铁蛋白 活性肽溶液，经0.22μm滤膜过滤后采用SuperdexPeptide10/300GL凝胶过滤层析柱进行 纯化，凝胶柱预先用pH＝7.6的缓冲溶液A进行平衡，待基线平稳后进样，然后再利用 pH＝7.6的缓冲溶液A洗脱2个柱体积，洗脱流速为0.5mL/min，检测波长为215nm和 280nm，收集第1个峰(图2中的峰5-1)的洗脱组分，采用截留分子量为500D的再生 纤维素膜进行浓缩后得到乳铁蛋白肽溶液；

五、通过真空冷冻干燥对乳铁蛋白肽溶液进行干燥处理，控制冷阱温度-60℃，真空 度0.01mbar，时间16h，得到具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽。

本实施例步骤一使用的乳铁蛋白的纯度大于95％。

本实施例制备出的乳铁蛋白肽产品的活性检测如附图3中的峰5-1所示，说明其具有 良好的促成骨细胞增殖活性。

本实施例对于制备得到的具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的测试方式如下：

(1)胃蛋白酶活力测定：

采用福林酚法测定胃蛋白酶活力，按照GB/T28715-2012进行。

(2)蛋白质含量的测定：

采用考马斯亮蓝法(Bradford)测定蛋白浓度。

(3)游离氨基含量的测定：

采用邻苯二甲醛OPA法测定游离氨基的含量。

(4)蛋白质水解度计算

蛋白质水解度$\left(DH\right)=\frac{Y_1-Y_2}{8.658}\times 100\%$

式中：Y₁—水解后样品的游离氨基含量(mmol/g)；

Y₂—水解前样品的游离氨基含量(mmol/g)；

8.658—乳铁蛋白中所含肽键含量(mmol/g)。

(5)乳铁蛋白肽分子量测定：

采用SDS-PAGE电泳和TricineSDSPAGE凝胶电泳测定乳铁蛋白肽分子量。

(6)样品活性测定：

MTT法测定乳铁蛋白肽活性：

实验分组如下：将冻干粉分别配制为低剂量浓度组(20μg/mL)、中剂量浓度组 (100μg/mL)和高剂量浓度组(500μg/mL)的乳铁蛋白肽溶液，以水作为空白对照。每组6孔， 将成骨细胞消化计数，将细胞浓度调整为每孔l×105个/mL，然后将细胞接种于96孔培 养板。在培养24h、48h和72h后分别进行检测。

检测指标如下：每隔24h、48h和72h，测定细胞增殖能力。吸除培养液，用PBS 反复清洗除去死细胞；每孔加入含有0.5％MTT的α-MEM100μL，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育4h；观察出现黑色网状物后终止孵育，弃去培养液；每孔加入150μLDMSO， 振荡10min后用酶联免疫检测仪在波长490nm处测定其吸光值，用OD值表示。

本实施实例中LF产品作用于成骨细胞24h、48h和72h对应的OD值分别是0.31、 0.37和0.41，产品纯度(蛋白质含量)大于97％。

实施例二：本实施例与实施例一不同的是步骤五通过低温喷雾干燥对乳铁蛋白肽溶液 进行干燥处理，活性多肽溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01MPa，进风温度 为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有促进成骨细 胞增殖活性的乳铁蛋白肽。

本实施例得到的具有促进成骨细胞增殖活性的乳铁蛋白肽的OD值分别是0.31、0.38 和0.42，表明其具有良好的促成骨细胞增殖活性。