一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物

摘要

本发明公开了一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物。本发明所提供的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的专用引物由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。实验证明，本发明提供的一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物能特异性地检测甘薯羽状斑驳病毒，与其他病毒无交叉反应，对甘薯羽状斑驳病毒的RNA的最小检测限为25fg。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂 盒及其专用引物。

背景技术

甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus，SPFMV)为RNA病毒， 是侵染甘薯的主要病毒之一，分布于世界各甘薯产区，属马铃薯Y病毒科 (Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotato featherymottlevirus，SPFMV)可与甘薯褪绿矮化病毒(Sweetpotatochlorotic stuntvirus,SPCSV)协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害(Sweetpotatovirus disease，SPVD)，为甘薯的一种毁灭性病害。甘薯感染甘薯病毒病害后，减产可达 50％-98％，甚至绝收。目前，检测甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottle virus，SPFMV)的方法主要有：ELISA，RT-PCR等方法，这些方法的弊端在于耗时长、 依赖昂贵的检测设备。

近年来开发的环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification, LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引 物和1个具有链置换特性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件下高效 扩增靶基因，灵敏度和特异性高，该方法已广泛应用于病毒、类病毒、细菌、真菌及 转基因的检测，而迄今尚未应用该技术检测甘薯羽状斑驳病毒的报道。

发明内容

本发明所要解决技术问题是如何检测甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeathery mottlevirus，SPFMV)。

本发明首先提供了一种成套引物，由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物 SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB组成，它们均为单链DNA 分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列 6。其中，序列表的序列1由20个核苷酸组成，序列表的序列2由21个核苷酸组成， 序列表的序列3由43个核苷酸组成，序列表的序列4由42个核苷酸组成，序列表的 序列5由20个核苷酸组成，序列表的序列6由20个核苷酸组成。所述成套引物可以 对甘薯羽状斑驳病毒的总RNA进行特异性的逆转录环介导等温扩增。

所述成套引物中，所述引物SPFMV-F3、所述引物SPFMV-B3、所述引物SPFMV-FIP、 所述引物SPFMV-BIP、所述引物SPFMV-LF和所述引物SPFMV-LB的摩尔比可为 1:1:8:8:4:4。

所述成套引物中，各引物的量如下：0.2μmol所述引物SPFMV-F3、0.2μmol所述 引物SPFMV-B3、1.6μmol所述引物SPFMV-FIP、1.6μmol所述引物SPFMV-BIP、0.8μmol 所述引物SPFMV-LF、0.8μmol所述引物SPFMV-LB。

所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。

所述成套引物的制备方法也属于本发明的保护范围。所述成套引物的制备方法可 为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)：

(Ⅰ)所述成套引物中各条引物分别单独包装；

(Ⅱ)所述成套引物中各条引物按照所述摩尔比混合在一起；

(Ⅲ)所述成套引物中各条引物按照所述量混合在一起。

所述成套引物的用途为如下a)或b)或c)或d)：a)制备用于检测或辅助检测甘 薯羽状斑驳病毒的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有甘薯羽状斑驳病毒； c)制备用于鉴定或辅助鉴定甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测病 毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。

本发明还保护所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d)：a)制备用于 检测或辅助检测甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有 甘薯羽状斑驳病毒；c)制备用于鉴定或辅助鉴定甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒；d)鉴 定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。

本发明还保护含有以上任一所述成套引物的试剂盒。所述试剂盒的用途为如下e) 或f)：e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；f)鉴 定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。

所述试剂盒还可包括10×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、反转录酶和/或甜菜碱。 所述10×反应缓冲液可为NewEnglandBiolabs公司产品。所述反转录酶具体可为 M-MLV反转录酶。

所述试剂盒还可包括荧光显色剂。所述荧光显色剂具体可为SYBRGreenI核酸染 料或钙黄绿素荧光染料。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下e)或f)：e)检测或辅助检测待测样 品中是否含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；f)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选 的甘薯羽状斑驳病毒。

本发明还提供了一种检测待测样品是否含有甘薯羽状斑驳病毒的方法，包括如下 步骤：

提取待测样品的总RNA，以上述任一所述成套引物进行逆转录环介导等温扩增， 然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩 增，则待测样品中含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；如果所述成套引物不能实现对 所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有甘薯羽状 斑驳病毒。

所述“检测待测样品是否感染甘薯羽状斑驳病毒的方法”具体可为方法一，包括 如下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等 温扩增成套引物进行环介导等温扩增，如果扩增曲线呈现为典型的“S型”、则待测 样品中含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒，如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待 测样品不含有或疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

所述“检测待测样品是否感染甘薯羽状斑驳病毒的方法”具体可为方法二，包括 如下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等 温扩增成套引物进行环介导等温扩增(反应体系中含有钙黄绿素荧光染料)，得到待 测样品反应液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待 测样品中含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒，如果待测样品反应液为橙色、则所述待 测样品中不含有或疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒的方法，包括如 下步骤：

提取待测病毒的总RNA，以上述任一所述成套引物进行逆转录环介导等温扩增， 然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩 增，则待测病毒为候选的甘薯羽状斑驳病毒；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA 的逆转录环介导等温扩增，则所述待测病毒为候选的非甘薯羽状斑驳病毒。

所述“鉴定待测病毒是否为甘薯羽状斑驳病毒的方法”具体可为方法三，包括如 下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等温 扩增成套引物进行环介导等温扩增，如果扩增曲线呈现为典型的“S型”、则待测病 毒为候选的甘薯羽状斑驳病毒，如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待测病毒为候 选的非甘薯羽状斑驳病毒。

所述“鉴定待测病毒是否为甘薯羽状斑驳病毒的方法”具体可为方法四，包括如 下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等温 扩增成套引物进行环介导等温扩增(反应体系中含有钙黄绿素荧光染料)，得到待测 样品反应液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测 病毒为候选的甘薯羽状斑驳病毒，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测病毒为候 选的非甘薯羽状斑驳病毒。

上述任一所述钙黄绿素荧光染料可为向100mg钙黄绿素(Thermofisher公司产 品，产品目录号为S-34854)中加入100ml生理盐水得到的染料。

上述任一所述环介导等温扩增可在60-65℃条件下进行。更具体可在63℃条件下 进行。

上述任一所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感 染甘薯羽状斑驳病毒的健康甘薯叶片或感染甘薯羽状斑驳病毒的甘薯叶片。

上述任一所述待测病毒可为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯C病毒、甘薯G病毒、甘薯 卷叶病毒、甘薯病毒2号、或甘薯无症病毒1。

实验证明，本发明提供的一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用 引物能特异性地检测甘薯羽状斑驳病毒，而且与其他病毒无交叉反应，如甘薯卷叶病 毒、甘薯C病毒或甘薯G病毒。同时，本发明提供一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP 试剂盒及其专用引物对甘薯羽状斑驳病毒的RNA的最小检测限为25fg。

附图说明

图1为检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的特异性。

图2为检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的灵敏度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus，SPFMV)、 甘薯G病毒(SweetpotatovirusG，SPVG)和甘薯卷叶病毒(Sweetpotatoleafcurl virus，SPLCV)记载在如下文献中：乔奇，张振臣，张德胜等.中国甘薯病毒种类的 血清学和分子检测[J].植物病理学报，2012,42(1)：10-16.，公众可从北京市植物 保护站(即申请人处)获得上述材料。

甘薯C病毒(SweetpotatovirusC，SPVC)和甘薯病毒2号(Sweetpotatovirus 2，SPV2)记载在如下文献中：包改丽，左瑞娟，饶维力等.云南甘薯病毒的检测及主 要病毒的多样性分析[J].微生物学通报，2013,40(2)：236-248.，公众可从北京市 植物保护站(即申请人处)获得上述材料。

甘薯无症病毒1(Sweetpotatosymptomlessvirus1,SPSMV-1)记载在如下文 献中：Mbanzibwa,D.R.,Tairo，F.,Gwandu,C.,Kullaya,A.,2011.Firstreportof sweetpotatosymptomlessvirus1andsweetpotatovirusAinsweetpotatoesin Tanzania.PlantDis.95：224.，公众可从北京市植物保护站(即申请人处)获得上 述材料。

下述实施例中感染甘薯羽状斑驳病毒的甘薯叶片和未感染甘薯羽状斑驳病毒的健 康甘薯叶片，公众可从北京市植物保护站(即申请人处)获得。

钙黄绿素荧光染料为向100mg钙黄绿素(Thermofisher公司产品，产品目录号 为S-34854)中加入100ml生理盐水得到的染料。

荧光试剂为向1μlSYBRGreenI核酸染料(Thermofisher公司产品，产品目 录号为S-7563)中加入49μl去离子水得到的试剂。

10×反应缓冲液为NewEnglandBiolabs公司产品，产品目录号为B9004S；BstDNA 聚合酶为NewEnglandBiolabs公司产品，产品目录号为M0537S；M-MLV反转录酶为 Takara公司产品，产品目录号为2641Q；甜菜碱为Sigma公司产品，产品目录号为 61962-50G；MgSO₄为Sigma公司产品，产品目录号为746452-500G；dNTP为Takara公 司产品，产品目录号为4030Q。

实施例1、检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP成套引物的制备

本实施例的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP成套引物由引物SPFMV-F3、引物 SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB组成， 各条引物均为单链DNA分子，它们的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、序列2、序 列3、序列4、序列5和序列6所示。

制备引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物 SPFMV-LF和引物SPFMV-LB。

实施例2、利用检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒检测待测样品

一、检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的制备

制备检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒，包括试剂盒C或试剂盒D：

试剂盒C为将反应试剂C、空白对照和阴性对照组装在一起得到的产品；

试剂盒D为将反应试剂D、空白对照和阴性对照组装在一起得到的产品。

其中，所述反应试剂C，包括2.5μl10×反应缓冲液、8UBstDNA聚合酶、200U M-MLV反转录酶、25μmol甜菜碱、荧光试剂1μl、0.15μmolMgSO₄、0.04μmoldNTP、 引物SPFMV-F3和引物SPFMV-B3各5pmol、引物SPFMV-FIP和引物SPFMV-BIP各40pmol、 引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB各20pmol，用去离子水补至24μl。

所述反应试剂D，包括2.5μl10×反应缓冲液、8UBstDNA聚合酶、200UM-MLV 反转录酶、25μmol甜菜碱、钙黄绿素荧光染料5pmol、0.15μmolMgSO₄、0.04μmol dNTP、引物SPFMV-F3和引物SPFMV-B3各5pmol、引物SPFMV-FIP和引物SPFMV-BIP 各40pmol、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB各20pmol，用去离子水补至24μl。

所述阴性对照为未感染甘薯羽状斑驳病毒的健康甘薯叶片的总RNA，使用时加入 1μl。

所述空白对照为灭菌超纯水，使用时加入1μl。

二、利用步骤一制备的试剂盒D检测待测样品

1、用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit(购自北京六合通经贸有限 公司)分别提取感染甘薯羽状斑驳病毒的甘薯叶片总RNA和未感染甘薯羽状斑驳病毒 的健康甘薯叶片的总RNA，RNA的浓度均为1ng/μl。

2、RT-LAMP

具体的检测方法如下：

(1)向试管中加入24μl反应试剂D和1μl步骤1提取的感染甘薯羽状斑驳病毒 的甘薯叶片的总RNA得到反应液，然后将反应液于63℃反应60分钟。反应结束后， 观察反应液的颜色变化。

按照上述方法，将感染甘薯羽状斑驳病毒的甘薯叶片的总RNA分别替换为步骤1 提取的未感染甘薯羽状斑驳病毒的健康甘薯叶片的总RNA和灭菌超纯水，其它步骤均 不变。反应结束后，观察反应液的颜色变化。

(2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则待测样品中含有或疑似 含有甘薯羽状斑驳病毒；如果反应液的目测颜色为橙色、则所述待测样品中不含有或 疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

实验结果表明：加入感染甘薯羽状斑驳病毒的甘薯叶片的总RNA的试管进行 RT-LAMP后，反应液目测颜色为绿色；而加入未感染甘薯羽状斑驳病毒的健康甘薯叶 片的总RNA或灭菌超纯水的试管进行RT-LAMP后，反应液目测颜色为橙色。结果表明， 本发明提供的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒可准确的检测甘薯羽状斑驳病 毒。

实施例3、实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的特异性

一、以实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒C进行特异性实验， 实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit(北京六合通经贸有限公司 产品)分别提取SPFMV的总RNA、SPVC的总RNA、SPVG的总RNA、SPLCV的总RNA、SPSMV-1 的总RNA和SPV2的总RNA，RNA的浓度均为1ng/μl。

2、RT-LAMP

(1)向试管中加入24μl反应试剂C和1μl步骤1提取的SPFMV的总RNA得到反 应液，然后将反应液于63℃反应60分钟。以循环数为横坐标，PCR产物的量为纵坐标， 得到荧光检测系统绘制的扩增曲线。设置2个试管作为重复。

按照上述方法，将SPFMV的总RNA分别替换为SPVC的总RNA、SPVG的总RNA、SPLCV 的总RNA、SPSMV-1的总RNA、SPV2的总RNA和灭菌超纯水，其它步骤均不变，得到相 应的扩增曲线。

(2)结果观察和判定：如果扩增曲线呈现典型的“S型”、则待测样品中含有或 疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有 或疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

RT-LAMP结果见图1中A，只有加入SPFMV的总RNA的试管进行RT-LAMP得到典型 的“S型”扩增曲线。

二、以实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒D进行特异性实验， 实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit(北京六合通经贸有限公司 产品)分别提取SPFMV总RNA、SPVC总RNA、SPVG总RNA、SPLCV总RNA、SPSMV-1总 RNA和SPV2总RNA，RNA的浓度均为1ng/μl。

2、RT-LAMP

(1)向EP管中加入24μl反应试剂D和1μl步骤1提取的SPFMV总RNA得到反 应液，然后将反应液于63℃反应60分钟。反应结束后，观察反应液的颜色变化。设 置2个EP管作为重复。

按照上述方法，将SPFMV总RNA分别替换为SPVC总RNA、SPVG总RNA、SPLCV总 RNA、SPSMV-1总RNA、SPV2总RNA和灭菌超纯水，其它步骤均不变。反应结束后，观 察相应反应液的颜色变化。

(2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则待测样品中含有或疑似 含有甘薯羽状斑驳病毒；如果反应液的目测颜色为橙色、则所述待测样品中不含有或 疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

实验结果见图1中B(1、2为灭菌超纯水，3、4为SPLCV，5、6为SPVC，7、8 为SPVG，9、10为SPSMV-1，11、12为SPFMV，13、14为SPV2)。只有加入SPFMV总 RNA的EP管进行RT-LAMP后，反应液为绿色。

上述结果表明，本发明提供的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒可特异的 检测甘薯羽状斑驳病毒。

实施例4、实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的灵敏度

一、以实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒C进行灵敏度实验， 实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit(北京六合通经贸有限公司 产品)提取SPFMV总RNA，命名为RNA1。RNA1中RNA的浓度为1ng/μl。

2、吸取1mlRNA1加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到RNA2；以 此类推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、RNA7和RNA8。使用BeckmanUV-800紫外分光 光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，分别为100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、 100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl和100ag/μl。

2、RT-LAMP

(1)向试管中加入24μl反应试剂C和1μl步骤1制备的RNA1得到反应液，然 后将反应液于63℃反应60分钟。以循环数为横坐标，PCR产物的量为纵坐标，得到荧 光检测系统绘制的扩增曲线。设置2个试管作为重复。

按照上述方法，将RNA1分别替换为步骤1制备的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、 RNA7、RNA8和灭菌超纯水，其它步骤均不变，得到相应的扩增曲线。

(2)结果观察和判定：如果扩增曲线呈现典型的“S型”、则待测样品中含有或 疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有 或疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

RT-LAMP结果表明，向反应试剂中加入RNA1、RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6或 RNA7进行RT-LAMP均得到典型的“S型”扩增曲线，而向反应试剂中加入RNA8或灭菌 超纯水进行RT-LAMP得到的扩增曲线均为水平的直线。表明，本发明提供的检测甘薯 羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒对甘薯羽状斑驳病毒RNA的最小检测限为25fg。

二、以实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒D进行灵敏度实验， 实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit(北京六合通经贸有限公司 产品)分别提取SPFMV总RNA，命名为RNA1。RNA1中RNA的浓度为1ng/μl。

2、吸取1mlRNA1加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到RNA2；以 此类推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、RNA7和RNA8。使用BeckmanUV-800紫外分光 光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，分别为100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、 100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl和100ag/μl。

2、RT-LAMP

(1)向EP管中加入24μl反应试剂D和1μl步骤1制备的RNA1得到反应液，然 后将反应液于63℃反应60分钟。反应结束后，观察反应液的颜色变化。设置2个EP 管作为重复。

按照上述方法，将RNA1分别替换为步骤1制备的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、 RNA7、RNA8和灭菌超纯水，其它步骤均不变，其它步骤均不变。反应结束后，观察相 应反应液的颜色变化。

(2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则待测样品中含有或疑似 含有甘薯羽状斑驳病毒；如果反应液的目测颜色为橙色、则所述待测样品中不含有或 疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。

实验结果见图2(1、2为灭菌超纯水，3、4为RNA1，5、6为RNA2，7、8为RNA3， 9、10为RNA4，11、12为RNA5，13、14为RNA6，15、16为RNA7，17、18为RNA8)。 只有加入RNA8或灭菌超纯水的EP管进行RT-LAMP后，反应液为绿色。结果表明，本 发明提供的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒对甘薯羽状斑驳病毒RNA的最小 检测限为25fg。