黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP检测和番茄斑萎病毒的胶体金免疫层析试纸条检测

摘要

植物病毒种类繁多，分布广泛，绝大多数经济作物都因受到病毒病的危害使得植株部分或全部生长异常，严重阻碍植物生长，影响品质和降低产量，常见症状有枯萎、斑驳和腐烂。据不完全统计，全世界每年因病毒病破坏就造成了高达150亿美元以上的直接经济损失。在我国有许多重要的经济作物，如烟草、西瓜、花卉和多种蔬菜作物，每年因为病毒病所造成的直接经济损失就高达10亿美元以上。农业病害主要分为真菌、病毒、细菌。植物病毒是仅次于真菌的病原物，病毒病危害植物与其它的病原物有着显著的差异:病毒颗粒含有感染性核酸，外披蛋白外壳的实体，它可以借助其它的原因如昆虫、自然因素或者人为因素造成植物的伤口从而进入植物体内，并利用植物细胞内的能量、信息和酶系统，完成病毒自己的复制和增殖，从而对植物造成病害，由于这样的增殖机制给病毒病的防治带来了极大的困难。尤其植物病毒种类多，危害面广，一旦发生较难防治，造成较大经济损失，因此有科学家称植物病毒病为植物癌症。因此本研究通过增强对植物的检验检疫工作来一步防范病害发生和减少病害损失。
　　黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫芦科植物上一个重要的种传病害，它对葫芦科作物的损失影响巨大。该病毒属于我国健在的危险性有害生物，是我国重要的检疫性病害，目前进出口岸的植物检疫部门常有截获，并且国内少数地区也有发生，该病毒的传播途径主要以带毒种子和机械传播为主。本研究根据CGMMV的外壳蛋白(CP)基因的保守区段设计RT-LAMP引物;优化CGMMV的RT-LAMP反应体系;用优化后的RT-LAMP反应体系对西瓜叶片中的CGMMV进行检测，并且分析该方法的可靠性、灵敏度和特异性。经优化后RT-LAMP反应体系的参数为4mM MgCl2和0.8 Mbetaine。当温度在63℃时，RT-LAMP可以特异地检测出西瓜叶片中的CGMMV，即能扩增出特异性的梯形条带而且不会和其它病毒交叉反应。扩增的产物还可加入荧光染液在紫外灯下或直接通过肉眼观察判断。灵敏度试验显示RT-LAMP的灵敏度要高于RT-PCR100倍，并且RT-PCR不能用快速粗提取的RNA作为反应模板，然而RT-LAMP就可以。该实验建立了一种将RNA快速抽提与RT-LAMP相结合并且高效可靠的用于CGMMV的一步检测方法。这种RT-LAMP检测方法对CGMMV检验检疫工作有着很好的应用前景，利用这种方法可以有效防止CGMMV这种灾害性病毒广泛传播。
　　番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是布尼亚病毒科（Bunuyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospovirus）中唯一一个侵染植物的病毒。它在世界各地都有分布，并且对许多经济作物和植物造成了巨大的经济损失，加上它难以防治。所以本研究针对这种病毒，通过胶体金免疫层析试纸条技术来快速诊断和提前预防。这种技术具有与ELISA相似的特异性和灵敏度，它是胶体金标记技术和快速免疫斑点法相结合的产物。该方法的最大的特点就是快速、灵敏、简单、成本低并且不需要专门的技术人员和昂贵的仪器，通常在几分钟之内就能通过肉眼看到颜色鲜明的结果。近几年来，胶体金免疫层析技术已经成为当今最快速的免疫学检测技术，并且受到越来越多的相关研究领域的关注。因此，本研究建立了胶体金免疫层析试纸条诊断TSWV病毒。本研究还进一步对检测TSWV的特异性和灵敏度等指标进行了试验，试验结果表明该方法对TSWV的检验检疫工作和预防TSWV的传播等方面有着潜在的应用前景。

目录

声明

摘要

缩略词

上篇 文献综述

引言

第一章 黄瓜绿斑驳病毒的研究概况

1．1 黄瓜绿斑驳花叶病毒的生物学特性

1．2 黄瓜绿斑驳花叶病基因组结构和功能

1．3 黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测方法

第二章 环介导等温扩增(LAMP)的研究概况

2．1 LAMP的原理

2．2 RT-LAMP的运用

第三章 番茄斑萎病毒的研究概况

3．1 番茄斑萎病毒的生物学特性

3．2 番茄斑萎病毒的基因组结构

3．3 番茄斑萎病毒的检测方法

第四章 胶体金免疫层析的研究概况

4．1 胶体金免疫层析技术的原理和分类

4．2 免疫胶体金试纸条的应用

下篇 研究内容

第五章 黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-LAMP检测

5．1 试验材料、试剂及器材

5．2 试验方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 番茄斑萎病毒的免疫层析试纸条

6．1 试验材料、试剂及器材

6．2 试验方法

6．3 实验结果

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 全文总结

7．1 总结

7．2 本研究的创新点

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及专利

致谢