一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养方法和装置

摘要

本发明公开了一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养方法和装置。首先将含有VOCs增溶菌的样品在无菌条件下摇床驯化得到驯化种液；再在无菌条件下转接驯化种液进行连续曝气培养，培养容器用若干层透气的过滤材料封口；按照相同的方法进行多次转接培养，每次转接，对容器进行封口的过滤材料减少一层；待发酵体系逐渐稳定后，转接条件由无菌条件变为自然条件；当过滤材料完全减掉时，发酵培养基也不再灭菌，实现完全开放式自然培养。直接用本发明的增溶菌完全开放式的自然发酵体系和装置得到的发酵液对VOC等进行增溶，增溶效果优异，可大幅降低生产成本，易实现大规模工程生产应用，为BST的大批量生产提供技术支持，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于有机污染物降解技术领域。更具体地，涉及一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养方法和装置。

背景技术

石油化工、制药、油漆、涂料、电子制造、表面防腐、制鞋、印刷及交通运输等行业在生产及使用过程中产生大量挥发性有机物（简称VOCs），挥发性有机物（volatileorganiccompoundsVOCs）定义为熔点低于室温，沸点在50～260℃之间的有机化合物的总称，目前已鉴定的VOCs达300多种，最常见的是苯、甲苯、二甲苯、三氯甲烷、丙酮及丁酮等。VOCs的许多成分具有毒性，有的还具有致癌作用；如苯和甲苯是VOCs相关行业使用广泛的有机溶剂，它们以气态形式存在于空气中，进入人体后可长期滞留，即使低浓度也会带来持续性损害，长期与之接触有引发白血病的可能，苯已被世界卫生组织列为强致癌物。由于工业的迅猛发展，VOCs排放量与日剧增，VOCs因具有排放量大、种类多、毒性强、难降解的特点，已成为全球关注的焦点。

VOCs的处理方法很多，包括冷凝法、吸收法、吸附法和膜分离法、催化燃烧法、等离子体法、光催化氧化法及生物法等。目前应用较多的主要是吸附法、催化燃烧法、等离子体法和生物法。其中，吸附法主要是将污染物转移至吸附剂，吸收剂需解吸、再生或更换，故其成本高并存在二次污染的风险。催化燃烧法处理比较彻底，但耗能大，成本高。等离子体法是近年来用于处理VOCs的新技术，但此法易产生二次污染，且降解效率低，能耗高，不适宜工业应用。而生物法因操作简单、成本低、无二次污染备受青睐，但是，由于VOCs的水溶性差，导致其可生化性偏低，故限制了该技术的应用。提高VOCs可生化性的重要途径就是对其增溶，表面活性剂对VOCs具有良好的增溶作用。利用表面活性剂提高疏水性有机污染物的溶解性国内外已有展开，但大多利用的是化学表面活性剂，而化学表面活性剂具有毒性且难降解，易引起二次污染。生物表面活性剂（简称BST）不仅具有良好的表面活性和乳化性能，且具有无毒、易于生物降解等独特优势，使其在VOCs生物治理方面具有广阔的应用前景。

目前利用生物表面活性剂对VOCs增溶主要有以下两种，第一种方法：可在VOCs处理系统中加入纯的生物表面活性剂，但此方法涉及到生物表面活性剂的提取和纯化，故成本极高，同时，在提取与纯化过程中生物表面活性剂可能遭到破坏；第二种方法：可在VOCs反应器中直接接入产能够对VOCs增溶的生物表面活性剂的外源菌，但是也要先分离纯化获取合适的外源菌，而且外源菌与VOCs反应器中的内源菌存在竞争，外源菌因适应能力弱往往无法成为优势菌而失去作用，特别是像VOCs这样的特殊环境，引入的外源菌更难以生存。

本发明人的前期研究工作得出了一种能够产生VOC增溶剂的增溶菌的活化方法，并以增溶菌的发酵液直接作为增溶剂使用，使用简单、成本大大降低、工艺简单、无二次污染，具有很好的应用价值。但是，该法仍然是采用的传统微生物培养发酵方法，即需在无菌条件下进行培养发酵。对于大规模的实际工程生产应用而言，显然处处需要无菌的条件仍然相对比较复杂、需要额外的提供无菌环境所需的成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种可实现VOCs增溶微生物的完全开放式的自然发酵体系，可为BST的大批量生产提供技术支持；通过本发明有望突破VOCs因难溶于水而影响其生物降解这一技术瓶颈，为VOCs的高效生物处理提供科学依据。

本发明的目的是提供一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养方法。

本发明另一目的是提供上述方法所得的能够增加VOCs水溶性的生物表面活性剂，即发酵液，及其在VOCs的生物处理方面的应用。

本发明的再一目的是提供一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养装置。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养方法，首先将含有VOCs增溶菌的样品在无菌条件下摇床驯化得到驯化种液；再在无菌条件下转接驯化种液进行连续曝气培养，培养容器用若干层透气的过滤材料封口；按照相同的方法进行多次转接培养，每次转接，对容器进行封口的过滤材料减少一层；待发酵体系逐渐稳定后，转接条件由无菌条件变为自然条件；当过滤材料完全减掉时，发酵培养基也不再灭菌，实现完全开放式自然培养。

具体地，所述VOCs增溶菌的开放式发酵培养方法包括如下步骤：

S1.无菌驯化培养：无菌条件下，按2～5v/v%的接种量，将含有VOCs增溶菌的样品接种到灭菌的发酵培养基，28～32℃、170～200rpm驯化培养36～48h，得到驯化种液；

S2.无菌培养：按照容器容积的50～60%计，在容器中加入发酵培养基，用若干层透气的过滤材料封口后灭菌，按照2～5v/v%的接种量，无菌条件下转接驯化种液，28～32℃条件下连续曝气培养；

S3.转接培养：按照步骤S2相同的方法，进行多次转接培养；每次转接，对容器进行封口的过滤材料减少一层；

S4.半开放培养：当发酵体系稳定后，由无菌接种变为自然接种，即转接无需在无菌条件下进行，其他方法和条件同步骤S2，继续进行转接培养；每次转接，对容器进行封口的过滤材料减少一层；

S5.完全开放式自然培养：当过滤材料完全减掉时，发酵培养基也不再灭菌，实现完全开放式自然培养；

其中，所述发酵培养基的配方为：硫酸铵5g/L，废石油20g/L，葡萄糖1.0g/L，氯化钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，pH7～7.5，自来水定容；

步骤S4所述发酵体系稳定是指稳定产生表面活性剂。具体判断的方法：可以测定发酵液对VOCs的乳化效果，乳化效果稳定时，即为稳定产生表面活性剂，即发酵体系稳定。

优选地，每次转接间隔时间为一天。

步骤S1所述含有VOCs增溶菌的样品可以为污泥、废水或土壤样品等；所述污泥为工业废水污泥、生活污泥或臭水沟污泥；所述废水为工业废水、生活废水、臭水沟废水；所述土壤为工业废水池附近土壤、臭水沟附近土壤或加油站附近土壤。更进一步地，所述的这些样品均含有烃类物质。

优选地，所述过滤材料为纱布、过滤棉、过滤布或滤膜等。

更优选地，所述过滤材料的孔径为0.01～2mm。实际上严格来说，对于过滤材料的孔径不做严格限制，孔径小的材料可少几层，孔径大的材料可多几层，同样都可以满足试验的要求。

另外，优选地，步骤S1或S2所述接种量的比例为5%。

优选地，步骤S1所述驯化培养的条件为30℃、180rpm驯化培养36h。

优选地，步骤S2所述连续曝气培养的条件为30℃培养。

优选地，步骤S2所述发酵培养基占容器容积的60%。

另外，作为一种优选的可实施方案，步骤S2所述容器为广口瓶。更优选地，所述广口瓶为2.5L的广口瓶。

利用上述开放式发酵培养方法得到的发酵液，即为能够增加VOCs水溶性的生物表面活性剂，也在本发明的保护范围之内。

而且所述发酵液在作为能够增加VOCs水溶性的生物表面活性剂方面的应用，以及在VOCs的生物处理方面的应用，也均在本发明的保护范围之内。

另外，本发明还提供了一种配套使用的VOCs增溶菌的开放式发酵培养装置，包括一个无菌操作箱1和若干个依次连接的培养容器2，最后一个培养容器2位于无菌操作箱1外部，其余培养容器2均设置于无菌操作箱1内部；所述培养容器2通过气流管与曝气装置3连接，气流管通过曝气装置3上的通气口密封伸入培养容器2内部；所述依次连接是通过流液管5连接，流液管5两端分别通过培养容器2上的开孔密封伸入培养容器2内部。

所述流液管5上设置有计量泵6和阀门7；优选地，流液管5上还设置有流量计，以控制菌液的流量。

所述培养容器2用若干层过滤材料4封口，按照培养容器2依次连接的顺序，过滤材料递减一层，位于无菌操作箱1外部的最后一个培养容器2不封口。

所述流液管5上设置有出液管8，出液管8上设置有阀门，出液管8出口处连接抽液装置9。优选地，所述抽液装置9可为注射器或抽液器等等。

更优选地，所述无菌操作箱1上对应每个培养容器2的位置均设置有手插孔10，方便对内部的操作；更优选地，所述无菌操作箱1内部，每两个培养容器2之间有隔板密封隔开，即保证每个培养容器2处于独立的密闭空间内。

该装置可用于VOCs增溶菌的开放式发酵培养，实际应用时，已有或者刚采集的VOCs增溶菌先采用摇床驯化培养得到驯化种液，同时，无菌操作箱1内的每个培养容器2使用前装入培养基并灭菌。接下来，再将驯化种液接种于无菌操作箱1内的第一个培养容器2内，曝气培养一天后，开启阀门7和计量泵6，将菌液转接至下一个培养容器2内，并且减少一层封口的过滤材料，如此循环下去。在培养的过程中，可开启出液管8上的阀门，通过抽液装置9抽取发酵液，以检测其对VOCs的乳化效果。当乳化效果稳定时，接下来的每个培养容器2所处的密闭空间不再密闭，即在自然条件下（不再无菌）完成转接工作。

当封口的过滤材料完全减掉时，即可转接至无菌操作箱1外部的不封口培养容器2，无菌操作箱1外部的不封口培养容器2内的培养基不经过任何灭菌，实现完全开放式自然发酵培养。

为了操作的更加方便，优选地，无菌操作箱1内部的每两个培养容器2之间的连接为可拆卸式，可根据实际情况的需要和变化增加或减少培养容器2的个数。

另外，优选地，所述无菌操作箱1内部设置有照明装置和/或灭菌装置。

优选地，所述手插孔10上设置有密封的内部操作手套，方便操作者的手伸入内部操作，且保证内部空间的密封和无菌。

优选地，所述过滤材料4为纱布、过滤棉、过滤布或滤膜。

更优选地，所述过滤材料4的孔径为0.01～2mm。同样的，实际上严格来说，对于过滤材料的孔径不做严格限制，孔径小的材料可少几层，孔径大的材料可多几层，同样都可以满足试验的要求。

另外，值得说明的是，本发明的装置尺寸可大可小，即无菌操作箱大到可以是一个无菌室，小到可以是一个小型的无菌盒，可以满足不同产品需求量的要求，满足工业应用或者实验室研究的需求。对于不同的需求，可以在不脱离本发明的思想和核心的基础上，做出相应的修改和改进，如：当工业大规模应用时，无菌操作箱即设计为无菌室，培养容器为大型的发酵罐，则无菌室就不存在所述的手插孔，而是需要根据实际需要设计好密封问题，操作人员需要进入无菌室操作，期间做好防菌工作即可。

本发明针对VOCs水溶性差进而影响其生物降解的问题，旨在驯化VOCs增溶微生物，使其产生生物表面活性剂（简称BST），对VOCs增溶。本发明实施例以苯和甲苯作为VOCs代表成分，以增溶活性和乳化率作为指标来指示增溶效果，结果表明，成功驯化得到产BST的增溶微生物。

同时，为了满足实际工程的需要，探索出了增溶微生物的完全开放式自然培养的方法和体系，直接用得到的发酵液对VOC进行增溶，不仅降低生产成本，且发酵液完成增溶后还将为下一步降解微生物带来营养。

本发明建立的完全开放式的自然发酵体系和装置，可为BST的大批量生产提供技术支持，有望突破VOC因难溶于水而影响其生物降解这一瓶颈，为VOCs的高效生物处理提供科学依据。

本发明具有以下有益效果：

本发明首先驯化得到了VOCs增溶微生物，能够产生生物表面活性剂（简称BST），对VOCs具有优异且稳定的增溶作用。更重要的是，本发明建立了VOCs增溶微生物完全开放式的自然发酵体系，直接用得到的发酵液对VOC进行增溶，不仅降低成本，且发酵液完成增溶后还将为下一步降解微生物带来营养。

另外，本发明还建立了一套适用于上述完全开放式的自然发酵体系的VOCs增溶微生物开放式发酵装置，完全开放式的自然发酵方式对环境和设备的要求更低，可大幅降低生产成本，轻易实现大规模工程应用，为BST的大批量生产提供技术支持，有望突破VOC因难溶于水而影响其生物降解这一瓶颈，为VOCs的高效生物处理提供科学依据，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1发酵培养流程示意图。

图2为BST产生曲线。

图3为发酵液对苯的增溶作用。

图4为培养36h的发酵液对甲苯的乳化效果。

图5为气态苯增溶曲线。

图6为甲苯增溶曲线。

图7为本发明所述VOCs增溶微生物开放式发酵装置的示意图。

图8为本发明装置中无菌操作箱的外部正面示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1VOCs增溶菌的开放式发酵培养

1、增溶菌种源样品

种源样品为广州某石化厂废水处理池的废水，废水中含有烃类物质。

2、发酵培养基（用于产BST）

硫酸铵5g/L，废石油20g/L，葡萄糖1.0g/L，氯化钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，pH7～7.5，自来水1L。

3、实验方法

发酵培养在广口瓶中进行。为了防止空气中杂菌等外来微生物的感染，只保证种源菌生长，先采用无菌培养方法，经过一定时间的驯化，发酵体系逐渐稳定后，再过渡到自然培养。

图1为发酵培养流程示意图，其中，实际实验时，每个广口瓶连接曝气装置，实现曝气发酵培养。

开放式发酵培养的具体方法和步骤如下：

（1）摇床无菌驯化培养：于三角瓶中加入发酵培养基，塞紧胶塞，高压灭菌；在无菌条件下，按5%（v/v）的接种量，将废水接种到发酵培养基，30℃、180rpm摇床驯化培养36h，得到摇床驯化种液；

（2）无菌培养：于2.5L广口瓶中加入1.5L发酵培养基，用10层过滤材料（如纱布、过滤棉、过滤布或滤膜）封口，高压灭菌；在无菌条件下，按5%（v/v）转接摇床驯化种液，30℃条件下连续曝气培养；

（3）转接培养：按照步骤（2）相同的方法，进行多次转接培养；每次转接，对广口瓶封口的过滤材料减少一层；

（4）当过滤材料减少到三层时，发酵体系已趋于稳定（即发酵液对VOCs的乳化效果稳定时），由无菌接种变为自然接种，即转接无需在无菌条件下进行；继续按照相同的方法，进行转接培养；每次转接，对广口瓶封口的过滤材料减少一层；

（5）当过滤材料完全减掉时，发酵培养基也不再灭菌，过渡到完全开放式自然培养；即直接在自然条件下接种至未灭菌的发酵培养基中进行培养。

经过多次研究观察发现，经过这一方法体系进行培养的过程中，VOCs增溶菌一直能够以优势菌的形式完成发酵过程，没有被其他杂菌污染，实现了完全开放式的自然培养。

实施例2VOCs增溶菌的开放式发酵培养得到的发酵液的活性测试

1、本实施例以增溶能力和乳化能力两个指标来考察实施例1所得发酵液的增溶活性。

（1）培养特征

实施例1中，首先接种摇床培养种液，按摇床发酵确定的条件进行培养。初始发酵时，发酵液中有少量粘性泡状物出现。发酵24～48h时，发酵液中粘性泡状物逐渐增多。粘性泡状物的出现可能是增溶菌产生的BST在充气条件下的发泡现象。

（2）BST产生规律

通过测定随时间的变化发酵液对苯和甲苯的增溶活性的变化，得到BST产生随时间的变化规律，如附图2所示。

从图2可以看出，接种12h内，发酵液对苯和甲苯的增溶活性明显增加。这说明增溶菌对新环境有较强的适应能力。自接种开始至发酵36h，发酵液对两种苯的增溶与乳化一直呈快速增加的趋势，36h后缓慢下降。

另外，如附图3和4所示，发酵液对苯和甲苯均有很好的增溶和乳化作用，图4试管中白色部分即为乳化层，乳化现象非常明显。

（3）发酵液对苯的增溶效果

为了进一步证明BST对VOCs的增溶作用，即提高VOCs（如苯类）在水相中的“溶解度”，就发酵液对苯进行了增溶实验。

结果如附图5所示，连续通气1h后，苯在发酵液中的“溶解”量约为1.67g/L；苯在空白无菌纯发酵培养基（对照）的含量只有0.7g/L。此后继续通气，两种溶液中的苯的含量都在不断增加。通气4～6h，发酵液中苯的含量基本稳定，达2.0g/L。6h后停止通气时，空白无菌纯发酵培养基（对照）中苯的含量仅为0.9g/L，而发酵液中苯的含量一直在1.8g/L以上。在随后的6h中，空白无菌纯发酵培养基（对照）中的苯一直在挥发减少，平均挥发速率约为0.064g/L/h，而发酵液中苯的含量维持在约2g/L。

由此可见，在通气过程中，发酵液对苯有明显的增加“溶解”效果，且效果比较稳定。发酵液的表观溶解度高达空白无菌纯发酵培养基（对照）的2.7倍。可见发酵液中的BST对苯具有优异而稳定的增溶能力。

（4）发酵液对甲苯的增溶效果

图6为甲苯的增溶曲线。从图中可以看出，甲苯在空白培养基中的表观溶解度只有0.0047～0.007g/L。但在发酵液中，甲苯含量通气开始时为0.11g/L，表观增溶量是空白培养基的9倍。随着甲苯气体的持续通入，其在发酵液中的量不断增加。通气0～3h时，发酵液对甲苯的表观增溶率达纯培养液的27倍。随着时间的延长，空白培养基中的甲苯持续挥发，发酵液中的甲苯含量比较稳定，说明BST能与甲苯稳定地结合在一起。在12h时，发酵液的表观增溶量为空白培养基的30倍，可见发酵液对气态甲苯具有优异而稳定的增溶能力。

实施例3VOCs增溶菌的开放式发酵培养装置

一种VOCs增溶菌的开放式发酵培养装置，如图7和图8所示，包括一个无菌操作箱1和若干个依次连接的培养容器2，最后一个培养容器2位于无菌操作箱1外部，其余培养容器2均设置于无菌操作箱1内部；所述培养容器2通过气流管与曝气装置3连接，气流管通过曝气装置3上的通气口密封伸入培养容器2内部；所述依次连接是通过流液管5连接，流液管5两端分别通过培养容器2上的开孔密封伸入培养容器2内部。

所述流液管5上设置有计量泵6和阀门7；优选地，流液管5上还设置有流量计，以控制菌液的流量。

所述培养容器2用若干层过滤材料4封口，按照培养容器2依次连接的顺序，过滤材料递减一层，位于无菌操作箱1外部的最后一个培养容器2不封口。

所述流液管5上设置有出液管8，出液管8上设置有阀门，出液管8出口处连接抽液装置9。所述抽液装置9可为注射器或抽液器等。

另外，所述无菌操作箱1上对应每个培养容器2的位置均设置有手插孔10，方便对内部的操作。

而且，所述无菌操作箱1内部，每两个培养容器2之间有隔板密封隔开，即保证每个培养容器2处于独立的密闭空间内。

进一步地，无菌操作箱1内部的每两个培养容器2之间的连接为可拆卸式，可根据实际情况的需要和变化增加或减少培养容器2的个数。

该装置可用于VOCs增溶菌的开放式发酵培养，实际应用时，已有或者刚采集的VOCs增溶菌先采用摇床驯化培养得到驯化种液，同时，无菌操作箱1内的每个培养容器2使用前装入培养基并灭菌。

再将驯化种液接种于无菌操作箱1内的第一个培养容器2内，曝气培养一天后，开启阀门7和计量泵6，将菌液转接至下一个培养容器2内，并且减少一层封口的过滤材料，如此循环下去。

培养的过程中，可开启出液管8上的阀门，通过抽液装置9抽取发酵液，以检测其对VOCs的乳化效果。当乳化效果稳定时，接下来的每个培养容器2所处的密闭空间不再密闭，即在自然条件下（不再无菌）完成转接工作。

当封口的过滤材料完全减掉时，即可转接至无菌操作箱1外部的不封口培养容器2，无菌操作箱1外部的不封口培养容器2内的培养基不经过任何灭菌，实现完全开放式自然发酵培养。

另外，所述无菌操作箱1内部还设置有照明装置和灭菌装置。

所述手插孔10上设置有密封的内部操作手套，方便操作者的手伸入内部操作，且保证内部空间的密封和无菌。

所述过滤材料4可为纱布、过滤棉、过滤布或滤膜。进一步地，所述过滤材料4的孔径为0.01～2mm范围内均可，对于过滤材料的孔径不做严格限制，孔径小的材料可以少用几层，孔径大的材料可以多用几层，同样都可以满足试验的要求。