具有氨苄青霉素抗性的乳酸菌及其制剂的制备与应用

摘要

本发明公开具有氨苄青霉素抗性的乳酸菌及其制剂的制备与应用。本发明用人体粪便在抗生素压力下分离得到2株具有耐药性的乳酸菌，并进行了抗生素敏感性实验，以及检测是否存在质粒DNA；采用PCR扩增分析菌株的耐药基因定位情况，探索了乳酸菌耐抗生素的分子机制，并对筛选具有抗性基因乳酸菌进行安全性评价；对筛选的抗性菌株进行验证是否对肠道失调具有调节作用，采用“抗生素型肠道菌群失衡模型”，旨在为临床上使用抗生素引起的腹泻、菌群失调等疾病提供潜在的治疗方法。本发明获得的菌株，当临床再次使用抗生素时，肠道益生菌能够在抗生素压力下存活，而普通的益生菌则不能存活，因此，可为临床上抗生素引起的腹泻提供治疗方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及具有氨苄青霉素抗性的乳酸菌及其制剂的制备与应用。

背景技术

在人体定居着大量的微生物，其中主要的就是细菌类，正如我们所知道的它能够定居在人体肠道中，形成复杂的群体或者微生态体系。据统计健康成人的肠道栖息着1014个细菌，是人体细胞总数的10～20倍，有多达近500余种细菌，肠道细菌是人体最庞大、最重要的组成部分，平均每1克大便的细菌数量达到10¹²。机体的宿主细胞、肠道微生物和其他微生物构成了一个复杂的系统，相互影响形成了多种生物学效应。

肠道益生菌(Probiotic)是一类与宿主互利共生、有利于宿主健康的肠道细菌。当前，国内外普遍公认的安全性益生菌菌种主要为乳杆菌属Lactobacillus和双歧杆菌属Bifidobacterium，这两类菌可以在健康成年人的肠道菌群中出现。其他用作益生菌的还有链球菌Streptococcussp.、乳球菌Lactococcussp.、肠球菌Enterococcussp.、拟杆菌Bacteroidessp.、芽孢杆菌Bacillussp.、丙酸菌Propionibacteriumsp.及真菌Fungi等。

肠道益生菌成分组成了机体重要功能，负责3个主要功能：抵制病原微生物的定植；提供营养；免疫调节。益生菌能够结合肠道上的位点，抑制病原微生物的结合，这种潜在的机制可能是有益菌能够产生保护效应抵制病原菌，包括竞争营养或者附着位点，产生抑制新城代谢和抗病原菌作用，调节毒素的产生和活性。有益微生物通过提高日常饮食多糖的分解效应和提供维生素，从而有助于为宿主提供营养。许多研究已经证实益生菌能刺激与获得性免疫相关的功能，激活淋巴细胞并刺激抗体生成，能提高机体的特异性及非特异性免疫功能，对腹泻、炎症、心血管疾病、肥胖等都具有潜在应用价值。

由于抗生素能杀死细菌，在疾病的救治中也发挥了不可替代的作用，在医疗领域得到了广泛的应用。但是，长期使用抗生素及抗生素的滥用，使许多人肠道致病细菌获得耐药性，同时也抑制体内的有益菌，使肠道菌群失衡，从而引起疾病的发生。抗生素所致的肠道生态平衡的改变，可能会导致生态系统抗移植性的丢失和肠病原的过度繁殖，耐药性菌株和条件致病菌的过度生长，有益微生物的抑制，改变肠道生物菌群的功能。

抗生素相关性腹泻(antibiotic-associateddiarrhea，AAD)是抗生素破坏了肠内菌群的自然生态平衡，即生理性细菌明显减少而需氧性菌及兼性厌氧菌数量增加，引起了肠道黏膜损伤和炎症。益生菌已被用于治疗和预防AAD的使用，根据结果临床试验，补充益生菌在多种抗生素治疗幽门螺杆(Helicobacterpylori)感染的根除已被提出作为一个潜在的方法。TaomolaE等采用对照试验研究了LGG酸奶对红霉素(erythromycin)引起腹泻的防止作用，结果发现LGG在接受红霉素治疗的病人体内能够定植，能够降低红霉素引起的腹泻发生率，同时也能减轻由红霉素引起的胃病和肠胃气胀等其他副反应的发生(TaomolaE，CrittendenR，PlayneM，etal.Qualityassurancecriteriaforprobioticbacteria.theAmericanjournalofclinicalnutrition，2001,73(2Suppl)：393S-398S)。Richard等给32名复发行艰难梭菌腹泻患者服用上LactobacillusGG冻干菌粉，其中27个病人一次性治愈，5个病人在治愈10天后复发，但其中3人经再次治疗而治愈，其他2人因失去追踪而宣告失败，这足以说明LGG是治疗复发性艰难梭菌腹泻的安全有效的方法(RichardG.Bennett,ShrewoodL.etal.TreatmentofrelapsingclostridiumdifficilediarrheawithLactobacillusGG.Nutritiontoday31(Suppl)：35S-38S)。E.J.Videlock等采用双盲、安慰剂对照试验，对4138名医院的接受抗生素治疗的病人用益生菌和空白处理，结果益生菌组与安慰剂组患者相比，发生AAD的合并相对危险度(RR)为0.53(95％CI0.44-0.63)，相应的需要治疗人数(NNT)为8(95％CI7-11)，益生菌的预防效应显著(E.J.Videlock，F.Cremonini.Meta-analysis:probioticsinantibiotic-associateddiarrhoea.AlimentaryPharmacologyandTherapeutics，2012,35(12)：1355-1369)。

目前常用的微生态活性制剂大都对抗生素敏感，根据王君耀等人的研究(王君耀，赵锋.3种微生态制剂与常用抗菌药物的相互作用[J].中国医院药学杂志，2003，23(7))，双歧杆菌对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、呋喃妥因、复方磺胺甲恶唑、四环素、红霉素、克林霉素、利福平、泰能、万古霉素等敏感，抗生素能抑制或杀灭微生物活菌，拮抗其作用。张宏梅等(张宏梅,黄绍松,周汉基等.酸奶中乳酸菌对2种抗生素耐药性分析[J].中国公共卫生.2010,26(4):511-512)，从四种酸奶中分离出的7株乳酸菌的基因组中有5株含抗氨苄青霉素的抗性基因Amp。张灼阳等(张灼阳，刘畅.乳酸菌耐药性的研究进展[J].中国微生态学杂志，2007，19(5)：478-480)对几种主要乳酸菌的耐药表型进行总结研究后发现：大部分乳酸菌对抗革兰阴性菌的抗菌药具有耐药性，例如链霉素、庆大霉素和卡那霉素(kanamycin)；乳杆菌属中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌(L.salivarius)和李氏曼乳杆菌(L.leishmanii)都对万古霉素(vancomycin)具有耐药性。石晶红等(石晶红，李少英.双歧杆菌对9种抗菌素的敏感性[J].内蒙古农业大学学报(自然科学版)，2005，26(4)：143-145.)对动物(奶牛)源性双歧杆菌的药敏实验中也得到同样的结论，发现从乳犊牛分离出的不同菌株均对甲硝唑和氨基糖苷类抗菌药表现出较强的耐药性，对β-内酰胺类抗菌药中的头孢氨苄有一定的耐性，而对氨苄西林表现出不同的敏感性。

近十年来，国外在益生菌的耐药性方面做了大量研究工作。D'AIMMO等较系统地报道了双歧杆菌、乳杆菌、片球菌等对卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及与抗性有关的基因，如Bifidobacteriumlongum抗四环素(tetracycline)的基因tetW，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)抗四环素和红霉素(erythromycin)的质粒基因tetM和ermB等(D'AIMMOMR,MODESTOM,BIAVATIB.AntibioticresistanceoflacticacidbacteriaandBifidobacteriumspp.Isolatedfromdairyandpharmaceuticalproducts.InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,115(1):35-42)。TOOMEYN等则进一步研究报道了戊糖乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的抗四环素基因tetM在菌株间的转移(TOOMEYN,BOLTOND,FANNINGS.CharacterisationandTransferabilityofantibioticresistancegenesfromlacticacidbacteriaisolatedfromIrishporkandbeefabattoirs.ResearchinMicrobiology,2010,161(2):127-135)。LiviaqF等通过对Bacteroidesfragilis的研究得到cfxA基因对头孢菌素以及β-内酰胺类的的抗生素抗性起作用(LiviaqF,KatiaESA,JessicaMBD,etal.AssociationBetweentheCfxAGeneandTransposonTn4555inBacteroidesdistasonisStrainsandOtherBacteroidesSpecies.CurrentMicrobiology.2007,54:348-353)。通过研究两株Staphylococcusaureus，得到庆大霉素抗性基因mecA、femA。这种抗药基因在菌种间的转移对于人类将是很大的威胁。

乳酸菌在自然界分布广泛，且作为益生菌广泛应用于食品、饲料和医药卫生等相关领域。近年来，越来越多的研究表明，抗生素的广泛应用在治疗疾病的同时，也使得环境中耐药菌株的种类及数目增加。目前，人类对抗生素抗性的研究大多集中在致病菌上，对乳酸菌的抗生素抗性及抗性基因是否能够水平转移缺少系统性的研究，随着益生乳酸菌的普及和广泛应用，人们对益生菌的研究越来越深入对于乳酸菌的抗生素抗性越来越关注。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株具有氨苄青霉素抗性的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。

本发明的另一目的在于提供一株具有氨苄青霉素抗性的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。

本发明的另一目的在于提供一种用于治疗肠道疾病的制剂。

本发明的再一目的在于提供上述菌株以及制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株具有氨苄青霉素抗性的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，名称为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)HB25，于2014年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014235；

所述的长双歧杆菌的培养条件为将斜面长双歧杆菌菌种接种至乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中，pH6.2～6.4，培养温度为37℃，150～250rpm厌氧振荡培养36～60h，即完成长双歧杆菌的扩增；

一株具有氨苄青霉素抗性的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，名称为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)HL9，于2014年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014234；

所述的嗜酸乳杆菌的培养条件为将斜面嗜酸乳杆菌菌种接种至乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中，pH6.2～6.4，培养温度为37℃，150～250rpm厌氧振荡培养36～60h，即完成嗜酸乳杆菌的扩增；

一种用于治疗肠道疾病的制剂，包括上述具有氨苄青霉素抗性的长双歧杆菌HB25和/或嗜酸乳杆菌HL9；

更优选地，还可以包括动物双歧杆菌BB-12(BifidobacteriumanimalisBB-12)、鼠李糖乳杆菌LGG(LactobacillusrhamnosusGG)、嗜热链球菌ATCC14485(StreptococcusthermophilusATCC14485)或植物乳杆菌ATCC8014(LactobacillusplantarumATCC8014)等肠道益生菌中的一种或一种以上；

其中，动物双歧杆菌BB-12(BifidobacteriumanimalisBB-12)购自丹麦科汉森股份有限公司，嗜热链球菌ATCC14485(StreptococcusthermophilusATCC14485)和植物乳杆菌ATCC8014(LactobacillusplantarumATCC8014)购自上海北诺生物科技有限公司；

表1L.acidophilusHL9和B.longumHB25的菌体生长情况

表2L.acidophilusHL9和B.longumHB25的生理生化特征

所述的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基为：精确称取醋酸钠5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，(NH₄)₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O0.58g，MnSO₄·4H₂O0.25g，1.0mLTween-80，用水定容至1000mL，pH为6.2～6.4，121℃湿热灭菌15min灭菌，备用；固体培养基需在灭菌前加入15～20g/L琼脂；

所述的用于治疗肠道疾病的制剂，长双歧杆菌HB25与嗜酸乳杆菌HL9按照体积比1：(0.2～5)的比例进行混合，得到混合制剂。

更优选地，长双歧杆菌HB25与嗜酸乳杆菌HL9按照体积比1：1的比例进行混合；

所述的用于治疗肠道疾病的制剂，长双歧杆菌HB25或嗜酸乳杆菌HL9的浓度优选为10⁷～10¹²CFU/mL；更优选为3×10⁸CFU/mL；

所述的长双歧杆菌HB25在制备治疗肠道疾病的药物中的应用。

所述的嗜酸乳杆菌HL9在制备治疗肠道疾病的药物中的应用。

所述的用于治疗肠道疾病的制剂在制备治疗肠道疾病的药物中的应用。

所述的长双歧杆菌HB25在构建肠道菌群失调的腹泻动物模型中的应用。

所述的嗜酸乳杆菌HL9在构建肠道菌群失调的腹泻动物模型中的应用。

所述的用于治疗肠道疾病的制剂在构建肠道菌群失调的腹泻动物模型中的应用。

所述的肠道菌群失调，可以是抗生素引起的肠道菌群失调，也可以是肠道致病菌引起的肠道菌群失调。

本发明的机理是：本发明用人体粪便在抗生素压力选择下分离得到具有耐药性的乳酸菌，并进行了11种抗生素敏感性实验，以筛选到的对抗生素具有较高耐药性的菌株为材料，检测是否存在质粒DNA，探讨了在胃肠条件下含质粒菌株生长的耐受性；采用PCR扩增分析菌株的耐药基因定位情况，探索了乳酸菌耐抗生素的分子机制，并对筛选具有抗性基因乳酸菌进行安全性评价，对筛选的抗性菌株进行验证是否对肠道失调具有调节作用，采用“抗生素型肠道菌群失衡模型”，旨在为临床上使用抗生素引起的腹泻、菌群失调等疾病提供潜在的治疗方法。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

现有的益生菌多是多抗生素比较敏感的，而我们所筛选的是具有抗性的肠道益生菌菌株，当临床再次使用抗生素时，肠道益生菌能够在抗生素压力下存活，而普通的益生菌则没有这个能力，因此，可以为临床上抗生素引起的腹泻提供治疗方法。

本研究对筛选的抗性菌株进行验证是否对肠道失调具有调节作用，采用“抗生素型肠道菌群失衡模型”，旨在为临床上使用抗生素引起的腹泻、菌群失调等疾病提供潜在的治疗方法。

附图说明

图1是粘附性实验结果的柱形图；其中，A为Caco-2细胞的结果图；B为Hela229细胞的结果图；HB25为B.longumHB25；HL9为L.acidophilusHL9。

图2是amp耐药基因的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M：DNALadder2000；泳道HB25：B.longumHB25；泳道HL9：L.acidophilusHL9。

图3为HindIII酶酶切基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图和Southern杂交结果图；图A为HindIII酶酶切基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，图B为southern杂交结果图；泳道1：λHindIIIDNAladder；泳道2：L.rhamnosusGGATCC53103；泳道3：B.longumHB25；泳道4：L.acidophilusHL9。

图4为肠道菌群在不同处理条件下的变化的柱形图。

图5为小鼠肠道粪便DGGE分析结果图。

图6为小鼠结肠HE染色分析结果图；A：对照组，B：抗生素处理组，C：益生菌治疗组。

图7为益生菌对肠道菌群的调节作用的过程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1益生菌初筛

菌株分离的具体操作步骤(包括培养温度、时间等)及各培养基组成(如改良MRS培养基等)，以及两株菌的形态学鉴定过程(包括双歧乳杆菌和乳酸杆菌各自的形态学特征描述)

1、培养基：

乳酸杆菌MRS分离固体培养基：精确称取牛肉膏蛋白胨10.0g、胰蛋白胨10.0g、酵母提取液5.0g、无水醋酸钠(NaAc)5.0g、柠檬酸三铵2.0g、K₂HPO₄2.0g、MgSO₄·7H₂O0.58g、MnSO₄·H₂O0.28g、葡萄糖15.0g、l.0mLTween-80至烧杯中，蒸馏水搅拌均匀后加入15.0g琼脂搅拌，待药品完全溶解后再补充蒸馏水至1000mL，用pH计监控并调节培养基pH为6.2～6.4，121℃湿热灭菌15min，备用。

双歧杆菌改良MRS分离固体培养基：精确称取牛肉膏蛋白胨10.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母提取液5.0g，葡萄糖15.0g，醋酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，1.0mLTween-80，MgSO₄0.58g，MnSO₄0.25g，K₂HPO₄2.0g，X-gal60mg，5％(w/w)L-半胱氨酸10mL，蒸馏水搅拌均匀后加入15.0g琼脂搅拌，待药品完全溶解后再补充蒸馏水至1000mL，用pH计监控并调节培养基pH为6.2～6.4，121℃湿热灭菌15min，备用。

2、革兰氏染色液：

结晶紫染液：20mL95％(v/v)乙醇，2g结晶紫，0.8g草酸铵，80mL蒸馏水；碘溶液：1gI₂片，2gKI，300mL蒸馏水；95％(v/v)乙醇；番红复染液：10mL95％(v/v)乙醇，0.25g番红，80mL蒸馏水。

3、益生菌初筛步骤：

所述的病人粪便是从南阳市人民医院的ICU和疾病感染科，收集使用抗生素一周后处于恢复期病人的粪便样品作为实验材料(包括：3个成人恢复期病人(30～38岁)和2个青少年病人(10～18岁)的粪便样品中)。

精确称取收集到的病人粪便样品1.0g，加入到10.0mL试管中，再加入无菌生理盐水9.0mL，进行一系列梯度稀释至10^-99个稀释度。在无菌条件下，用无菌移液器吸取1.0mL粪便上清液，均匀涂布到含有5～10g/L碳酸钙的乳酸杆菌MRS分离固体培养基和双歧杆菌改良MRS分离固体培养基上，置于厌氧培养箱中，37℃厌氧培养48h。培养结束后，取出平板挑选出具有可见溶钙圈或蓝色、浅蓝色的菌落，反复分离划线、纯化至单个菌落，并转接至乳酸菌MRS增菌肉汤培养基(精确称取醋酸钠5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，(NH₄)₂HPO₄2.0g，七水MgSO₄0.58g，MnSO₄.4H₂O0.25g，1.0mLTween-80，用水定容至1000mL，pH为6.2～6.4，121℃湿热灭菌15min灭菌，备用)中在37℃厌氧培养48h，并放入4℃冰箱保存备用。

4、鉴定方法：

(1)菌株的形态学观察

从分离纯化的菌株纯培养物接种到增菌液体培养基中，37℃培养24h复活后，经固定、初染、复染、镜检等革兰氏染色操作后，在光学显微镜下观察其细胞形态特征，并用带有数字成像系统的显微镜BX-51/52(OLYMPUS公司)选取合适视野进行照相记录。

(2)菌株生理生化鉴定

对从样品中分离得到的待测乳酸菌分别进行运动性实验，检测在pH4.5，温度15℃、45℃、6.5％(w/w)NaCl下的生长情况，以及一系列的生理生化检测，如接触酶实验、产H₂S实验、吲哚实验、发酵产酸实验、好氧性实验，以及对双歧杆菌的特征性F6PPK酶的检测。

(3)乳酸菌分子生物学-16SrDNA鉴定

16SrDNA全长通用引物：

引物1：27F--5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

引物2：1492R--5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

PCR反应体系(25μL)：

PCR反应条件为：

以无菌去离子水替代模板作为阴性对照。扩增结束后取3.0μL扩增后的产物，与溴酚蓝混匀后加入加样孔进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，上样液缓冲液为1×TBE溶液，接通电源120V30min。电泳结束后，切割待测胶带送上海生工进行序列测定。将测定菌株的序列结果与NCBI中，与已知的16SrDNA序列进行Blast对比分析得到最相近的菌株，以确定实验所分离细菌的种属。

5、形态学描述：

1)乳酸杆菌能够在乳酸杆菌MRS分离固体培养基中有氧或兼性好氧生长，菌落呈白色，灰色，革兰氏染色多为杆状形态。

2)双歧杆菌需要严格的厌氧条件，一般在平板表面形成的菌落较小，在双歧杆菌改良MRS分离固体培养基呈蓝色或浅蓝色菌落。革兰氏染色呈分叉生长，如X型、Y型。

菌体的生长情况的检查结果见表1，菌株的生理生化检查结果见表2。

表1菌体生长情况检查结果

表2菌株生理生化鉴定结果

3)16SrDNA鉴定结果

进入NCBI核酸数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，输入待测菌株的16SrDNA序列，点击Blast进入比对。

比对结果显示，该菌株的16SrDNA序列与其它多株长双歧杆菌的16SrDNA序列有99％的相似性，初步判断为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，将其命名为BifidobacteriumlongumHB25。

该长双歧杆菌，名称为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)HB25，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2014年5月23日，保藏号：CCTCCNO：M2014235；

比对结果显示，该菌株的16SrDNA序列与其它多株嗜酸乳杆菌的16SrDNA序列有98％的相似性，初步判断为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，将其命名为LactobacillusacidophilusHL9。

该嗜酸乳杆菌，名称为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)HL9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2014年5月23日，保藏号：CCTCCNO：M2014234；

BifidobacteriumlongumHB25菌株的16SrDNA序列：(共1476bp)如SEQIDNo.3所示。

LactobacillusacidophilusHL9菌株的16SrDNA序列：(共1488bp)如SEQIDNo.4所示。

实施例2益生菌的生物学活性评价

待测菌为实施例1获得的BifidobacteriumlongumHB25和LactobacillusacidophilusHL9，对照菌株为鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG，简称LGG，ATCC53103)，分别取实验室冻存于-80℃的菌株，于37℃水浴中融化，在生物安全柜中分别取各菌100μL于100mL的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中进行活化复苏。于37℃气浴摇床上200rpm摇菌12h，菌液进行4000rpm离心15min，离心后去上清液，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤3次，然后将菌体沉淀转移至与标准比浊液离心管相同的试管中，使用无菌生理盐水稀释至需要比标准比浊液的浓度(细菌浊度和10个小麦浊度标准管当量)，即3×10⁸CFU/mL，即得HB25菌悬液、HL9菌悬液和LGG菌悬液。

指示菌为EscherichiacoliATCC11105、ClostridiumdifficileNY-5、StaphylococcusaureusNT-12；分别取冻存于-80℃的菌株，于37℃水浴中融化，在生物安全柜中分别取各菌100μL于100mL的LB液体培养基中进行活化复苏。于37℃气浴摇床上200rpm摇菌12h，取少量菌液用LB液体培养基10倍倍比稀释，确定OD600值为0.08～0.12的稀释度，菌液比浊管麦斯威尔浊度约0.5，约含3×10⁸CFU/mL，即得ATCC11105菌悬液、NY-5菌悬液和NT-12菌悬液。

1、抑菌活性测定

移液器取200μL指示菌(指示菌为EscherichiacoliATCC11105、ClostridiumdifficileNY-5、StaphylococcusaureusNT-12；其中，大肠杆菌EscherichiacoliATCC11105购自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，梭状芽孢杆菌ClostridiumdifficileNY-5和金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusNT-12购自南阳奇伟微生态基因科技开发有限公司)菌悬液含菌数为3.0×10⁸CFU/mL，分别加入到温度为50℃左右的指示菌生长琼脂培养基(指示菌生长琼脂培养基：A、普通细菌培养的营养琼脂培养基(用于大肠杆菌增菌)：NaCl5.0g，胰蛋白胨20.0g，牛肉膏蛋白胨3.0g，琼脂15.0g，补充蒸馏水至1000mL，用pH计监控并调节培养基pH7.0～7.2，121℃湿热灭菌15min灭菌，备用；B、胰蛋白胨大豆(TSA)琼脂培养基(金黄色葡萄球菌的增菌和梭状芽孢杆菌增菌)：胰蛋白胨17.0g/L，植物蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，K₂HPO₄2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂15.0g/L，pH计调pH至7.0～7.2，121℃湿热灭菌15min灭菌，备用)中，迅速混合均匀，倒平板。待平板冷凝后用无菌镊子取出已灭菌的直径为6mm的圆形滤纸片，加100μL待测菌的菌悬液浸湿滤纸片，待完全吸收后，将滤纸片贴放在含有指示菌的指示菌生长琼脂培养基平板中央，迅速转入恒温培养箱37℃厌氧培养24h；ClostridiumdifficileNY-5为厌氧指示菌，则厌氧培养48h后，测定抑菌圈直径，并设重复，取抑菌圈直径的平均值。

2、耐低pH菌株的筛选

取40mL乳酸菌MRS增菌肉汤培养基，用4mol/L的HCl将各份培养基的pH调节为3.0、3.5、4.0。将制备好的待测菌菌悬液按体积百分比2％接种量，分别接种至pH3.0、3.5和4.0的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h，并在620nm处测定细菌的OD值。

3、耐胆盐菌株的筛选

所有冷冻保藏的实验菌株均连续转接3次，每次37℃、200rpm厌氧培养24h，方可用于实验。将制备好的待测菌菌悬液，按体积百分比2％分别接入含体积百分比0.15％，0.3％牛胆汁的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中，每个浓度做3个平行；37℃、200rpm厌氧连续培养24h，并测定A620nm处的细菌吸光度。

4、粘附性试验

将实施例1获得的2株菌株，用于进行粘附性实验，其中对照菌株为鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG，简称LGG，ATCC53103)(鼠李糖乳杆菌LactobacillusrhamnosusGG，简称LGG，ATCC53103购自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC))。

(1)细胞培养物制备

Caco-2和Hela229细胞(Caco-2和Hela229细胞系购自汉恒生物科技(上海)有限公司)，分别按常规传代培养于含质量百分数10％小牛血清的DMEM细胞培养液(DMEM细胞培养液：将50gDMEM粉末溶于950mL去离子水，加入3.7g碳酸氢钠，并用氢氧化钠溶液调pH至7.2，去离子水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，并分装，4℃冰箱保存备用)中，37℃培养于CO₂培养箱中每48h换培养液一次，长成单层后传代接种于有盖玻片的96孔组织培养板上，5％(v/v)的二氧化碳37℃孵育48小时后，进行粘附性实验。

(2)细菌粘附性试验

①试验前将菌株活化成斜面备用；

②在37℃和5％(v/v)CO₂条件下，培养Caco-2和Hela229细胞；

③取制备好的待测菌菌悬液和对照菌株(LactobacillusrhamnosusGG，简称LGG，ATCC53103)菌悬液分别加入到培养好的Caco-2和Hela229细胞中，37℃培养60min；

④用PBS缓冲液(0.1MpH7.2的PBS缓冲液)清除没有附着在细胞上的乳酸菌，洗涤3～4次；

⑤然后用胰酶-EDTA消化液(胰酶-EDTA消化液：用PBS液溶解胰酶和EDTA，配制胰酶使其最终浓度为0.25％，EDTA最终浓度为0.025％。并经过0.22μm无菌微孔滤膜过滤除菌，分装于灭菌的盐水瓶中，-20℃冰箱保存备用)消化单层细胞，细菌涂布于乳酸菌MRS增菌肉汤琼脂培养基(在乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中加入15g/L的琼脂)平板上37℃厌氧培养，并细菌计数。每组实验平行重复3次。

(3)细菌粘附率计算

Adhesionrate％＝CFUbacteriaadhered/CFUbacteriaadded(粘附率％＝细菌附着数/细菌总数)结果进行统计学处理。

5、药敏试验

(1)材料--药敏纸片：11种抗菌药物药敏纸片：利福平(Rf，5μg)，氨苄西林(AM，10μg)，头孢西丁(CF，30μg)，头孢噻肟(CTX，30μg)，四环素(TE，30μg)，氯霉素(CHL，30μg)，环丙沙星(CIP，5μg)，阿米卡星(AK，30μg)，庆大霉素(GM，10μg)，甲氧苄氨嘧啶(TMP，5μg)，万古霉素(VA，30μg)，均购自广州市宜康生物科技有限公司(Oxoid)。

(2)步骤：根据美国临床实验室标准化协会颁布的KB法进行药敏试验(CLSI，2009)。首先用无菌镊子分别夹取含有不同抗生素的药敏纸片，分别贴在已接种待测菌的各平板(200μL待测菌菌悬液含菌数为3.0×10⁸CFU/mL，分别加入到温度为50℃左右的乳酸菌MRS增菌肉汤琼脂培养基)中，迅速混合均匀，倒平板。每个平板贴大约5张药敏纸片，各纸片间距离大致相等，并做好标记。在37℃厌氧过夜培养，观察平板抑菌情况，游标卡尺测定抑菌圈的大小并记录。

6、实验结果：

(1)抑菌活性的试验结果，见表3

表3B.longumHB25和L.acidophilusHL9抑菌活性的试验结果

(2)耐低pH耐胆盐实验结果，见表4

表4B.longumHB25和L.acidophilusHL9耐低pH耐胆盐试验结果

(3)粘附性试验

对2株待测益生菌作用于Caco-2细胞系和阴道子宫颈癌细胞HeLa229细胞系的粘附能力进行了评估，其结果见图1所示。对于Caco-2细胞系(见图1-A)，与对照组L.rhamnosusGG(46.23％)相比，B.longumHB25(53.41％)，L.acidophilusHL9(44.17％)的粘附效率比较适中；对于HeLa229细胞系(见图1-B)，B.longumHB25和L.acidophilusHL9对于Hela细胞的粘附效率均低于LGG(35.79％)，这说明益生菌的粘附具有宿主特异性。不同的益生菌菌株之间的粘附力有明显的差异，而且同种益生菌菌株对于不同细胞的粘附能力也各不相同。

(4)药敏试验，结果见表5所示；

表5B.longumHB25和L.acidophilusHL9的药敏试验结果

注：S-敏感；R-耐药；I-中度耐药。

实施例3

1、菌株质粒的分析

根据万谦的方法(万谦,曹健,吴兴泉等.乳酸菌天然质粒提取方法的优化[J].中国生物工程杂志,2010,30(2):94-99.)进行质粒的提取，取培养过夜的待测菌菌株5～10mL离心后弃上清，用250μL溶液P1(加入溶菌酶，至终浓度20mg/mL)重悬，37℃水浴30min；加入250μL溶液P2迅速混匀后加入350μL溶液P3，混匀，12000rpm离心10min；取上清加入离心柱中，9000rpm离心1min，弃去离心管中液体；用500μLWashBuffer洗涤离心柱两次，将离心柱放入新的EP管中12000rpm离心2min，然后加入50μLElutionBuffer(预先60℃预热)，放置2min后离心，备用。用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如表6所示。

所述的溶液P1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)；须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

所述的溶液P2：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)，1％(w/w)SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

所述的溶液P3：5mol/L乙酸钾，60mL冰乙酸，11.5mL水，28.5mL，所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5分钟。

表6待测菌株B.longumHB25和L.acidophilusHL9没有质粒

2、耐药基因的鉴定

耐药基因PCR和耐药基因定位

以待测菌的基因组DNA为模板；

氨苄引物：上游：引物F：5'-GCAACTTTATCCGCCTCCAT-3'；

下游：引物R：5'-CATTTCCGTGTCGCCCTTAT-3'；

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸6min，退火温度每个循环降低1℃，12个循环，直至57℃；然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸6min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

PCR反应结束以后，根据Marker分子量比较产物的大小，与已知片段大小进行比照，可确定菌株中是否含有相应抗性基因。

从图2中可以看出我们从BifidobacteriumlongumHB25和LactobacillusacidophilusHL9基因组DNA中扩增得到amp耐药基因。

3、耐药基因定位的鉴定

(1)探针制备：

经过耐药性分析，得到具有染色体耐药性的2株菌长双歧杆菌BifidobacteriumlongumHB25和嗜酸乳杆菌LactobacillusacidophilusHL9，用NuSieve-低熔点琼脂糖纯化HB25、HL9的氨苄抗性基因ampPCR产物两次，并地高辛标记探针(DIG系统)。

(2)模板制备：

长双歧杆菌BifidobacteriumlongumHB25和嗜酸乳杆菌LactobacillusacidophilusHL9菌株的基因组DNA(参照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书)用HindIII酶酶切消化。取10μL待测DNA，于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶用EB染料染色，记录结果，结果如图3-A所示。

(3)杂交用胶的制备和DNA转膜：

A、将电泳结束后的凝胶，小心放入30mL0.25mol/LHCl溶液中完全浸入15min。

B、用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

C、将清洗后的凝胶放入含有30mL的变性溶液(1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH)中使凝胶变性30min。

D、将变性后的凝胶放入含有30mL中和液溶液(1mol/LTris·HCl，pH8.0，1.5mol/LNaCl)中使其中和15min。

准备DNA从凝胶向膜转移的平台。切割与待转移胶大小相同的1张待用尼龙膜和3张厚滤纸并在尼龙膜一角做一标记。另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度长度约18cm足以达到转移液盒子的底部。准备10×SSC转移液(称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000mL)。将待用尼龙膜放入蒸馏水中浸湿后，再浸入10×SSC转移液中。

(4)DIG系统杂交：

加入适量的探针到已预热的杂交液中混合均匀，根据的标准程序进行，在42℃下进行严格的杂交、过夜，漂洗5min在2×SSC溶液中，然后使用2×SSC/0.1％SDS在42℃条件下进行10min洗膜；而后用1×SSC/0.1％SDS在42℃条件下进行10min洗膜；再次用0.5×SSC/0.1％SDS在42℃条件下进行10min洗膜；结束后尼龙膜用0.2×SSC/0.1％SDS在56℃洗膜10min；转入0.1×SSC/0.1％SDS在56℃洗膜10min。在尼龙膜的清洗过程中不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。在暗房中取出X光片在显影液中进行显影3～5min，用水冲洗去除显影液置于定影液中定影5～10min，取出X光片冲洗干净，晾干。

所述的显影液：温水(52℃)750mL、米吐尔3g、无水亚硫酸钠45g、对苯二酚12g、无水碳酸钠67.5g、溴化钾19g，水加至1000mL；

所述的定影液：水750mL、硫代硫酸钠240g、无水亚硫酸钠15g、28％(w/w)醋酸48mL、硼酸7.5g、钾矾15g、水加至1000mL。

结果如图3-B所示，通过杂交试验证明了在B.longumHB25基因组DNA大约6.6～9.4kb处有amp基因编码序列，同样在L.acidophilusHL9基因组DNA大约2.3～4.4kb处有amp基因编码序列。而在氨苄敏感性LGG菌株基因组DNA里面没有检测得到amp基因，证明试验方案有效。

实施例4

益生菌对肠道菌群的调节作用的过程如图7所示，A)肠道病原菌，有益菌和宿主维持微生物的动态平衡；B)抗生素处理破坏肠道平衡，使肠道定植抵抗丢失，容易受到病原菌的感染；C)肠道益生菌①通过分泌产生pH、细菌素拮抗病原菌，②通过竞争性拮抗病原菌上皮细胞粘附位点抑制病原菌生长，③通过刺激机体免疫细胞T、B细胞，提高机体免疫应答。

一、材料

1、主要试剂

氨苄西林(Ampicillin)，克林霉素(clindamycin)和链霉素(streptomyci)，购自上海新先锋药业有限公司(Oxoid)。

(1)培养基

脑心浸液(Brainheartinfusion，BHI)培养基：用于肠道厌氧总菌的分离，精确称取C₆H₁₂O₆2.0g，NaCl5.0g，BHI营养物27.5g，磷酸二氢钠2.5g，琼脂15.0g，加水至1000mL，加入琼脂前调pH为7.4±0.2，115℃湿热灭菌15min。

BSM培养基：用于双歧杆菌分离，精确称取琼脂15g，L-半胱氨酸0.5g，莫匹罗星50mg，加水至1000mL，调节pH5.0，115℃湿热灭菌15min，培养基冷却50℃左右加入莫匹罗星。

SCE培养基：用于肠球菌分离，叠氮钠0.5g，NaCl5g，牛肉膏蛋白胨10g，七叶苷0.8g，0.4mL0.05％结晶紫，酵母提取物5g，K₂HPO₄4g，柠檬酸铁铵0.5g，KH₂PO₄1.5g，溶解后加入15g琼脂，并加水至1000mL，pH计调节溶液pH至8.0，115℃湿热灭菌15min。

EMB培养基：用于肠杆菌分离，EMB琼脂粉末45g，加水至1000mL，煮沸溶解，115℃湿热灭菌15min。

(2)小鼠粪便稀释缓冲液：

L-半胱氨酸0.5g，1mL吐温80，酵母粉0.5g，NaCl9g，KH₂PO₄0.21g，Na₂HPO₄0.72g，补充蒸馏水至1000mL，并调节溶液pH至6.2～6.6，118℃高压蒸汽灭菌15min。

(3)三联抗生素溶液：

于无菌条件下，取灭菌双蒸水配制125mg/mL的三联抗生素灌胃用溶液，抗生素溶液均现配现用。

(4)10mLDGGE加样缓冲液：

精确量取0.25mL2％溴酚蓝，0.25mL2％二甲苯青，7mL100％甘油以及2.5mLMilliQ水。

(5)50×TAE电泳缓冲液：

精确称取242gTris碱加入少量双蒸水(DDW)溶解，加入57.1mL的冰HAc，再加入100mLpH8.0的0.5mol/LEDTA，补加DDW定容至1000mL，4℃冰箱储存。

(6)40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺：

精确称取丙稀酰胺38.93g，甲叉双丙稀酰胺1.07g，添加DDW至100mL，常温下溶解后0.45μm微孔滤膜过滤，4℃避光保存。

(7)10％过硫酸铵(AP)：

精确称取0.3g过硫酸胺，加入双蒸水3.0mL，使粉末溶解后使用0.45μm无菌微孔滤膜过滤除菌，4℃冰箱储存。

(8)DGGElordingbuffer：

量取2％溴酚蓝0.25mL，2％二甲苯蓝0.25mL，7.0mL100％甘油，DDW2.5mL。

(9)400mL银染溶液的配制：

精确称取0.8g硝酸银，50mL8×固定液以及350mLMilliQ水。其中8×固定液溶液为200mL乙醇，10mL冰HAc以及40mLMilliQ水。

(10)0％的变性储存液：

(11)100％的变性储存液：

(12)DGGE制胶(24mL)：

2、主要仪器

病理切片机—德国LeicaRM2235；血球计数板—国产；DGGE变性梯度凝胶电泳仪—美国BioRad。

3、实验动物

30只小鼠购自中山大学实验动物中心，合格证号：SCXK(粤2011--0029)，SPF级小鼠BALB/c体重18～22g/只，鼠龄大约在8weeks左右，饲养在SPF级动物实验室，温度维持在18～20℃，湿度维持在50～60％，实验所自动排风，每天光照大约12小时，每日上午更换食、水和消毒垫料1次，并且分笼饲养观察7天能正常进食和饮水者纳入实验用鼠。

二、实验方法

1、建模

SPF级BALB/c小鼠被分成2个大组，即对照组和抗生素处理组。对照组一直灌胃无菌生理盐水5d；抗生素处理组小鼠灌胃剂量相当于成人正常10倍剂量的125mg/mL，三联抗生素溶液0.2mL/次，每天2次，灌胃时间间隔为6h，连续灌胃5d。观察小鼠的生理活动(毛发、进食、粪便等情况)。

2、腹泻观察及程度评定标准

造模及治疗期间，观察受试动物排便状况及粪便外观每天1次。抗生素溶液灌胃后立即观察用药反应2～3分钟，以后每12小时观察记录1次，记录内容：小鼠活动表现和粪便变化情况。腹泻症状等级评定标准如下：

Ⅲ级：水样便，不成形，几乎无粪质，每天排泄次数超过40次。

Ⅱ级：软便，不成形，少量粪质，有黏液和脓，每天排泄次数超过30次。

Ⅰ级：颗粒状粪便，膨大松软，偶见脓头，每天排泄次数超过20次。

O级：正常，健康小鼠粪便颗粒，每天排泄10～20次。

3、益生菌治疗

(1)混合益生菌的制备

益生菌菌株B.longumHB25和L.acidophilusHL9分别在乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中37℃、200rpm厌氧培养24小时后收集菌落，比色后，用生理盐水调整细菌浓度3×10⁸CFU/mL的菌悬液，然后将两种菌悬液按体积比1:1进行混合，制成3×10⁸CFU/mL的混合制剂。

(2)动物给药分组

建模成功的SPF级BALB/c小鼠随机分为抗生素处理组和益生菌治疗组。对照组仍然灌胃无菌生理盐水连续7d；抗生素处理组给予生理盐水7d；益生菌组小鼠灌胃浓度为0.5mL3×10⁸CFU/kg/day菌悬液。

4、检测

小鼠粪便收集时间点为第0d、第5d和第12d。最后将SPF级BALB/c小鼠脱颈椎处死，取实验小鼠结肠组织用于病理切片的制备。结肠组织的病理切片：脱颈椎处死小鼠后，取结肠样1×1cm²，置于滤纸片上小心裁开，轻微冲洗后，腔面朝向滤纸面，在中性甲醛溶液进行固定，石蜡包埋，切片机切片完毕后考片脱蜡，使用常规H/E染色，染色后在光镜下观察并做图像分析处理。

5、肠道细菌微生物区系的DGGE分析

16SrDNAV6-V8区的引物：

V6-V8引物F：

U968-5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3'；

V6-V8引物R：L1401-5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'；

扩增结束后，对PCR扩增的产物进行DGGE凝胶电泳分析。DGGE使用8％聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为35％～60％(将100％变性梯度定义为包含40％(v/v)甲酰胺和7mol/L尿素)，电泳缓冲液为1×TAEBuffer。电泳采用DCode^TM变性梯度凝胶电泳仪(Bio-Rad，USA)，首先在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液，打开电泳仪预热到60℃；并向加样孔中加入PCR扩增产物，打开电源在220V电压下进行10分钟的预电泳，随后在85V的固定电压下电泳16h。电泳结束后，进行硝酸银染色和定显影，洗涤，放于干净的玻璃板上，自然晾干并照相。电泳后的凝胶胶带采用QuantityOne(BioRad，美国)进行条代数、多样性及UPGMA相似性聚类分析。

6、组织切片

由二氧化碳麻醉和斩首处死小鼠，收集结肠组织。新鲜结肠组织小切片立即固定在含有10％的福尔马林缓冲液中并包埋在石蜡。石蜡包埋的组织进行切片(5μm)和安装用于组织染色。使用带一系列的二甲苯去除固定剂，再水化，然后在去离子水洗15分钟，以除去任何残留的固定液。组织切片随机选取苏木精伊红(H/E)染色，并由两位有经验的实验观察员在光学显微镜下观察并记录(Olympus，日本)。

7、统计学分析

所有数据以平均数M±标准方差表示。用SPSS17.0软件进行数据结果的统计学分析，组间比较采用t检验，P<0.05的值表示为对比组差异具有显著性的统计学意义，P<0.01的值表示为对比组差异具有极显著性的统计学意义。

三、实验结果

1、模型建立

抗生素处理小鼠6天后，小鼠体重出现显著性变化，随着处理时间的增长，小鼠体重逐渐减轻，小鼠的体重从刚开始的20.73±0.21g减少到18.07±0.37g，而对照组小鼠体重则增加，从20.75±0.17g增加至23.46±0.24g，造模4天小鼠体重变化更加明显见表7。说明抗生素处理小鼠能够引起小鼠体重的变化，引起小鼠腹泻的产生。并且收集到的小鼠粪便样品含水量较正常小鼠显著增加，呈稀软状，而且小鼠表现出毛发无光泽、饮食减少、粘液稀便等腹泻常见症状，证实实验中的抗生素确实能够造成小鼠腹泻，说明造模成功；但是当服用益生菌后，小鼠的腹泻症状改善，益生菌灌胃第10天小鼠稀便率得到显著缓解与抗生素处理组相比，结果见表8，随着益生菌的治疗作用，小鼠的腹泻数量显著减少了。与抗生素处理组小鼠相比，在12天的时候小鼠有8只小鼠表现为轻度腹泻或者无腹泻发生。

表7抗生素处理小鼠后的体重变化

表8益生菌治疗后小鼠腹泻情况

2、肠道菌群的变化

抗生素处理6天后，小鼠肠道菌群出现重度失衡，肠道的总厌氧菌从8.87±0.17log₁₀CFU/g减少到4.13±0.15log₁₀CFU/g，乳酸杆菌从7.82±0.33log₁₀CFU/g明显减少到2.35±0.23log₁₀CFU/g，而且双歧杆菌则没有检测到在抗生素处理后(P<0.01)，与对照组比较，益生菌组小鼠肠道肠球菌数量显著减少，而且检测不到(P<0.01)，相反肠杆菌的数量则增加在抗生素组中，(图4)。当给予小鼠灌胃益生菌(10⁹CFU/mL)处理后，小鼠粪便中的厌氧总菌均得以恢复到10.08±0.36log₁₀CFU/g，同时均出现肠球菌逐渐增多的现象，双歧杆菌(8.87±0.17log₁₀CFU/g)和乳杆菌(7.54±0.35log₁₀CFU/g)也得以恢复(P<0.05)。

3、肠道细菌微生物区系的DGGE分析

基因组DNA的V6-V8区引物PCR-DGGE分析表明，大剂量抗生素灌胃处理(抗生素组)后，小鼠粪便微生物区系的优势菌群发生变化，见图5，与Control组(对照组)相比，DGGE图谱的条带数显著减少(P<0.01)，肠道菌群的多样性指数和丰富度均极显著低于Control组(P<0.01)，见表9。抗生素小鼠灌胃组，粪便细菌菌群整体的多样性和细菌种类明显减少，分别从31.73±1.59减少到26.45±0.83，3.43±0.05到3.09±0.04。大剂量抗生素灌胃处理后，使用B.longumHB25和L.acidophilusHL9益生菌策略对小鼠肠道菌群进行调整，经过V6-V8区引物的PCR-DGGE分析，我们得出使用益生菌对菌群失调小鼠调节，其肠道微生物数量增加，且菌群的丰富度得到恢复，分别从33.45±0.79增加到26.45±0.83且高于正常处理组(P<0.05)(表9)。相似性聚类分析结果表明，益生菌治疗组(Probiotics)小鼠(72％)与抗生素处理菌群重度失衡组小鼠(63％)的差异明显，而与对照组(74％)的相似程度较高，证明益生菌的食用添加对于小鼠肠道菌群失衡的调理作用效果显著，具有治疗作用。

表9小鼠粪便细菌微生物区系16SrDNAV6-V8区引物的DGGE分析

注：H’^A,ShannonWienerindex,H’max^B,maximumShannonWienerindex.E＝H’^A/H’max^B.ResultsareshownasM±SD.Comparedtocontrolgroup,^aP<0.01,^bP<0.05.Comparedtoantibioticsgroup,^cP<0.05.

4、小鼠结肠HE染色分析

HE染色表明正常组小鼠结肠黏膜完整，上皮细胞刷状缘清晰可见，具有正常的粘膜下血管，腺体结构排列紧凑规则，无充血，无水肿现象，见图6-A。模型组结肠粘膜上皮细胞广泛缺失，腺体大多数不完整，结肠柱状上皮轻度水肿，部分脱落于肠腔，可见隐窝脱落、炎症细胞广泛浸润，呈典型炎症改变，见图6-B。益生菌治疗组与模型组比较，小鼠结肠上皮水肿得到缓解，但是与对照组比较肠绒毛仍有部分的脱落，见图6-C。

初步的探讨了混合益生菌对小鼠肠道菌群失调的调节作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。