一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法

摘要

本发明公开了一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法：(1)将表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞与白血病细胞等比例混合后移植到免疫缺陷小鼠模型体内，抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的保藏号CCTCCNO:C201503；(2)对免疫缺陷小鼠模型的外周血细胞染色；(3)将染色后的外周血细胞采用流式细胞仪进行检测。本发明的优点在于，把人白血病细胞与能够抑制其发展的细胞共同移植入免疫缺陷小鼠模型中，可以真实地反映出对不同人体白血病细胞的抑制作用，能够保证检测抑制作用方法的高效性、精确性。

说明书

技术领域

本发明属于生物学嵌合抗原受体T细胞技术领域，具体是一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CART细胞)是表面表达识别特定抗原并能传递信号的嵌合型受体的T细胞。T细胞在抗肿瘤中发挥重要作用，CART细胞是表达这样一类分子的T细胞：胞外段是抗体重链和轻链可变区通过一条肽段相连接，形成单链可变区(ScFv)，胞内段是各种信号传导分子的胞内段嵌合体，包括CD3zeta、CD28、OX-40、4-1BB等，跨膜区则来自其他分子(如CD8，CD4，CD28和CD3zeta)的跨膜区。CART细胞通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。CART细胞在肿瘤免疫治疗中的应用前景广阔，市场价值巨大。然而，CART细胞免疫治疗在中国的发展滞后于发达国家，且临床应用缺乏严格规范。而且现有CART细胞并不能治疗所有类型的肿瘤，新型CART细胞是未来肿瘤免疫治疗的新方向。但新型CART细胞的安全可靠性需要得到验证后才可以在人体进行临床试验。目前，验证CART细胞对肿瘤细胞的杀伤主要是通过体外共培养实验，但体外共培养实验并不能真实反映CART细胞在肿瘤患者体内的作用，而且不同肿瘤患者对同一CART细胞的反应也不同，因此对每个患者进行个体化的临床前试验可为CART细胞治疗的安全性和有效性提供保障。

2013年，CART细胞免疫疗法被列为美国《科学》杂志年度十大科学突破榜首。但该免疫疗法安全性和有效性有待提高，加上其治疗费用昂贵，因此目前只停留在临床试验阶段。临床试验具体程序包括:(1)从患者外周血中分离出T细胞；(2)用CD3、CD28抗体对T细胞进行刺激活化和扩增；(3)构建包含嵌合抗原受体基因的逆转录病毒或慢病毒；(4)用病毒转染T细胞使T细胞表达嵌合抗原受体；(5)将表达嵌合抗原受体的T细胞重新输回患者本人体内；(6)监测患者的各项提示该疗法效果的临床指标，这种直接以人体为对象的验证方法，并不能实现产业化。

综上，现有技术中验证CART细胞对肿瘤细胞的抑制作用时存在以下缺陷：不能真实的反映CART细胞对于肿瘤细胞的抑制作用，无法保证准确性，也不能实现产业化，这些缺陷都制约着CART细胞应用的发展。

发明内容

针对现有技术中无法保证验证CART细胞对肿瘤细胞抑制作用的准确性，也不能实现产业化的缺陷，本发明提供一种抗CD19嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法，其实现的目的是，得到一种安全、可靠、精确度高、可产业化应用的验证方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，本发明公开的一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法，包括如下步骤，(1)将表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞与白血病细胞等比例混合后移植到免疫缺陷小鼠模型体内，抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的保藏号CCTCCNO:C201503，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏日期为2015年2月13日，且该保藏中心已于2015年3月12日对本发明的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞检测完毕；一般细胞等比例指的是细胞个数等比例；

(2)采集免疫缺陷小鼠模型的外周血细胞，用荧光标记的抗人CD45和CD19抗体对外周血细胞染色；

(3)将步骤(2)染色后的细胞采用流式细胞仪进行检测，根据白血病细胞的数量即可检测出抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用。本发明设计的检测方法，将人白血病细胞移植入免疫缺陷小鼠模型中，可以了解个体差异的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用，真实反映对人体白血病细胞的抑制作用，能够保证检测抑制作用方法的高效性、精确性。

作为优选，免疫缺陷小鼠模型为NOD/SCIDIL2Rg-/-免疫缺陷小鼠，NOD/SCIDIL2Rg-/-免疫缺陷小鼠是指NOD/SCID小鼠敲除IL-2Rgamma基因后获得的高度免疫缺陷型小鼠，具体详见公开号为103409468A的专利文件，该小鼠的建立方法也是本申请人开发设计完成的，已可以通过商业方式获得，NOD/SCIDIL2Rg-/-免疫缺陷小鼠体内缺乏T、B和NK三种对免疫功能至关重要的细胞，该小鼠体内可以生长人的细胞和组织，借助该小鼠模型，较真实地反映人体内环境，进一步保证检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用方法的精确性。

进一步的，白血病细胞为B细胞白血病细胞。

进一步的，步骤(2)中还可以采集免疫缺陷小鼠模型的骨髓、脾脏细胞，然后用荧光标记的抗人CD45和CD19抗体对骨髓、脾脏细胞染色。采取骨髓、脾脏细胞可以保证检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用的准确性。

进一步的，获得表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的方法包括如下步骤，(1)合成抗CD19的嵌合抗原受体细胞的基因，合成的基因记为CAR19；

(2)慢病毒质粒的构建：①合成的CAR19基因整合在pUC57质粒中，记为pUC57-CAR19质粒；②用限制酶PmeI和SpeI对pWPXLd-EGFP和pUC57-CAR19进行双酶切，再通过琼脂糖电泳、胶回收试剂盒MAGEN切胶回收提取到CAR19基因片段和pWPXLd-EGFP骨架大片段；③用SolutionI将CAR19和pWPXLd-EGFP片段连接起来，反应体系为5ulSolutionI加4ulCAR19和1ulpWPXLd-EGFP片段，16℃反应2h，连接产物转化到TOP10感受态大肠杆菌；④将转化后感受态细菌涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，37℃过夜培养；⑤第二天挑取4个细胞克隆至2ml含50ug/ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃，250rpm培养12h，用质粒小提试剂盒MAGEN提取4管细菌中的质粒；⑥通过PmeI和SpeI双酶切进行鉴定，构建好的质粒记为pWPXLd-CAR19-EGFP；⑦采用质粒大提试剂盒提取慢病毒包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2以及pWPXLd-CAR19—EGFP质粒待用；

(3)CAR19慢病毒的制备：通过293T细胞包装慢病毒，具体操作如下：①用DMEM高糖培养基加10％FBS和1％双抗培养293T细胞至150mm培养皿，待293T细胞密度达80-90％时，换成DMEM高糖培养基加1％FBS和1％双抗培养2-6h后，用PEI将pWPXLd-CAR19-EGFP或对照质粒pWPXLd-EGFP、pMD2.G和psPAX2三个质粒转化293T细胞，每个150mm培养皿转化9μg的pWPXLd-CAR19-EGFP或对照质粒pWPXLd-EGFP，3μg的pMD2.G和12μg的psPAX2，PEI为72ug；②转化后的24h、48h和72h收集三次上清，上清经2500g离心后，通过0.45μm过滤器过滤后，超高速离心机28000rpm离心1.5h，立即去上清后，每个超速离心管加入200μlPBS，置于4℃过夜重悬，次日将含慢病毒的PBS收集即可；

(4)T细胞的分离纯化：首先通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再通过MACS磁珠分选出T细胞；

(5)T细胞的活化增殖：①预先包被抗CD3OKT-3和CD28抗体：用PBS将抗CD3和CD28抗体稀释成1μg/ml和2μg/ml，加入六孔板中，每孔1ml，37℃培养箱包被2h；②T细胞用含10％FBS和1％双抗的RPMI-1640培养基稀释至2.5x10⁶个/ml，将6孔板中的包被液吸掉，加入每孔3ml的含T细胞培养基，③将T细胞放在37℃，5％CO₂培养箱中，刺激T细胞48h；

(6)T细胞的慢病毒转染：将刺激后的T细胞重悬起来，300g，5min离心去上清后换上新鲜的含8μg/mlpolybrene的RPMI-1640培养基，在不同孔中分别加入表达GFP和CAR19的慢病毒，根据慢病毒滴度，MOI设为10。37℃，5％CO₂培养箱培养24h后，重悬细胞，300g，5min离心去上清后换上新鲜的含300IU/mlIL-2的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO₂培养箱培养24h后，流式检测GFP呈阳性，即说明得到了表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞。

进一步的，步骤(6)中得到表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞后，还可以将该细胞扩增：将得到的表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞用含浓度为300IU/mlIL-2的RPMI-1640培养基进行培养，表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞在培养基中的浓度为1-2x10⁶个细胞/ml，2-3天进行一次培养基半量换液，并对T细胞进行计数，培养2周后可获得扩增后的T细胞，经上述方法对获得的表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞可扩增100倍，扩增出的更多细胞可用于与不同人的白血病细胞等比例混合后移植到免疫缺陷小鼠模型体内，对其抑制白血病细胞的作用进行检测。

本发明采用上述合成方法得到抗CD19的嵌合抗原受体T细胞背景纯净，没有其它影响试验效果的因素，同时还具有耗费低、耗时短、操作简便等优点。

综上，本发明的有益效果：借助于免疫缺陷小鼠模型，把白血病细胞及抑制其发展的细胞移植入免疫缺陷小鼠模型中，可以真实地反映出嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用，能够保证检测抑制作用方法的高效、精确性；本发明优选的自己合成的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞，能够了解整个细胞的构建环节，确保该细胞真实、有效，不会影响后续验证步骤的多余的基因表达，从而进一步保证了检测方法的高效、高精确性；综上，本发明可为CART细胞免疫治疗提供良好的个体化临床前检测平台，是一种安全、可靠、高效的检测方法。

附图说明

图1为实施例一中采用本发明方法CAR19T细胞组与对照组抑制白血病细胞效果对比试验图；

图2为实施例二中CAR19慢病毒载体图谱；

图3为实施例二T细胞转染CAR19慢病毒后的GFP阳性率示意图；

图4为实施例二中采用本发明方法CAR19T细胞组与对照组抑制白血病细胞效果对比试验图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明内容，需要说明的是，在没有特殊说明的情况下，本发明所采用的试剂以及操作方法均是本领域技术人员公知的常识，操作条件均是常温常压下的自然条件。

实施例一：本发明公开的一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法，以B细胞白血病细胞为例，检测方法包括如下步骤，(1)将表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞与B细胞白血病细胞等比例混合后移植到免疫缺陷小鼠模型体内：细胞等比例混合一般指的是细胞个数等比例，例如抗CD19的嵌合抗原受体T细胞与B细胞白血病细胞各为5x10⁶个细胞，抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的保藏号CCTCCNO:C201503，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏日期为2015年2月13日，且该保藏中心已于2015年3月12日对本发明的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞检测完毕；其中免疫缺陷小鼠模型是在生物领域中常用到的试验材料，可从中国科学院上海实验动物中心购买得到，B细胞白血病细胞可从医院、肿瘤研究所细胞库里获得；

(2)采集免疫缺陷小鼠模型的外周血细胞，用荧光标记的抗人CD45和CD19抗体对外周血细胞染色；CD45CD19标记的是人的细胞，用以确定免疫缺陷小鼠模型内是否存在人的白血病细胞以及白血病细胞的比例；

(3)将步骤(2)染色后的细胞采用流式细胞仪进行检测：在检测时一般都要设置对照组，步骤(2)的细胞记为实验组，根据对照组与实验组的B细胞白血病细胞的数量，即可检测出抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对B细胞白血病细胞的作用，例如，对照组仅是将正常、没有改造的T细胞与B细胞白血病细胞等比例移植入免疫缺陷小鼠模型中，然后采集免疫缺陷小鼠的外周血细胞，用荧光标记的抗人CD45抗体对外周血细胞染色，此为对照组细胞，如以下实验组细胞和对照组细胞流式细胞仪检测的结果：其结果如图1所示，从图中可以明确，实验组与对照组免疫缺陷小鼠体内外周血(PB)中B细胞白血病细胞(CD45+CD19+)的比例：对照组的外周血中有6.35％的B细胞白血病细胞，实验组为0.153％，还可以进一步采用对照组、实验组的免疫缺陷小鼠的骨髓、脾脏细胞中的B细胞白血病细胞来验证该检测方法的精确性，图中显示出的结果为，对照组小鼠的脾脏中有42.1％的B细胞白血病细胞，实验组为3.75％；对照组小鼠的骨髓中有68.4％的B细胞白血病细胞，实验组为0.653％。

由实施例列举的检测方法可知，本发明设计的检测方法，将人白血病细胞移植入免疫缺陷小鼠模型中，最后根据白血病细胞的数量即可检测出抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用，方法简便、明了，可以了解个体差异的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用，真实反映同人体白血病细胞的抑制作用，能够保证检测抑制作用方法的高效性、精确性，同时根据此检测方法得到的检测数据也是为白血病的研究提供大量的可靠数据支持。

实施例二：本发明公开的一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法，以B细胞白血病细胞为例，检测方法包括如下步骤，(1)将表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞与B细胞白血病细胞等比例混合后移植到免疫缺陷小鼠模型体内：细胞等比例混合一般指的是细胞个数等比例，例如抗CD19的嵌合抗原受体T细胞与B细胞白血病细胞各为5x10⁶个细胞，抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的保藏号CCTCCNO:C201503，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心，保藏日期为2015年2月13日，且该保藏中心已于2015年3月12日对本发明的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞检测完毕；其中免疫缺陷小鼠模型是在生物领域中常用到的试验材料，可从中国科学院上海实验动物中心购买得到，B细胞白血病细胞可从医院、肿瘤研究所细胞库里获得；

(2)采集免疫缺陷小鼠模型的外周血细胞，为了保证检测结果的精确性，还可以采集免疫缺陷小鼠的骨髓、脾脏细胞用荧光标记的抗人CD45和CD19抗体对外周血细胞染色；

(3)将步骤(2)染色后的细胞采用流式细胞仪进行检测。

步骤(1)中作为优选，免疫缺陷小鼠模型为NOD/SCIDIL2Rg-/-免疫缺陷小鼠，NOD/SCIDIL2Rg-/-免疫缺陷小鼠是指NOD/SCID小鼠敲除IL-2Rgamma基因后获得的高度免疫缺陷型小鼠，具体详见公开号为103409468A的专利文件，该小鼠的建立方法也是本申请人开发设计完成的，NOD/SCIDIL2Rg-/-免疫缺陷小鼠体内缺乏T、B和NK三种对免疫功能至关重要的细胞，该小鼠体内可以生长人的细胞和组织，借助该小鼠模型，真实地反映人体内环境，进一步保证检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用方法的精确性。

进一步的，获得表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的方法包括如下步骤，(1)合成抗CD19的嵌合抗原受体细胞的基因，合成的基因记为CAR19：从NCBI数据库中搜索到抗CD19的嵌合抗原受体FMC63-28Zreceptorprotein的基因序列，其基因序列见序列表，抗CD19的嵌合抗原受体FMC63-28Zreceptorprotein的基因序列的首端加上PmeI酶切位点gttaaacg，末端加上SpeI酶切位点actagt，交由金斯瑞公司合成；

(2)慢病毒质粒的构建，见图2，其具体操作为：①合成的CAR19基因整合在pUC57质粒中，记为pUC57-CAR19质粒；②用限制酶PmeI和SpeI对pWPXLd-EGFP和pUC57-CAR19进行双酶切，再通过琼脂糖电泳、胶回收试剂盒MAGEN切胶回收提取到CAR19基因片段和pWPXLd-EGFP骨架大片段；③用SolutionI将CAR19和pWPXLd-EGFP片段连接起来，反应体系为5ulSolutionI加4ulCAR19和1ulpWPXLd-EGFP片段，16℃反应2h，连接产物转化到TOP10感受态大肠杆菌；④将转化后感受态细菌涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，37℃过夜培养；⑤第二天挑取4个细胞克隆至2ml含50ug/ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃，250rpm培养12h，用质粒小提试剂盒MAGEN提取4管细菌中的质粒；⑥通过PmeI和SpeI双酶切进行鉴定，构建好的质粒记为pWPXLd-CAR19-EGFP；⑦采用质粒大提试剂盒提取慢病毒包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2以及pWPXLd-CAR19—EGFP质粒待用；

(3)CAR19慢病毒的制备：通过293T细胞包装慢病毒，具体操作如下：①用DMEM高糖培养基加10％FBS和1％双抗培养293T细胞至150mm培养皿，待293T细胞密度达80-90％时，换成DMEM高糖培养基加1％FBS和1％双抗培养2-6h后，用PEI将pWPXLd-CAR19-EGFP或对照质粒pWPXLd-EGFP、pMD2.G和psPAX2三个质粒转化293T细胞，每个150mm培养皿转化9μg的pWPXLd-CAR19-EGFP或对照质粒pWPXLd-EGFP，3μg的pMD2.G和12μg的psPAX2，PEI为72ug；②转化后的24h、48h和72h收集三次上清，上清经2500g离心后，通过0.45μm过滤器过滤后，超高速离心机28000rpm离心1.5h，立即去上清后，每个超速离心管加入200μlPBS，置于4℃过夜重悬，次日将含慢病毒的PBS收集即可；

(4)T细胞的分离纯化：首先通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再通过MACS磁珠(美天旎)分选出T细胞；

(5)T细胞的活化增殖：①预先包被抗CD3OKT-3和CD28抗体：用PBS将抗CD3和CD28抗体稀释成1μg/ml和2μg/ml，加入六孔板中，每孔1ml，37℃培养箱包被2h；②T细胞用含10％FBS和1％双抗的RPMI-1640培养基稀释至2.5x10⁶个/ml，将6孔板中的包被液吸掉，加入每孔3ml的含T细胞培养基，③将T细胞放在37℃，5％CO₂培养箱中，刺激T细胞48h；

(6)T细胞的慢病毒转染：将刺激后的T细胞重悬起来，300g，5min离心去上清后换上新鲜的含8μg/mlpolybrene的RPMI-1640培养基，在不同孔中分别加入表达GFP和CAR19的慢病毒，根据慢病毒滴度，MOI设为10。37℃，5％CO₂培养箱培养24h后，重悬细胞，300g，5min离心去上清后换上新鲜的含的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO₂培养箱培养24h后，流式检测GFP呈阳性，即说明得到了表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞，见图3，未转染慢病毒的T细胞(WT)GFP为阴性，而转染了CAR19慢病毒的T细胞则有22.6％的细胞为GFP阳性。

步骤(6)中得到表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞后，还可以将该细胞扩增：将得到的表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞用含浓度为300IU/mlIL-2的RPMI-1640培养基进行培养，表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞在培养基中的浓度为1-2x106个细胞/ml，2-3天进行一次培养基半量换液，并对T细胞进行计数，培养2周后可获得扩增后的T细胞。

采用上述方法，检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用，在检测时一般都要设置对照组，步骤(2)的细胞记为实验组，根据对照组与实验组的B细胞白血病细胞的数量，即可检测出抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对B细胞白血病细胞的作用，例如，对照组仅是将正常、没有改造的T细胞与B细胞白血病细胞等比例移植入免疫缺陷小鼠模型中，然后采集免疫缺陷小鼠的外周血细胞，用荧光标记的抗人CD45抗体对外周血细胞染色，此为对照组细胞，如以下实验组细胞和对照组细胞流式细胞仪检测的结果：如图4所示，对照组外周血中B细胞白血病细胞的比例为2.42％，CAR19T细胞处理组为0.301％，对照组脾脏和骨髓中的B细胞白血病细胞比例分别为25.5％和48.8％，而CAR19T细胞处理组的比例分别为5.11％和3.67％。

以上所述，并非对本发明内容作任何限制，凡是根据本发明内容技术实质上的修改，均仍属于本发明内容技术方案的保护范围内。