预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物

摘要

本发明涉及用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物，更具体而言，涉及作为有效物质含有由从南极地衣类的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon？alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品。本发明的新型化合物具有非常优秀的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(protein？tyrosine？phosphatase-1b)活性的作用，在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中选择性地只对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b起作用，并能够作为实质性的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂来应用于糖尿病的治疗中，对糖尿病和肥胖症的预防或治疗非常有效。

说明书

本申请是申请日为2011年07月01日、申请号为201180059184.3、发 明名称为“预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物”的发明 专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合 物，更具体而言，涉及作为有效成分含有由从南极地衣类的高山珊瑚枝地衣 (Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的预防或治 疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品。

背景技术

已知地衣类会产生与高等植物不同的独特的二次代谢物(Ingolfsdottir,K., Phytochemistry,61：729,2002)，这些地衣类产生的二次代谢物大部分属于缩 酚酸(depside)、缩酚酸环醚(depsidone)和二苯并呋喃(dibenzfurane)，推测这些 化合物与地衣类较低的生长率有关联(Kumar,K.C.S.etal.,J.Nat.Prod.,62： 817,1999；Huneck,S.,Naturwissenschaften,86：559,1999)。另外，通过筛查 确认了包含抗生素、抗分枝杆菌、抗病毒、镇痛作用和解热作用等在内的地 衣类代谢物的多种生物学活性(Ingolfsdottir,K.,Phytochemistry,61：729, 2002；Kumar,K.C.S.etal.,J.Nat.Prod.,62：817,1999)。因此，对利用地衣 类代谢物的医药品开发的关注日益增加。

另外，糖尿病是由于胰岛素作用、胰岛素分泌或该两种均有缺陷而发生 的包括高血糖的代谢紊乱综合症，是未来血管并发症可能性高的疾患，主要 可分为一型糖尿病和二型糖尿病。第一型(胰岛素依赖性)糖尿病的原因是免 疫介导的胰岛β细胞的破坏及因此而导致的胰岛素的绝对缺乏，第二型(非胰 岛素依赖性)糖尿病是因为虽分泌胰岛素，但分泌量不充分，或人的身体不能 有效利用所分泌的胰岛素而发生的。在体细胞不能起到有效作用的“胰岛素 抵抗(Insulinresistance)”状态下，由于不能有效利用体内的能源，尤其是不 能有效利用体内的糖，因而缺乏必要的能源，而未能使用的糖在血液中堆积 过量，结果，通过尿液排出。糖尿病是不能根治的慢性退化性疾病中的一种。

世界卫生组织(Worldhealthorganization：WHO)和联合国(United Nations：UN)强调了到2007年末全世界糖尿病患者将达到约2亿4600万 名，因糖尿病导致的死亡也在逐年增加，因此预防糖尿病的发生、严格的血 糖控制及预防并发症是很重要的。而且，根据韩国糖尿病学会和健康保险审 查评估院的调查结果，在韩国，2003年的糖尿病患者总数为401万名，到 2030年将达到720万名，将每7名中有1名为糖尿病患者。尤其是，急速增 加的医疗费不仅与糖尿病患者数的增加有密切的关系，而且与糖尿病并发症 的持续增加及糖尿病患者的平均寿命的增加也有密切的关系。随着快速的经 济发展，饮食生活的变化使平均寿命延长，但是糖尿病等慢性退化性疾病反 而呈现增加的现象。

韩国的糖尿病的特征是第二型糖尿病占99％以上，第一型糖尿病的发病 概率为约1％以下，这与国外所报告的第二型糖尿病为90％左右，第一型糖 尿病为10％左右的情况不同。糖尿病的发病原因是多种要因复合形成的，其 重要因素有遗传(家庭病史为约20％)和环境、年龄(40岁-49岁之间为约60％ 上下)、肥胖、身体的抵抗力低下、乱用药物和因压力的刺激等。糖尿病的发 病机理尚未详细查明，但除了几种特殊的糖尿病(例如MODY等)之外，糖尿 病是由于多个遗传因素而发病的疾患，找到具有一致性的相关基因有局限 性。即，糖尿病的发病与多种基因有复杂的关联，目前也不断有很多新的基 因被发现。

由于糖尿病是因多种发病机理而发病的，因此其治疗方法也是多样化， 而且，在多种情况下，仅凭现有的常用的治疗方法不能取得令人满意的效果， 因此需要新的治疗方法。有关治疗糖尿病药物的研究主要以治疗占糖尿病患 者的90％以上的第二型糖尿病的药物为中心(表1和表2)。

表1

韩国糖尿病相关药物开发现况

资料：2004-医药行业白皮书，韩国保健产业振兴院，2004年12月

有很多有关促进胰岛素分泌的化合物(吡咯格列、利诺格列、2，4-二氨 基-5-氰基-二溴吡啶、肠促胰岛素、瑞格列奈和那格列奈)、胰岛素作用增强 剂(曲格列酮)、胰岛素抵抗性改善剂、在靶组织显示胰岛素类似效果的药物 (吡咯格列、利诺格列、二氯乙酸盐、赖脯胰岛素、速效胰岛素制剂)、葡萄 糖新合成抑制剂(脂肪分解抑制剂、肉碱转移酶抑制剂、肉碱转移酶抑制剂)、 延缓吸收碳水化合物的药物(膳食纤维及α-葡萄糖苷酶抑制剂)和胰淀素类 似物(普兰林肽)的研究。

其中部分已上市，但大部分还处于不足以在人体使用的实验阶段，或处 于毒性检查阶段。特别是，基于生物节律的速效性胰岛素分泌促进剂和胰岛 素抵抗性改善剂会成为糖尿病治疗手段中的有效的方法之一，预计未来这些 药物的开发将更加活跃。

另外，以往，在胰岛素抵抗性的原因在于胰岛素受体缺陷的推定下，有 关糖尿病病因的研究已进行了十年，但目前，正向胰岛素的信号传达体系转 换研究方向。

表2

用于治疗糖尿病的新药物的开发现状

资料：保健产业技术动向，“糖尿病治疗剂的最新研究动向”，2003

据报告，检查肥胖型(obesetype)及非-肥胖型(non-obesetype)的第二型糖 尿病患者的脂肪细胞中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1b，proteintyrosine phosphatase-1b)活性的结果，与正常组相比，蛋白质的表达分别增加3倍和 5.5倍，活性为71％和88％。另外，最近，据报告，敲除蛋白酪氨酸磷酸酶 -1b的小鼠表现出对胰岛素的敏感性增加和对高脂肪饮食的抵抗性。而且， 根据最近发表的多数研究，似乎抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的化合物在 靶细胞中增加胰岛素的敏感性，从而能够克服胰岛素抵抗性。韩国化合物银 行为了从尚未开发成药物的数万个的化合物开发蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性 抑制剂，正进行随机的大量筛查。

另外，瘦素(Leptin)从脂肪细胞释放到血液，并通过血脑屏障(blood-brain barrier)后，在中枢神经系统内的受体起作用，从而抑制食物的摄入，减轻体 重，促进能源消耗。由此，有了蛋白酪氨酸磷酸酶-1b调节瘦素活性本身的 新的发现，并基于此，期待在将蛋白酪氨酸磷酸酶-1b与瘦素激动剂一起使 用时，能够表现出上升效应。(Koren,S.,BestPract.Res.Clin.Endocrinol. Metab.,21：621,2007)。

因此，在肥胖和肥胖型糖尿病的治疗开发中，蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的 抑制剂的重要性正在增加，最近有了有关通过高吞吐量的筛选(HTS，hight throughputscreening)发现的先导化合物的报道。到目前为止，有关蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b的研究和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂的开发没有临床上成功 的例子，但是，如表3所示，有很多研究团体和企业在关注和进行开发。

表3

开发中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂

资料：Pharmaproject，2002

然而，由于大部分的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂被开发成以带正电荷 的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的活性部位为目标的非水解性磷酸酪氨酸类似物， 因而，降低了选择性和生物学的利用可能性(Liu,S.etal.,J.Am.Chem.Soc., 130：17075,2008)。

因此，为了开发有效治疗糖尿病和肥胖症的药物，本发明人经过锐意研 究，确认了：作为从南极地衣类的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum) 提取物分离的罗巴酸(Lobaricacid)的盐的罗巴酸钠(SodiumLobarate)，能 够溶解于水，便于使用，而且，除了这些罗巴酸钠(SodiumLobarate)之外， 新合成的罗巴林(,Lobarin)和罗巴斯汀(,Lobarstin)与罗巴酸 相比，能够更有效地抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b，并在蛋白酪氨酸去磷酸化酶 族中只对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在向疾病模型动物给药时， 表现出抗糖尿病效果，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组 合物和功能性食品，所述药物组合物和功能性食品作为有效成分含有由从高 山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合 物。

本发明的目的在于，提供一种预防或治疗糖尿病或肥胖症的方法，该方 法包括给予由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合 物合成的新型化合物的步骤。

本发明的目的在于，提供一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(proteintyrosine phosphatase-1b)活性的方法，其包括给予由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的步骤。

本发明的目的在于，提供由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum) 提取物分离的化合物合成的新型化合物在预防或治疗糖尿病或肥胖症中的 用途。

为了达成上述目的，本发明提供一种由下述化学式1表示的化合物，

化学式1

其中，上述R₁和R₂选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基 所组成的组中。

本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作 为有效成分含有由上述化学式1表示的化合物。

本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的食品，其作为有效 成分含有由上述化学式1表示的化合物。

本发明还提供一种由下述化学式2表示的化合物，

化学式2

分子式：C₂₅H₂₇NaO₈

分子量：478.47

本发明还提供一种由上述化学式2表示的化合物的制备方法，包括：

步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)；

步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH₃CN)水溶液洗脱在步骤(a) 中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物；

步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH₃CN)或甲醇水溶液洗 脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及

步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加NaHCO₃、 Na₂CO₃或NaH₂PO₄并进行搅拌，从而获得由上述化学式2表示的化合物。

本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作 为有效成分含有由上述化学式2表示的化合物。

本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的食品，其作为有效 成分含有由上述化学式2表示的化合物。

本发明还提供一种由下述化学式3表示的化合物，

化学式3

其中，上述R₁和R₂选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基 所组成的组中。

本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作 为有效成分含有由上述化学式3表示的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的食品，其作为有效 成分含有由上述化学式3表示的化合物。

本发明还提供一种由下述化学式4表示的化合物，

化学式4

分子式：C₂₅H₃₀O₉

分子量：474.5

本发明还提供一种由上述化学式4表示的化合物的制备方法，包括：

步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)；

步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH₃CN)水溶液洗脱在步骤(a) 中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物；

步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH₃CN)或甲醇水溶液洗 脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及

步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加碱并进行搅拌， 然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由上述化学式4表示的化合物。

本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作 为有效成分含有由上述化学式4表示的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作 为有效成分含有由上述化学式4表示的化合物。

本发明还提供一种由下述化学式5表示的化合物，

化学式5

其中，上述R₁和R₂选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基 所组成的组中。

本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作 为有效成分含有由上述化学式5表示的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作 为有效成分含有由上述化学式5表示的化合物。

本发明还提供一种由下述化学式6表示的化合物，

化学式6

分子式：C₂₅H₂₈O₈

分子量：456.49

本发明还提供一种由上述化学式6表示的化合物的制备方法，包括：

步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)；

步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH₃CN)水溶液洗脱在步骤(a) 中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物；

步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH₃CN)或甲醇水溶液洗 脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及

步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加水和碱并进行 搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由上述化学式6表示的化合 物。

本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作 为有效成分含有由上述化学式6表示的化合物或其在药学上可接受的盐。

本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作 为有效成分含有由上述化学式6表示的化合物。

本发明还提供一种预防或治疗糖尿病或肥胖症的方法，其包括：给予由 从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成的新型 化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6 表示的化合物的步骤。

本发明还提供由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离 的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、 化学式5或化学式6表示的化合物的在预防或治疗糖尿病或肥胖症中的用 途。

本发明还提供一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的方法，其利用由从 高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成的新型化 合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表 示的化合物。

本发明还提供一种用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的组合物，其含 有由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成的 新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学 式6表示的化合物。

通过下面的详细说明和附加的权利要求书，更明确本发明的其它特征和 实例。

附图说明

图1表示根据HPLC(高效液相色谱法)的罗巴酸钠(SodiumLobarate) 的纯度。

图2表示罗巴酸钠的¹H核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d₆)。

图3表示罗巴酸钠的¹³C核磁共振光谱(100MHz,DMSO-d₆)。

图4表示罗巴酸钠的HSQC(异核单量子关系)数据(400MHz, DMSO-d₆)。

图5表示罗巴酸钠的HMBC(异核多键相关)数据(400MHz,DMSO-d₆)。

图6是表示罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性的曲线图。

图7是通过在620nm测定吸光度来显示对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、 PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7和PTPN13的抑制活性的图表。

图8是测定罗巴酸钠的腹腔给药后的血糖变化的曲线图。

图9是表示罗巴酸钠的腹腔给药并禁食6小时后的血糖的测定结果的曲 线图。

图10是测定罗巴酸钠的腹腔给药28天后的血糖变化的曲线图。

图11表示根据HPLC分析的罗巴林(Lobarin)纯度。

图12表示罗巴林(Lobarin)的HRESIMS(高分辨率电喷雾电离质谱) 分析结果。

图13表示罗巴林(Lobarin)的¹H核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d₆)。

图14表示罗巴林(Lobarin)的¹³C核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d₆)。

图15表示罗巴林(Lobarin)的HSQC数据(400MHz,DMSO-d₆)。

图16表示罗巴林(Lobarin)的HMBC数据(400MHz,DMSO-d₆)。

图17是表示罗巴林(Lobarin)的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性的曲线 图。

图18是通过在620nm测定吸光度来显示罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7及PTPN13的抑制活性的图 表。

图19是测定罗巴林(Lobarin)的腹腔给药后的血糖变化的曲线图。

图20是表示罗巴林(Lobarin)的腹腔给药并禁食6小时后的血糖测定 结果的曲线图。

图21是测定罗巴林(Lobarin)的腹腔给药28天后的血糖变化的曲线图。

图22表示根据HPLC分析的罗巴斯汀(Lobarstin)的纯度。

图23表示罗巴斯汀(Lobarstin)的HRESIMS分析结果。

图24表示罗巴斯汀(Lobarstin)的¹H核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d₆)。

图25表示罗巴斯汀(Lobarstin)的¹³C核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d₆)。

图26表示罗巴斯汀(Lobarstin)的COSY(二维核磁共振相关)数据 (400MHz,DMSO-d₆)。

图27表示罗巴斯汀(Lobarstin)的HSQC数据(400MHz,DMSO-d₆)。

图28表示罗巴斯汀(Lobarstin)的HMBC数据(400MHz,DMSO-d₆)。

图29表示罗巴斯汀(Lobarstin)的NOESY数据(400MHz,DMSO-d₆)。

图30是表示罗巴斯汀(Lobarstin)的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性的曲 线图。

图31是通过在620nm测定吸光度来显示罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7及PTPN13的抑制活性的图 表。

图32是测定罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药后的血糖变化的曲线图。

图33是罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药并禁食6小时后的血糖的测定结 果的曲线图。

图34是验证罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药28天后的葡萄糖耐量的曲 线图。

具体实施方式

在没有其它方式的定义的情况下，本说明书中使用的所有技术用语和科 学术语与本领域技术人员的通常理解具有相同的意义。通常，本说明书中使 用的命名法是在本技术领域已知且通常使用的命名法。

在本发明中，由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)的提取物分 离的罗巴酸，获得了作为罗巴酸的盐的、以下述化学式2表示的罗巴酸钠 (SodiumLobarate)，

化学式2

分子式：C₂₅H₂₇NaO₈

分子量：478.47

优选通过包括以下步骤的方法来制备由上述化学式2表示的罗巴酸钠：

步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)；

步骤(b)，利用柱色谱，并利用甲醇或乙腈(CH₃CN)水溶液洗脱在步骤(a) 中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物；

步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并利用乙腈(CH₃CN)或甲醇水溶液洗 脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及

步骤(d)，将含有上述罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加NaHCO₃、 Na₂CO₃或NaH₂PO₄并进行搅拌，从而获得由上述化学式2表示的化合物。

此时，优选地，在上述步骤(d)中，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于丙 酮后，添加NaHCO₃、Na₂CO₃或NaH₂PO₄并搅拌，然后，对添加NaHCO₃、 Na₂CO₃或NaH₂PO₄的同时生成的固体进行过滤后加以浓缩，获得由上述化 学式2表示的化合物。

在本发明的一实施方式中，地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)(Hedw.)G.L.Sm.)是于2003年1月从南极乔治王岛的世宗王站(S62 °13.3',W58°47.0')周围的巴顿半岛(BartonPeninsular)上采集而使用。罗巴 酸是通过下述方法进行分离：用甲醇经24小时提取干燥的高山珊瑚枝地衣 (Stereocaulonalpinum)后，蒸发溶剂，获得提取物，将该提取物装入填充 有硅胶(C₁₈)的闪式柱色谱(flashcolumnchromatography,5×25㎝)，并按顺序 注入10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％(v/v) 的甲醇(MeOH)，获得各自的分馏物后，从上述分馏物中选择对蛋白酪氨酸 磷酸酶-1b抑制活性出色的分馏物，从而作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性 出色的化合物，分离了由下述化学式7表示的罗巴酸(Lobaricacid)，

化学式7

分子式：C₂₅H₂₈O₈

分子量：456.49

用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)后，利用柱色谱， 并利用甲醇水溶液洗脱所获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提 取物，然后，对所得到的分馏物，利用反相高效液相色谱并通过乙腈(CH₃CN) 水溶液进行洗脱，由此能够获得罗巴酸。将所获得的罗巴酸溶解于丙酮后， 添加NaHCO₃、Na₂CO₃或NaH₂PO₄并进行搅拌，对添加NaHCO₃、Na₂CO₃或NaH₂PO₄的同时生成的固体进行过滤，然后，立即用旋转蒸发器使其完全 浓缩，从而获得由下述化学式2表示的罗巴酸钠，

化学式2

分子式：C₂₅H₂₇NaO₈

分子量：478.47

迄今为止，没有有关上述罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性 的报告，更没有其对糖尿和肥胖的治疗效果的报告。

另外，在上述化学式2的罗巴酸钠中部分烷基获得改性的其它衍生物也 属于本发明的范围。基于这种观点，本发明涉及化学式1的化合物，

化学式1

其中，上述R₁和R₂选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基 所组成的组中。

例如，上述烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基的碳原子数可以为1～20， 或者可以为1～10，上述烷基包括取代或未取代的烷基、环烷基等。

通过本领域已知的化合物的合成方法和改性方法，从上述化学式2的罗 巴酸钠获得化学式1的化合物是对本领域技术人员来说是显而易见的。例如， 化学式1的化合物的R可以通过碳原子的个数和结合结构的变化来获得多种 衍生物。例如，当R₁和R₂为丙基链(propylchain)的情况下，是从与戊酸钠 (sodiumpentanoate)的反应衍生的，可以利用与该戊酸钠碳原子数不同的丁酸 钠(sodiumbutyrate)、丙酸钠(sodiumpropionate)、己酸钠(sodiumhexanoate) 等来合成碳原子数不同的衍生物。

在本发明中，确认了：从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)的提 取物分离的罗巴酸盐即罗巴酸钠，与罗巴酸相比具有更优秀的抑制蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b活性的功能，从而对预防或治疗糖尿病或肥胖症有效。因此， 在另一方面，本发明涉及作为有效成分含罗巴酸钠的用于预防或治疗糖尿病 或肥胖症的药物组合物。而且，本发明可以提供一种功能性食品，其作为有 效成分包含罗巴酸钠。因此，在另一方面，本发明涉及用于预防或改善糖尿 病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分包含罗巴酸钠。

另外，不仅是由上述化学式2表示的罗巴酸钠，如下所述的部分烷基得 以改性的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐也会发挥相同或类似的效 果，因此，本发明还可以提供包含这些的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的 药物组合物和功能性食品。

在本发明的一实施方式中，比较分析了罗巴酸钠和罗巴酸的对蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b的抑制活性程度，其结果，罗巴酸的IC₅₀为870nM，与此相对， 罗巴酸钠的IC₅₀为350nM，显示出非常出色的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制效 果，由此，确认了罗巴酸钠是能够对糖尿病和肥胖症进行医学治疗和预防的 化合物。

而且，在本发明的一实施例中，调查了罗巴酸钠对蛋白酪氨酸去磷酸化 酶族的选择性，其结果，确认了在包括TC-PTP(PTPN2)的蛋白酪氨酸去磷 酸化酶族中，仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在此，所述TC-PTP 在氨基酸序列和3D结构上与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似，具有胚胎致死 性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，并且已知包括第二芳基 磷酸盐结合位点在内的活性部位(activesite)相类似。这样的实验结果表明， 本发明的化合物即罗巴酸钠能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂而用于 糖尿病的治疗中。

在本发明的其它实施例中，通过向作为疾病模型动物的db/db小鼠给药 罗巴酸钠，并测量血液中的葡萄糖浓度、血液中的胰岛素浓度的变化，确认 了罗巴酸钠与血糖和胰岛素抵抗性的关系，从而验证了抗糖尿病效果。

另外，在本发明中，由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)的提 取物分离的罗巴酸，分离出以下述化学式4表示的新型化合物，并将其命名 为罗巴林(、Lobarin)，

化学式4

分子式：C₂₅H₃₀O₉

分子量：474.5

优选地，通过包括下述步骤的方法来制备上述由化学式4表示的新型化 合物罗巴林(Lobarin)：

步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)；

步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH₃CN)水溶液洗脱在步骤(a) 中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物；

步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH₃CN)或甲醇水溶液洗 脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及

步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后,添加碱并进行搅拌， 然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由上述化学式4表示的化合物。

此时，在上述步骤(d)中，酸性溶液可以使用能够中和水溶液的所有种类 的酸性溶液，优选地，上述步骤(d)中，溶剂为丙酮，碱为NaOH或KOH， 酸性溶液为HCl溶液、H₂SO₄溶液或HNO₃溶液。浓缩上述步骤(d)的反应结 束后的反应液，然后，通过二氯甲烷、氯仿或氯乙烯、和水溶液之间的分配 来获得二氯甲烷、氯仿或氯乙烯溶解层，并进行浓缩，由此获得由上述化学 式4表示的化合物。

在本发明的一实施方式中，将罗巴酸溶解于丙酮后，添加NaOH，并在 常温下进行搅拌，然后，添加HCl溶液而结束反应，浓缩反应混合物后，通 过二氯甲烷(Methylenechloride)和水溶液(pH＝2)之间的分配来获得二氯甲烷 溶解层，由此获得下述化学式4的罗巴林(Lobarin)，

化学式4

分子式：C₂₅H₃₀O₉

分子量：474.5

另外，上述化学式4的罗巴林(Lobarin)的部分烷基得以改性的其它衍 生物也属于本发明的范围，基于该观点，本发明涉及由化学式3表示的化合 物，

化学式3

其中，上述R₁和R₂选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基 所组成的组中。

例如，上述烷基、芳基、芳烷基和酰基的碳原子数可以为1～20，或者可 以为1～10，上述烷基包括取代或未取代的烷基、环烷基等。

通过本领域已知的化合物的合成方法及改性方法,从上述化学式4的罗 巴林(Lobarin)获得化学式3的化合物是对本领域技术人员来说是显而易见 的。例如，通过碳原子的个数和结合结构的变化，化学式3的化合物的R可 以获得多种衍生物。例如，在R₁和R₂为丙基链的情况下，是从与戊酸钠的 反应衍生的，可以利用与该戊酸钠碳原子数不同的丁酸钠、丙酸钠和己酸钠 等来合成碳原子数不同的衍生物。

本发明确认了从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)的提取物分离 的罗巴酸的新型衍生物即罗巴林(Lobarin)具有出色的抑制蛋白酪氨酸磷酸 酶-1b活性的功能，从而对预防或治疗糖尿病或肥胖症有效。因此，在另一 方面，本发明涉及用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有 效成分含有上述化学式4的罗巴林(Lobarin)或其药学上可接受的盐。而且， 本发明可以提供一种功能性食品，其作为有效成分包含罗巴林(Lobarin)。 因此，在另一方面，本发明涉及用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食 品，其作为有效成分包含罗巴林(Lobarin)。

另外，不仅是上述化学式4的罗巴林(Lobarin)，如下所述的部分烷基 被改性的化学式3的化合物或其药学上可接受的盐也能够发挥相同或类似的 效果，因此，本发明可提供包含这些的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药 物组合物、功能性食品。

在本发明的一实施例中，测定了罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶 -1b的抑制活性程度，其结果为IC₅₀＝149nM，显示出非常出色的蛋白酪氨酸 磷酸酶-1b抑制效果，由此确认了新型化合物罗巴林(Lobarin)是能够对糖 尿病和肥胖症进行医学的治疗和预防的化合物。

而且，在本发明的一实施例中，调查了罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸 去磷酸化酶族的选择性，其结果，确认了在包括TC-PTP(PTPN2)的蛋白酪 氨酸去磷酸化酶族中，仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在此， 所述TC-PTP(PTPN2)在氨基酸序列和3D结构上与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最 类似，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，并 且已知包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(activesite)相类似。这 样的实验结果表明，本发明的化合物罗巴林(Lobarin)能够作为蛋白酪氨酸 磷酸酶-1b的抑制剂用于糖尿病的治疗中。

在本发明的其它实施例中，通过向作为疾病模型动物的db/db小鼠给药 罗巴林(Lobarin)，并测量血液中的葡萄糖浓度和血液中的胰岛素浓度的变 化，确认了罗巴林(Lobarin)与胰岛素抵抗性的关系，从而验证了抗糖尿病 效果。

另外，本发明的上述化学式4的罗巴林(Lobarin)可以是药学上可接收 的盐的形态。本发明的药学上可接受的盐能够根据本技术领域的通常的方法 来制备，例如，可与如盐酸、溴化氢、硫酸、硫酸氢钠、磷酸和碳酸等形成 无机酸的盐，或者，与如甲酸、醋酸、草酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、葡 糖酸、龙胆酸、富马酸、乳糖酸、水杨酸或乙酰水杨酸(阿司匹林)等有机酸 共同形成药学上可接受的酸的盐；或者与如钠、钾等的碱金属离子进行反应， 形成它们的金属盐；或者与铵离子进行反应，从而形成另一形态的药学上可 接受的盐。

另外，在本发明中，由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)的提 取物分离的罗巴酸，分离出以下述化学式6表示的新型化合物，并将此命名 为罗巴斯汀(、Lobarstin)，

化学式6

分子式：C₂₅H₂₈O₈

分子量：456.49

优选地，通过包括以下步骤的方法来制备上述由化学式6表示的新型化 合物罗巴斯汀(Lobarstin)：

步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)；

步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH₃CN)水溶液洗脱在步骤(a) 中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物；

步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH₃CN)或甲醇水溶液洗 脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及

步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加水和碱并进行 搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应后，获得由下述化学式6表示的化合物。

此时，上述步骤(d)的酸性溶液可以使用能够中和水溶液的所有种类的酸 性溶液，优选地，在上述步骤(d)中，溶剂为丙酮，碱为NaOH或KOH，酸 性溶液为HCl溶液、H₂SO₄溶液或HNO₃溶液。浓缩上述步骤(d)的反应结束 后的反应液，然后，通过二氯甲烷、氯仿或氯乙烯、和水溶液之间的分配来 获得二氯甲烷、氯仿或氯乙烯溶解层，并进行浓缩，获得由下述化学式6表 示的化合物。

在本发明的一实施方式中，将罗巴酸溶解于丙酮后，添加NaOH，并在 常温下搅拌，然后，添加HCl溶液结束反应，浓缩反应混合物后，通过二氯 甲烷和水溶液(pH＝2)之间的分配来获得二氯甲烷溶解层，由此可获得下述化 学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)，

化学式6

分子式：C₂₅H₂₈O₈

分子量：456.49

另外，由上述化学式6表示的罗巴斯汀(Lobarstin)的部分烷基得以改性 的其它衍生物也属于本发明的范围，基于该观点，本发明涉及化学式5的化 合物，

化学式5

其中，上述R₁和R₂选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基 所组成的组中。

例如，上述烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基的碳原子数可以为1～20， 或者可以为1～10，上述烷基包括取代或未取代的烷基和环烷基等。

通过本领域已知的化合物的合成方法和改性方法，从上述化学式6的罗 巴斯汀(Lobarstin)获得化学式5的化合物对本技术领域技术人员来说是显而 易见的。例如，化学式5的化合物的R可以通过碳原子的个数和结合结构的 变化来获得多种衍生物。例如，在R₁及R₂为丙基链的情况下，是从与戊酸 钠的反应衍生的，可以利用与该戊酸钠碳原子数不同的丁酸钠、丙酸钠、己 酸钠等来合成碳原子数不同的衍生物。

本发明确认了从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)的提取物分离 的罗巴酸的新型衍生物即罗巴斯汀(Lobarstin)具有非常出色的抑制蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b活性的功能，从而对预防或治疗糖尿病或肥胖症有效。因此， 在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合 物，其作为有效成分含有上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)或其药学上可 接受的盐。而且，本发明可以提供作为有效成分含有罗巴斯汀(Lobarstin)的 功能性食品。即，本发明涉及用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品， 其作为有效成分包含罗巴斯汀(Lobarstin)。

另外，不仅是上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)，如下所述的部分烷 基被改性的化学式5的化合物或其药学上可接受的盐也发挥相同或类似的效 果，因此，可以提供包含它们的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合 物和功能性食品。

本发明的一实施例中，测量了罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶 -1b的抑制活性程度，结果为IC₅₀＝154.6nM，显示出非常出色的蛋白酪氨酸 磷酸酶-1b抑制效果，由此确认了新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)是能够对糖 尿病进行医学的治疗或预防的化合物。

而且，本发明的一实施例中，调查了罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸 去磷酸化酶族的选择性，其结果，确认了在包括TC-PTP(PTPN2)的蛋白酪 氨酸去磷酸化酶族中，仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在此， 所述TC-PTP(PTPN2)在氨基酸序列和3D结构上与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最 类似，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，并 且已知包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(activesite)相类似。这 样的实验结果表面，本发明的化合物罗巴斯汀(Lobarstin)能够作为蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b的抑制剂用于糖尿病的治疗中。

在本发明的其它实施例中，通过向疾病模型动物db/db小鼠给药罗巴斯 汀(Lobarstin)，并测量血液中的葡萄糖浓度和血液中的胰岛素浓度的变化来 确认了与血糖、胰岛素抵抗性的关系，从而验证了抗糖尿病效果。

另外，本发明的上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)可以是药学上可接 受的盐的形态。本发明的药学上可接受的盐能够根据本技术领域的通常的方 法来制备，例如，可与如盐酸、溴化氢、硫酸、硫酸氢钠、磷酸、碳酸等的 无机酸形成盐，或者与如甲酸、醋酸、草酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、葡 糖酸、龙胆酸、富马酸、乳糖酸、水杨酸或乙酰水杨酸(阿司匹林)等的有机 酸共同形成药学上可接受酸的盐；或者与如钠、钾等的碱金属离子进行反应， 形成它们的金属盐；或者与铵离子进行反应，形成另一形态的药学上可接受 的盐。

根据常规的方法，包含本发明化合物的药物组合物可以制成粉末剂、颗 粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆、喷雾剂等口服制剂、外用剂、 栓剂和无菌注射液的形态。作为包含本发明化合物的组合物可具有的载体、 赋形剂和稀释剂，可举出乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖 醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、 纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸 酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

在制成制剂时，使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 表面活性剂等稀释剂或赋形剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、 粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体剂型通过在上述化合物中混合至少一 种以上的赋形剂来配制，如淀粉、碳酸钙(calciumcarbonate)、蔗糖(sucrose) 或乳糖(lactose)、明胶等。除了单纯的赋形剂外，还使用如硬脂酸镁、滑石 等的润滑剂。用于口服给药的液体制剂有悬浮液、內用液剂、乳剂、糖浆剂 等，除了包括通常使用的单纯稀释剂，例如，水、液体石蜡等以外，还可以 包括多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外 给药的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳剂、冻干剂、栓剂等。 非水性溶剂、悬浮液可以使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、如橄榄 油等的植物油、如油酸乙酯等的可注射的酯等。作为栓剂的基质可以使用 witepsol(，药用辅料，是饱和脂肪酸混合物的甘油酯，有H、W、S、 E的4种类型)、聚乙二醇、吐温(tween)60、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明 胶等。

作为本发明的功能性食品，例如可举出各种食品类、糖果、巧克力、饮 料、口香糖、茶、复合维生素、健康辅助食品类等，可以作为粉末、颗粒、 片剂、胶囊或饮料的形式来使用。

本发明的化合物可以加入到食品或饮料中，以预防糖尿病和肥胖症。此 时，对于食品或饮料中的上述化合物含量而言，当为本发明的保健功能食品 组合物的情况下，通常是食品总重量的0.01重量％～50重量％，优选为0.1 重量％～20重量％；当为保健饮料组合物的情况下，相对于100ml保健饮料 组合物添加0.02g～10g，优选为0.3g～1g。

对本发明的保健饮料组合物而言，除了作为必要成分按规定比率包含本 发明化合物以外，对其它液体组分没有特别的限制，与常用的饮料相同地， 还可以包含多种香味剂或天然碳水化合物。作为天然碳水化合物，例如可举 出葡萄糖、果糖等的单糖；麦芽糖、蔗糖等的二糖；糊精、环糊精等的多糖 等常用的糖，以及例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓醇等的糖醇。作为香味剂， 可以有利地使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘 草甜素等)以及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。相对于100ml的本发明的组 合物，上述天然碳水化合物的比率通常是约1g～20g，优选为约5g～12g。除 上述之外，本发明的功能性食品可以包含多种营养素、维生素、矿物质(电解 质)、合成香精和天然香精等香精、着色剂和改进剂(奶酪、巧克力等)、果胶 酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、 防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化试剂等。此外，本发明的功 能性食品可以包括用于制备天然果汁饮料、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这 些成分可以单独使用或组合使用。在本发明的组合物中，虽然这些添加剂的 比率不是特别重要，但通常相对于100重量份的本发明的组合物包含0重量 份至约20重量份。

在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗糖尿病或肥胖症的方法，其包 括将由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成 的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化 学式6表示的化合物进行给药的步骤。

作为本发明的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、 化学式5或化学式6表示的化合物的优选的给药量，是根据患者的状态和体 重、疾病的程度、药物形态、给药途径以及给药时间而不同，本领域技术人 员可进行适当的选择。但是，为了理想的效果，本发明化合物的每日给药量 为0.1μg/kg～1000μg/kg，优选为1μg/kg～100μg/kg。给药可以是一天一次， 也可以是分几次口服给药，上述的给药量不以任何方式限制本发明。

在另一方面，本发明涉及由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum) 提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、 化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物在预防或治疗糖尿病或肥胖症 中的用途。

本发明的由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化 合物合成的罗巴酸钠、罗巴林(Lobarin)和罗巴斯汀(Lobarstin)，显示出了 优秀的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的效果，因此，利用这些，本发明提 供一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的方法。具体地，本发明涉及一种抑 制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的方法，其包括向所需对象给予新型化合物即 由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化 合物的步骤。

本发明涉及一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的组合物，其包含由从 高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物分离的化合物合成的新型化 合物即以化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表 示的化合物。

实施例

下面，通过实施例来详细说明本发明。这些实施例只是用于例示本发明， 本发明的范围并不限定于这些实施例，这对本领域技术人员来说是显而易见 的。

实施例1

从地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物制备罗巴酸 (Lobaricacid)

1-1：制备地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物

地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)(Hedw.)G.L.Sm.)是于 2003年1月从南极乔治王岛的世宗王站(S62°13.3',W58°47.0')周围的巴顿 半岛采集，是在巴顿半岛容易采集到的地衣类。

将50g干燥的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)用1L甲醇经24 小时提取2次，获得3.6g甲醇提取物。将上述所获得的提取物装入填充有 硅胶(C₁₈)的闪式柱色谱(flashcolumnchromatography，5×25cm)，并以阶段式 的浓度梯度添加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和 100％(v/v)的甲醇(MeOH)，分别获得各分馏物。

1-2：从地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulonalpinum)提取物制备罗巴 酸

将在实施例1-1中用80％甲醇洗脱而获得的204.6mg分馏物再装入到填 充有硅胶(C₁₈)的闪式柱色谱(2.5×30cm)，并分别注入200ml的1％、2％、3％、 4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的甲醇(在CH₂Cl₂中)溶液及100％(v/v) 甲醇，以获得基于TLC分析的8个主要分馏物。

将用9％甲醇洗脱的59mg分馏物再注入到半制备反相(semi-preparative reverse-phase)HPLC后，以75％至83％的浓度梯度添加含0.1％甲酸(formic acid)的乙腈(CH₃CN)水溶液，并洗脱30分钟以上，从而分离了化学式7表示 的罗巴酸(22.9mg；t_R＝39分钟)，

化学式7

分子式：C₂₅H₂₈O₈

分子量：456.49

实施例2

合成罗巴酸钠(sodiumlobarate)

2-1：从罗巴酸制备罗巴酸钠

将从实施例1-2获得的10mg(22umol)罗巴酸溶解在3ml丙酮(Acetone) 中，向其添加50ul的1MNaHCO₃后搅拌1-2分钟。对添加NaHCO₃的同时 生成的固体进行过滤，然后立即用旋转蒸发器进行完全浓缩。浓缩结束后， 得到了白色固体状的罗巴酸钠(<10mg)。然后，为了除去多余的盐以提高纯 度，使用安捷伦(Agilent)EclipseXDB-C18柱(4.6×150mm，美国)，通过 反相(reversephase)HPLC进行了分析。分析中的溶剂体系采用了含0.1％甲酸 的水(A线)和含0.1％甲酸的乙腈(B线)。分析条件如下：开始是40％乙腈至 50％乙腈为5分钟，50％乙腈至80％乙腈为15分钟，80％乙腈至90％乙腈为 10分钟。最后纯度为92.1％(图1)。所获得的罗巴酸钠100％溶解于水，确保 了水溶性，

化学式2

分子式：C₂₅H₂₇NaO₈

分子量：478.47

2-2：罗巴酸钠的结构分析

通过将化合物核磁共振数据与罗巴酸的核磁共振数据进行比较来确认 了罗巴酸钠的结构。将每个试样溶解在DMSO-d₆溶剂后，使用JEOLECP-400 光谱仪(JEOL，日本)，测定了各个核磁共振数据，以作为溶剂使用的DMSO-d₆的化学位移值(dC/dH＝40.0/2.50ppm)为基准表示了化学位移。在异核多量子 相干(HMQC，1H-检测的heteronuclearMultiple-QuantumCoherence)的情况 下，设定为1JCH＝140Hz后进行了测定，设定为nJCH＝8Hz后进行了异核多 键相关(HMBC，HeteronuclearMultiple-BondCoherence)实验。

化学式8

1：罗巴酸，2：罗巴酸钠

罗巴酸和罗巴酸钠的核磁共振数据如表4所示。

表4

罗巴酸和罗巴酸钠的核磁共振(NMR)数据(400MHz,DMSO-d₆)

比较的结果，特别是观察到了由于C-7'的官能团从羧酸(carboxylicacid) 变化为羧酸盐(carboxylate)阴离子而带来的化学位移的变化及其周边碳的化 学位移的变化，这是查明化合物2(罗巴酸钠)结构的重要资料。图2至图5 分别表示罗巴酸钠的¹H核磁共振光谱(400MHz，DMSO-d₆)、¹³C核磁共振光 谱(100MHz，DMSO-d₆)、HSQC数据(400MHz,DMSO-d₆)以及HMBC数据 (400MHz，DMSO-d₆)。

实施例3

分析罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性

为了分析蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1b)抑制活性，用光谱测量了酶的 活性。

即，在0.5mg/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(Bioneer公司，韩国)以及 蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH8.0,0.75mM氯化钠， 0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗巴酸钠0，1， 3，10，30，100，300，1000，3000nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(Insulin Recepter)(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟， 然后，添加孔雀绿(MalachiteGreen)-钼酸盐染料溶液(MolybdateDye Solution)(1142-1153，Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟，结束与 蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、罗巴酸钠及基质的反应后，在620nm测量了吸光度。

结果，如图6所示，罗巴酸钠的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性分 析结果为IC₅₀＝350nM，显示了出色的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制效果， 并确认了抑制率浓度依赖性地增加。

另外，作为对照组，测量了罗巴酸对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性， 并进行了比较。实验中使用的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b购自BIOMOL公司(美 国)。为了光谱测量酶的活性，添加约0.2μm/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、 蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(50mMcitrate,pH6.0,0.1M氯化钠,1mM EDTA,1mMDTT)、罗巴酸以及4mMpNPP后轻轻摇动，在37℃下反应30 分钟后，在405nm测量了吸光度。结果，确认了IC₅₀＝0.87μM，即870nM。

由此可以确认，本发明的罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制效果更 优秀，而且，这样的罗巴酸钠是能够药学治疗和预防糖尿病和肥胖症的化合 物。

实施例4

分析罗巴酸钠对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性

为了研究罗巴酸钠对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，通过光谱测量 酶的活性来研究了对PTP-1b(蛋白酪氨酸磷酸酶-1b)、PTPN2、PTPN5、 PTPN6、PTPN7和PTPN13的抑制活性。

首先，在0.5mg/ml/浓度的PTP-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7、 PTPN13(Bioneer公司，韩国)和蛋白酪氨酸去磷酸化酶缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，0.75mM氯化钠，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇,50％ 甘油)中，分别添加罗巴酸钠0,50,100,200nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体 (1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟，然后， 添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟。 结束与基质的反应后，在620nm测量了吸光度。

调查罗巴酸钠对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性的结果，如图7所示， 可以确认，罗巴酸钠对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的IC₅₀＝200uM，抑制率为 50.0％，而对TC-PTP(PTPN2)的抑制率为83.7％，TC-PTP(PTPN2)是已知的 与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似的磷酸化酶。

TC-PTP(PTPN2)是已知在氨基酸序列和3D结构中与蛋白酪氨酸磷酸酶 -1b最类似的磷酸化酶，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类 似的酶特性，而且，包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(activesite) 类似。虽然已有757个物质以蛋白酪氨酸磷酸酶-1b作为目标进行了登记， 但尚不存在以蛋白酪氨酸磷酸酶-1b作为主要目标进入临床的化合物，仅公 开了作用于包括蛋白酪氨酸磷酸酶-1b在内的多个目标的植物提取物，或正 在处于临床阶段。

显示仅对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地 起作用的上述实验结果表明，本发明的化合物即罗巴酸钠能够作为蛋白酪氨 酸磷酸酶-1b的抑制剂来用于糖尿病的治疗中。

实施例5

验证罗巴酸钠对疾病模型动物的疗效

5-1：观察腹腔给药罗巴酸钠后的血糖变化

根据对罗巴酸钠的预测试、有效性测试及毒性试验资料来决定了给药量 (表示为测试化合物(mg)/试验动物的体重(Kg))。在7周大的雄性db/db小鼠 (第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向 对照组每天腹腔给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药蛋白酪氨酸磷酸酶 -1b活性抑制化合物即罗巴酸钠10mg/kg，并每周测量两次血糖。

向7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db， 韩国生命工学研究院)腹腔给药蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性抑制化合物即罗巴 酸钠后，测定了血糖变化，结果，如图8所示，在腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg 的实验组(n＝6)中，平均第0天为267mg/dL，第3天为276mg/dL，第7天为 378mg/dL，第10天为378mg/dL，第14天为407mg/dL，第17天为415mg/dL， 第21天为459mg/dL。可以确认，血糖增加现象低于对照组。

5-2：观察腹腔给药罗巴酸钠并禁食6小时后的血糖变化

为了测定罗巴酸钠的更为准确的抗糖尿病效果，在7周大的雄性db/db 小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中， 向对照组每天腹腔给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴酸钠 10mg/kg，并每周测量两次血糖。此时，腹腔给药后禁食6小时，然后测量 了血糖。

结果，如图9所示，在腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg的实验组(n＝6)中，平 均第0天为141mg/dL，第3天为142mg/dL，第7天为185mg/dL，第10天 为206mg/dL，第14天为232mg/dL，第17天为236mg/dL，第21天为 313mg/dL。与实施例4-1相同，血糖增加现象低于对照组。

5-3：罗巴酸钠的腹腔给药28天后的葡萄糖耐量试验(IPGTT, Intraperitonealglucosetolerancetest)

为了进行罗巴酸钠在模型动物中的腹腔内葡萄糖耐量试验，进行了如下 的实验。

在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db， 韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药生理盐水共28天，并向实 验组每天腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg共28天后，在分别不给予生理盐水及 罗巴酸钠的状态下，禁食16小时后，腹腔给药葡萄糖(500mg/ml，给药量 200μl)，然后在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟及120分钟时 从尾静脉采集血样，并观察血糖变化。

向第二型糖尿病模型动物皮下给药葡萄糖后观察了葡萄糖耐量变化，结 果，如图10所示，在对照组(注射生理盐水)的情况下，给药葡萄糖后，0分 钟时为341mg/dL，15分钟时为579mg/dL，30分钟时为557mg/dL，60分钟 时为589mg/dL，90分钟时为600mg/dL，120分钟时为555mg/dL，显示出 急剧的血糖增加和缓慢的血糖降低。然而，在腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg共 28天的实验组的情况下，0分钟时为153mg/dL，15分钟时为291mg/dL，30 分钟时为361mg/dL，60分钟时为385mg/dL，90分钟时为335mg/dL，120 分钟时为290mg/dL。可以确认，通过药物浓度依赖性的缓慢的血糖增加和 快速的血糖下降来恢复血糖的正常化。

这些实施例5-1至5-3的结果表明，本发明的罗巴酸钠具有非常优秀的 抗糖尿病效果。

实施例6

从罗巴酸制备作为新型化合物罗巴林(Lobarin)

将实施例1-2的罗巴酸50mg溶解在5mL丙酮中，向其添加1mL的0.5N NaOH后，在常温下搅拌5分钟，添加0.5mL的1NHCl溶液而结束反应。 浓缩反应混合物后，通过二氯甲烷及水溶液(pH＝2)之间的分配来获得二氯甲 烷溶解层，并进行浓缩，获得了50mg由下述化学式4表示的新型化合物， 并将该化合物命名为“罗巴林(Lobarin)”，

化学式4

分子式：C₂₅H₃₀O₉

分子量：474.5

另外，为了提高纯度，使用安捷伦EclipseXDB-C₁₈柱(4.6×150mm，美 国)用反相HPLC进行了分析。分析中的溶剂体系使用了含0.1％甲酸的水(A 线)和含0.1％甲酸的乙腈(B线)。分析条件如下：开始是40％乙腈至50％乙 腈为5分钟，50％乙腈至80％乙腈为15分钟，80％乙腈至90％乙腈为10分 钟。最后纯度为96.1％(图11)。

实施例7

分析新型化合物罗巴林(Lobarin)的结构

通过高分辨率电喷雾电离质谱(HRESIMS)和核磁共振(NMR)光谱分析 来确定了实施例6合成的罗巴林(Lobarin)的分子结构。

采用Q-TOFmicroLC-MS/MS分析仪(Waters公司，美国)来进行了 HRESIMS的阴离子分析。如图12所示，罗巴林(Lobarin)表现出m/z473.1774 的分子离子峰，这表明罗巴林(Lobarin)的分子式为C₂₅H₃₀O₉。

将罗巴林(Lobarin)溶解于DMSO-d₆溶剂后，使用JEOLECP-400光谱 仪(JEOL，日本)来测量了罗巴林(Lobarin)的核磁共振谱(NMRspectra)，并 以作为溶剂使用的DMSO-d₆的化学位移值(δC/δH＝40.0/2.50ppm)为基准表示 了化学位移值。在HMQC(1H-detectedheteronuclearmultiple-quantum coherence)的情况下，设定为1JCH＝140Hz后进行了测定，设定为nJCH＝8Hz 后进行了HMBC(heteronuclearmultiple-bondcoherence)实验。使用Q-TOF microLC-MS/MS来进行了质量分析。

首先，根据¹H核磁共振和¹³C核磁共振光谱的结果，如图13和图14 所示，罗巴林(Lobarin)的¹H核磁共振和¹³C核磁共振谱显示出与罗巴酸 的核磁共振谱非常类似的形态。由此，可预测罗巴林(Lobarin)具有与罗巴 酸非常类似的结构，考虑到分子量之差为18dalton，可以推测罗巴林(Lobarin) 是通过罗巴酸的水合反应生成的化合物。比较罗巴酸的核磁共振数据和罗巴 林(Lobarin)的核磁共振数据发现，特别是在罗巴酸的¹³C核磁共振波谱(NMR spectrum)中观察到的对应于酮官能团的¹³C峰消失了，取而代之，在106.3ppm 观察到了¹³C峰值，并在¹H核磁共振中观察到了对应于OH官能团的质子的 峰(7.65ppm)。根据核磁共振数据中的这些差异，推测罗巴林(Lobarin)的 结构是：如化学式7所示，罗巴酸的酮官能团因羟基的亲核攻击而转变为氧 阴离子，由此，相邻的酯官能团中连续发生亲核加成反应而分解酯基的化合 物结构。通过追加的二维核磁共振光谱分析法即HMQC和HMBC分析，证 实了推测的罗巴林(Lobarin)结构(表5)。

通过HMQC数据(图15)和HMBC数据(图16)的分析，确认了与罗巴 林(Lobarin)的各个碳和氢相对应的峰的位置，从这些资料可知，与罗巴酸 的核磁共振测量值类似。另外，与OH官能团的质子相对应的峰(7.65ppm) 乃至与C-6、C-7和C-8位置相对应的¹³C核磁共振峰的HMBC相干性，提 供了确定所揭示的罗巴林(Lobarin)结构的重要资料。

表5

罗巴林(Lobarin)的核磁共振数据(400MHz,DMSO-d₆)

异核多键相关(HMBC，HeteronuclearMultiple-BondCoherence)分析，优 化为8Hz，从质子到指定的碳

a异核多键相关(HMBC，HeteronuclearMultiple-BondCoherence)分析， 优化为8Hz，从质子到指定的碳。

实施例8

分析罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性

为了分析罗巴林(Lobarin)对蛋白质的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性， 用光谱测量了酶的活性。

即，在0.5mg/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(Bioneer公司，韩国)、蛋 白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH8.0，0.75mM氯化钠， 0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗巴林(Lobarin) 0,1,3,10,30,100,300,1000,3000nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体 (1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟～30分钟，然后， 添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(1142-1153，Sigma公司，美国)，并在常温下反 应10分钟。结束与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、罗巴林(Lobarin)及基质的反应 后，在620nm测量了吸光度。

结果，如图17所示，罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制 活性分析结果为IC₅₀＝149nM，显示了出色的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制 效果，确认了抑制率浓度依赖性地增加，从而确认了罗巴林(Lobarin)是能 够药学治疗和预防糖尿病和肥胖症的化合物。

实施例9

分析罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性

为了研究罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性，通过光谱 测量酶的活性来研究了对PTP-1b(蛋白酪氨酸磷酸酶-1b)、PTPN2、PTPN5、 PTPN6、PTPN7和PTPN13的抑制活性。

首先，在0.5mg/ml浓度的PTP-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7、 PTPN13(Bioneer公司，韩国)和蛋白酪氨酸去磷酸化酶缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，0.75mM氯化钠，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇， 50％甘油)中，分别添加罗巴林(Lobarin)0,50,100,200nM和基质[pTyr1146] 胰岛素受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30 分钟，然后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(Sigma公司，美国)，并在常温下 反应10分钟，结束与基质的反应后，在620nm测量了吸光度。

调查了罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性的结果， 如图18所示，在IC₅₀200nM时，罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b 的抑制率为52.2％，特别是，对包括TC-PTP(PTPN2)的其它蛋白酪氨酸磷酸 酶没有抑制活性。

显示出在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中只对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性 地起作用的上述实验结果表明，本发明的化合物罗巴林(Lobarin)能够作为 蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂来用于糖尿病的治疗中。

实施例10

验证罗巴林(Lobarin)对疾病模型动物的疗效

10-1：腹腔给药罗巴林(Lobarin)后观察血糖变化

根据对罗巴林(Lobarin)的预测试、有效性测试、毒性试验资料为基础， 决定了给药量(用测试化合物(mg)/试验动物的体重(Kg)表示)。在7周大的 雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学 研究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴 林(Lobarin)10mg/kg，并每周测量两次血糖。

向7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db， 韩国生命工学研究院)腹腔给药罗巴林(Lobarin)后，观察了血糖变化，结 果，如图19所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为268mg/dL，第3天为 381mg/dL，第7天为404mg/dL，第10天为432mg/dL，第14天为454mg/dL， 第17天为479mg/dL，第21天为482mg/dL，显示出急剧的血糖增加现象。 然而，在腹腔给药10mg/kg罗巴林(Lobarin)的实验组(n＝6)中，平均第0 天为267mg/dL，第3天为278mg/dL，第7天为298mg/dL，第10天为 315mg/dL，第14天为352mg/dL，第17天为379mg/dL，第21天为425mg/dL， 由此可以确认，显示出低于对照组的血糖增加。

10-2：观察腹腔给药罗巴林(Lobarin)并禁食6小时后的血糖变化

为了测量罗巴林(Lobarin)的更为准确的抗糖尿病效果，在7周大的雄 性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研 究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴林 (Lobarin)10mg/kg，并每周测量两次血糖。此时，腹腔给药后禁食6小时， 然后测量了血糖。

结果，如图20所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为151mg/dL，第3 天为199mg/dL，第7天为262mg/dL，第10天为291mg/dL，第14天为397 mg/dL，第17天为455mg/dL，第21天为483mg/dL，显示出急剧的血糖增 加。然而在腹腔给药罗巴林(Lobarin)10mg/kg的实验组(n＝6)中，平均第0 天为152mg/dL，第3天为141mg/dL，第7天为155mg/dL，第10天为 198mg/dL，第14天为261mg/dL，第17天为287mg/dL，第21天为340mg/dL， 与实施例10-1相同，显示出低于对照组的血糖增加。

10-3：腹腔给药罗巴林(Lobarin)28天后的葡萄糖耐量试验

为了实施罗巴林(Lobarin)在模型动物中的腹腔葡萄糖耐量试验，进行 了如下的实验。

在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db， 韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药20％DMSO共28天，并向 实验组每天腹腔给药罗巴林(Lobarin)10mg/kg共28天后，在分别不给药 20％DMSO和罗巴林(Lobarin)的状态下，禁食16小时，然后，以腹腔给 药的方式注入葡萄糖(500mg/ml，给药量200μl)，然后在0分钟、15分钟、 30分钟、60分钟、90分钟、120分钟时从尾静脉采集血样，并观察了该血 样的血糖变化。

向第二型糖尿病模型动物皮下给药葡萄糖后观察了葡萄糖耐量变化，结 果，如图21所示，在对照组(腹腔给药20％DMSO)的情况下，给药葡萄糖后 的0分钟时为293mg/dL，15分钟时为429mg/dL，30分钟时为557mg/dL， 60分钟时为553mg/dL，90分钟时为539mg/dL，120分钟时为568mg/dL， 显示出急剧的血糖增加倾向及非常缓慢的血糖降低现象。相反，在给药作为 抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的化合物的罗巴林(Lobarin)10mg/kg的实 验组的情况下，0分钟时为153mg/dL，15分钟时为358mg/dL，30分钟时为 436mg/dL，60分钟时为390mg/dL，90分钟时为335mg/dL，120分钟时为 290mg/dL。可以确认，通过药物浓度依赖性的缓慢的血糖增加和快速的血糖 下降来恢复血糖的正常化。

这些实施例10-1至10-3的结果表明，本发明的新型化合物罗巴林 (Lobarin)具有非常优秀的抗糖尿病效果。

实施例11

从罗巴酸制备新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)

将实施例1-2的50mg罗巴酸溶解在50mL的丙酮中后，向其加入50mL 水，并进行搅拌。添加0.25mL的2NNaOH后，在常温下搅拌15分钟，添 加0.5mL的1NHCl溶液而结束反应。浓缩反应混合物后，通过氯甲烷及水 溶液(pH＝2)之间的分配来获得氯甲烷溶解层，并进行浓缩，获得50mg由下 述化学式6表示的新型化合物，并将该化合物命名为“罗巴斯汀(Lobarstin)”。

化学式6

分子式：C₂₅H₂₈O₈

分子量：456.49

另外，为了提高纯度，使用安捷伦EclipseXDB-C₁₈柱(4.6x150mm，美 国)，用反相HPLC进行了分析。分析中的溶剂体系使用了含0.1％甲酸的水 (A线)和含0.1％甲酸的乙腈(B线)。分析条件如下：开始是40％乙腈至50％ 乙腈为5分钟，50％乙腈至80％乙腈为15分钟，80％乙腈至90％乙腈为10 分钟。最后纯度为97.6％(图22)。

实施例12

分析新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)的结构

通过高分辨率电喷雾电离质谱(HRESIMS)和核磁共振(NMR)光谱分析 来确定在实施例11中合成的罗巴斯汀(Lobarstin)的分子结构。采用Q-TOF microLC-MS/MS分析仪(Waters公司，美国)来进行了高分辨率电喷雾电离质 谱的阴离子分析。如图12所示，罗巴斯汀(Lobarstin)表现出m/z455.1708的 分子离子峰，这表明罗巴斯汀(Lobarstin)的分子式为C₂₅H₂₈O₈。

将罗巴斯汀(Lobarstin)溶解于DMSO-d₆溶剂后，使用JEOLECP-400光 谱仪(JEOL，日本)来测量了罗巴斯汀(Lobarstin)的核磁共振谱，并以作为溶 剂使用的MSO-d₆的化学位移值(δC/δH＝40.0/2.50ppm)为基准表示了化学 位移值。在HSQC(异核单量子关系)(1H-detectedheteronuclear single-quantumcoherence)的情况下，设定为1JCH＝140Hz后进行了测定，设 定为nJCH＝8Hz后进行了HMBC(heteronuclearmultiple-bondcoherence)实 验。

首先，根据¹H核磁共振和¹³C核磁共振光谱，如图24及图25所示，罗 巴斯汀(Lobarstin)的¹H核磁共振及¹³C核磁共振谱显示出与化学式4的罗巴 林(Lobarin)核磁共振谱非常类似的形态。

化学式4

分子式：C₂₅H₃₀O₉

分子量：474.5

由此可知，罗巴斯汀(Lobarstin)具有与罗巴林(Lobarin)非常类似的结 构，考虑到分子量之差为18dalton，可以推测罗巴斯汀(Lobarstin)是通过罗巴 林(Lobarin)的水分子消除反应来生成的化合物。比较罗巴林(Lobarin)的 核磁共振资料和罗巴斯汀(Lobarstin)的核磁共振资料可知，特别是，罗巴林 (Lobarin)的¹³C核磁共振光谱中观察到的在低磁场区(downfieldshifted)显 示出吸收峰的sp3混合碳(罗巴斯汀的C-8，106.3ppm)和脂肪族亚甲基碳的 吸收峰消失了，取而代之，观察到了两个双键领域的吸收峰。另外，观察 到了在罗巴林(Lobarin)化合物的¹H核磁共振中不存在的、典型出现在烯 烃氢的磁场区的吸收峰(6.00ppm)，而且通过COSY资料分析，确认了该峰与 脂肪族亚甲基进行自旋-自旋耦合(图26)。因此，推测罗巴斯汀(Lobarstin)是 罗巴林(Lobarin)中的叔醇官能团通过脱水反应被消除，从而在C-8和C-9 上形成双键而成的化合物。通过追加的作为二维核磁共振光谱分析法的 HSQC和HMBC的分析，证实了以上推测的罗巴斯汀(Lobarstin)的结构(表 6)。通过HSQC(图27)和HMBC资料(图28)分析，确认了与罗巴斯汀(Lobarstin) 的各个碳和氢相对应的峰的位置，特别是，从罗巴斯汀(Lobarstin)结构内的 H-5,9,10和11观察到的HMBC相关内容，提供了确定所揭示的罗巴斯汀 (Lobarstin)结构的重要资料。另外，根据H-5和H-9之间的NOE关系，确认 了形成于C-8和C-9的双键几何立体结构为Z-型(顺式)(图29)。

表6

罗巴斯汀(Lobarstin)的核磁共振数据(400MHz,DMSO-d₆)

位置(Position) δ_Cδ_H,mult.(Jin>HMBC^a1 104.2 -- -- 2 157.4 -- -- 3 101.7 5.90,d(1.8) 1,2,4,5,7 4 166.4 -- -- 5 96.7 7.19,d(1.8) 1,2,3,4,8 6 143.4 -- -- 7 163.2 -- -- 8 144.9 -- -- 9 109.3 6.00,t(7,7) 6,8 10 27.3 2.36,m 8,9,11,12 11 21.9 1.52,m 9,10,12 12 3.63 0.96,t(7.0) 10，11 1’ 108.4 -- -- 2’ 158.2 -- -- 3’ 101.9 6.41,s 1’,2’,4’,5’,7’ 4’ 153.2 -- -- 5’ 131.8 -- -- 6’ 137.3 -- -- 7’ 171.2 -- -- 8’ 27.5 2,70,m/2.52,m -- 9’ 29.5 1.39,m/1.27,m -- 10’ 31.4 1.12,m -- 11’ 21.4 1.12,m -- 12’ 13.56 0.69,t(7.0) 10’,11’ 4-OCH₃56.3 3.79,s 4 4’-OH -- 10.39,s 3’,4’,5’

a异核多键相关(HMBC，HeteronuclearMultiple-BondCoherence)分析， 优化为8Hz，从质子到指定的碳。

实施例13

分析罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性

为了分析罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性，用光 谱测量了酶的活性。即，在0.5mg/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(Bioneer 公司，韩国)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.0，0.75mM 氯化钠，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，添加罗巴斯汀 (Lobarstin)0,1,3,10,30,100,300,1000,3000nM和基质[pTyr1146]胰岛素 受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟～30分钟，然 后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(1142-1153，Sigma公司，美国)，并在常温 下反应10分钟，结束与用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的化合物即罗巴斯汀 (Lobarstin)和基质的反应后，在620nm测量了吸光度。

结果，如图30所示，罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑 制活性分析结果为IC₅₀＝154.6nM，显示了出色的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b 的效果，确认了抑制率浓度依赖性地增加，从而确认了罗巴斯汀(Lobarstin) 是能够药学治疗和预防糖尿病和肥胖症的化合物。

实施例14

分析罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性

为了研究罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，通 过光谱测量酶的活性来研究了蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1b)、PTPN2、 PTPN5、PTPN6、PTPN7及PTPN13的抑制活性。首先在0.5单位浓度的蛋 白酪氨酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7、PTPN13(Bioneer 公司，韩国)和蛋白酪氨酸去磷酸化酶缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.0，0.75 mM氯化钠，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗 巴斯汀(Lobarstin)0,50,100,200nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体 (1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟，然后， 添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟， 结束与基质的反应后，在620nm测量了吸光度。

调查罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性的结果， 如图31所示，200nML的罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的IC50 抑制率为47.96％，特别是，确认了对包括TC-PTP(PTPN2)在内的其它蛋白 酪氨酸去磷酸化酶没有抑制活性(图31)。

显示出在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性 地作用的上述实验结果表明，本发明的化合物罗巴斯汀(Lobarstin)能够作为 蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂用于糖尿病的治疗中。

实施例15

验证罗巴斯汀(Lobarstin)对糖尿病模型动物的疗效

15-1：腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)后观察血糖变化

根据对罗巴斯汀(Lobarstin)的预测试、有效性测试及毒性试验资料，决 定了给药量(用测试化合物(mg)/试验动物的体重(Kg)表示)。在7周大的雄性 db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究 院)中，向对照组每天腹腔给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴斯汀 (Lobarstin)10mg/kg，并每周测量两次血糖。

向7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db， 韩国生命工学研究院)腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)后观察血糖变化的结果， 如图32所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为271mg/dL，第7天为326mg/dL， 第14天为479mg/dL，第21天为486mg/dL，显示出急剧的血糖增加现象。 然而，在腹腔给药10mg/kg罗巴斯汀(Lobarstin)的实验组(n＝6)中，平均第0 天为299mg/dL，第7天为259mg/dL，第14天为267mg/dL，第21天为 242mg/dL，确认显示出低于对照组的血糖增加现象(图32)。

15-2：观察腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)并禁食6小时后的血糖变化

为了测量罗巴斯汀(Lobarstin)的更为准确的抗糖尿病效果，在7周大的 雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工 学研究院)中，向对照组每天给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴斯 汀(Lobarstin)10mg/kg，并每周测量两次血糖，此时，腹腔给药后禁食6小时， 然后测量了血糖。

结果，如图33所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为134mg/dL，第7 天为238mg/dL，第14天为350mg/dL，第21天为479mg/dL，显示出急剧的 血糖增加现象。然而在腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg的实验组(n＝6) 中，平均第0天为134mg/dL，第7天为182mg/dL，第14天为162mg/dL， 第21天为204mg/dL。与实施例5-1相同，显示出低于对照组的血糖增加现 象。

15-3：罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药28天后的葡萄糖耐量试验

为了测量腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)后动物模型中的葡萄糖耐量，进 行了如下的实验

在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db， 韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药20％DMSO共28天，向实 验组每天腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg共28天后，在分别不给药 20％DMSO及罗巴斯汀(Lobarstin)的状态下，禁食16小时后，腹腔给药葡萄 糖(500mg/ml，给药量200μl)，然后在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、 90分钟及120分钟时从尾静脉采集的血样，并观察血糖变化。

向第二型糖尿病动物模型皮下给药葡萄糖后观察了葡萄糖量变化，结 果，如图34所示，在对照组(腹腔给药20％DMSO)的情况下，给药葡萄糖后， 0分钟时为204mg/dL，15分钟时为496mg/dL，30分钟时为572mg/dL，60 分钟时为542mg/dL，90分钟时为483mg/dL，120分钟时为424mg/dL，显示 出急剧的血糖增加倾向及非常缓慢的血糖降低现象。然而，在给药罗巴斯汀 (Lobarstin)10mg/kg的实验组的情况下，0分钟时为152mg/dL，15分钟时为 229mg/dL，30分钟时为307mg/dL，60分钟时为205mg/dL，90分钟时为 162mg/dL，120分钟时为147g/dL。可以确认，通过药物浓度依赖性的缓慢 的血糖增加和快速的血糖下降来恢复血糖的正常化(图34)。这些实施例15-1 至15-3的结果表明，本发明的新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)具有非常优秀 的抗糖尿病效果。

以上，详细说明了本发明内容的特定部分，本领域技术人员应当明白， 这些具体的技术只是优选的实施方式，本发明的范围并不局限于此。因此， 本发明的实质性的范围将根据附件的权利要求书及其等价物来定义。

工业实用性

如上所述，本发明的新型化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性非 常优秀，在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地 起作用，能够作为实质性的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂来用于糖尿病的 治疗中，因此，有效预防或治疗糖尿病和肥胖症。