用于将分子引入到乳糜微粒中的胆固醇体囊泡

摘要

本发明涉及具有中空腔室的负载物质的胆固醇酯纳米颗粒(“胆固醇体”)，其基本上由至少一种非离子性胆固醇酯和一种或多种被包裹的活性分子组成，当所述活性分子没有被负载到所述胆固醇体中时，其无法明显穿过肠上皮细胞膜，所述胆固醇体具有中性表面，并能够使用细胞途径以口服吸收营养脂质的方式穿过肠上皮细胞以到达高尔基体。依照本发明，根据本发明的新型负载物质的胆固醇体能够将活性分子沉积到患者或受试者的细胞内，并对该患者或受试者进行治疗或诊断。

说明书

相关申请

本申请要求于2013年3月14日提交的相同题目的美国临时申请序列号 US61/783,003的优先权权益，其全部并入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及具有中空腔室的负载物质的胆固醇酯(脂质)纳米颗粒(“胆固 醇体(cholestosome)”)，其基本由至少一种非离子的胆固醇酯和一种或多种包 囊的活性分子组成，该活性分子当不在胆固醇体中包囊时，未被载入所述胆 固醇体的所述分子难以明显穿过肠上皮细胞膜，该胆固醇体具有中性表面， 并能够使用细胞途径以口服吸收的营养脂质的形式进入肠上皮细胞，到达高 尔基体。依照本发明，根据本发明的该新型负载物质的胆固醇体能够使活性 分子进入患者或受试者的细胞，并对患者或受试者进行治疗或诊断。相比于 不使用胆固醇酯纳米颗粒的现有技术组合物，本发明的组合物的活性要大得 多。

在一个实施方案中，本发明提供了包含活性分子的胆固醇酯纳米颗粒药 物组合物(“负载物质的胆固醇体”)，该活性分子例如为药物活性剂(该术语 包括治疗剂和诊断剂)，其被含有一种或多种由胆固醇以及一种或多种饱和或 不饱和的脂肪酸产生的胆固醇酯的中性电荷表面层所包裹。本发明的胆固醇 体包裹多种尺寸和重量的一种或多种不同的活性分子，尤其是难以使用现有 技术方法(包括脂质体)递送的药物活性分子。

依照本发明，在向患者或受试者给药后，负载物质的胆固醇体完整进入 乳糜微粒(通常是在被摄取到肠上皮细胞中后)，产生含纳米颗粒的乳糜微粒， 且所述含纳米颗粒的乳糜微粒被递送至淋巴系统，随后进入动脉血并到达接 受所述动脉血供给的细胞，因此当乳糜微粒与细胞对接后，该胆固醇体随即 被完整递送至所述细胞内，其中所述胆固醇体被分解，在所述细胞的膜内释 放包囊的活性分子。本发明的效果是直接将活性分子递送至细胞内以进行治 疗或诊断。

根据其与肠(十二指肠)上皮细胞表面上的胆固醇运载体的反应性，选择用 于纳米颗粒组合物的胆固醇酯，在该反应性的帮助下，胆固醇酯被迅速完整 地摄入肠上皮细胞。进入后，胆固醇酯纳米颗粒提供这样的额外优点，在肠 上皮细胞内形成乳糜微粒期间，其保护纳米颗粒的内容物。纳米颗粒的胆固 醇酯成分的其它有利性质为：1)其表面中性电荷使得肠上皮细胞将这些颗粒 视为食物成分；2)该胆固醇体的全部组成都来自安全的膳食成分；和3)尤 其是它们彼此“包裹(pack)”的能力，以及药物掺入纳米颗粒本身中的需求。 脂质体制造技术提供了与胆固醇酯在具有中性表面的囊泡中的用途相反的教 导。事实上，如果纳米颗粒是以本领域所公开的脂质体方式由磷脂所制备， 则其失去了本发明的所有有利特征。

当被所述胆固醇酯包裹时，本发明的药物组合物以及口服治疗方法使得 多种活性成分能进行乳糜微粒靶向的胞内递送，而由于体内降解，这些活性 成分在未保护状态下是无效的。例如，本发明能够有效递送可有效治疗此处 所限定的炎症相关的代谢病的大分子；将疫苗递送至体内具体位点；将遗传 物质递送至细胞内，其中它们在核糖体和细胞核中产生作用；甚至在一些具 体实施方案中在皮肤上进行局部递送，其具有穿过皮肤屏障的潜力。还公开 了使用本申请的组合物治疗疾病状态和/或状况的其它方法。事实上，任何活 性分子都可被有效递送至患者或受试者的靶细胞内，从而进行有效治疗，这 是现有技术的递送方法所无法实现的。通过向有需要的患者给药本发明的组 合物来治疗疾病状态和状况的方法构成本发明的其它实施方案。用于本发明 的治疗方法实施方案的组合物的有效剂量范围可低至每天1mg或更少，高至 每天1克或更多。其它有效剂量将取决于患者或受试者的体型和年龄、患者 的总体健康状况以及一系列其它因素。所考虑的剂量范围低至少于约0.001 mg/kg/天，高至约100mg/kg/天或更多，更常使用约0.01mg/kg/天至约25 mg/kg/天的范围。

背景技术

存在多种新型治疗产品，其中将大型蛋白质或其它大分子用作治疗或诊 断物质。对于治疗慢性疾病，对通过非静脉途径(例如皮下注射)递送大分子存 在很大兴趣，以改善患者的方便程度和顺应性。肽(包括多肽，例如单克隆抗 体)、蛋白质和DNA的口服给药将会变得更加方便，且不会降低安全性。然 而，很多人认为不可能在人体中实现大型蛋白质的口服吸收。因为口服给药 的分子(如蛋白质、肽和遗传物质)要么通过胃肠道(GI)消化，要么无法穿过肠 上皮细胞的细胞膜，或两者兼备，因此广泛认为肠外递送是给药这些活性成 分的唯一可行性途径。当通过口服途径给药时，蛋白质不被肠细胞完整吸收。 相反，它们被酶裂解成氨基酸成分，因此多数通过生物技术产业生产的治疗 性蛋白质完全无法抵抗胃肠道降解途径。

另一方面，基于多种原因，常用的给药途径(肠胃外给药)对于大分子递送 不是最佳的。与口服给药相比，肠胃外给药更昂贵，且要求硬件以及受到良 好培训的人员。

即使在肠胃外给药后，大分子也会遇到穿过膜的问题。它们被很多靶细 胞排斥，且因此它们在血液中循环直至被清除或被降解，但永远无法成功进 入体细胞。大分子可能无法穿过区域性屏障，例如血脑屏障，这有效阻碍了 大分子靶向选定的器官和组织，例如大脑。这可能是多种单克隆抗体临床试 验失败以及它们缺少足够活性来治疗阿尔兹海默病的潜在原因，该抗体对抗 淀粉样蛋白途径中的靶标，以从大脑中清除淀粉样蛋白。通常，这些蛋白的 较大尺寸和缺少脂溶性会限制其它新型靶单克隆抗体的胞内有效性。

显然，口服蛋白质的成功取决于创造新型制剂，其克服GI道中的酸降解 和/或酶降解，然后克服对肠上皮细胞膜的低渗透性，并另一方面最终克服目 前无法进入细胞的问题。

仅克服胃肠道降解问题的最近的制剂可实现～5％的吸收。显然该步骤是 重要的，但还不够，因此仍然需要通过使蛋白质吸收进入肠上皮细胞的新方 法进一步改善蛋白质较差的生物利用度，该方法在此被首次公开。

此外，本发明的递送方式通过在纳米颗粒上进行的变革性步骤(使脂质纳 米颗粒掺入乳糜微粒，同时使其分子负载物保持完整)首次解决了所述下一个 问题，即胞内递送。只能通过使用此处公开的胆固醇酯建立脂质纳米颗粒才 可以使其成功掺入乳糜微粒中。

此前通过肠上皮细胞递送用于口服吸收的大分子的尝试依赖于在纳米尺 寸颗粒中的包裹。已经使用不同组成的脂质体进行了大多数工作。

如来自美国专利申请文件20110229529的以下摘录中所示，脂质体并没 有解决上述问题。“脂质体被广泛用作小分子的递送载体；然而对于很多大分 子药物，仍然很难实现在脂质体内的高水平包裹。此外，很多药物制剂从脂 质体中渗漏得太快，以至于无法保持有效的药物递送动力学。尽管通过微米 和纳米颗粒的药物递送可包裹蛋白质和小分子药物，然而单位质量的颗粒所 包裹的药物总质量通常非常低，在这种情况中，通常为约1:1000至1:10,000 质量比的蛋白质:磷脂混合物(例如参见US7,662,405)。此外，用于聚合物颗 粒合成的有机溶剂以及这些颗粒内的疏水性/酸性环境可破坏治疗(参见Zhu 等，Nat.Biotechnol.200018:52-57.)”。

除了前述低包裹量的水溶性蛋白或小分子外，关于使用脂质体甚至还存 在其它问题。具体地，多数脂质体的内含物为磷脂，通常为磷脂酰胆碱。这 些纳米尺寸的脂质颗粒是高度带正电荷的，并因此被肠上皮细胞的外膜和周 围细胞的细胞膜所排斥。.

因此磷脂基脂质体无法通过口服吸收，且当被肠胃外注射时也无法将其 内容物传入细胞内。因而现存组成的脂质体不适用于包裹蛋白质或肽(包括多 肽，如单克隆抗体)，并且即使可以向这些颗粒中装载足够的分子，它们也无 法解决口服吸收的问题。此外，磷脂酰胆碱基脂质体无法在保持其分子负载 物完整的同时掺入乳糜微粒。

Tseng以及同事在2007年描述了这些问题(Tseng等,JofMedicaland biologicalengineering2007；27:29-34；该文章题目为Liposomesincorporated withcholesterolfordrugreleasetriggeredbymagneticfield)，且其中测试了该假 设，即将胆固醇加入磷脂酰胆碱脂质体中将改变这些性质并改善负载。它们 发现在负载方面仅出现轻微的改善，且没有足够胆固醇以改变外表面的正电 荷。对他们更重要的是，观察到脂质体中增加的胆固醇阻碍了负载分子的脱 离。“脂质体中胆固醇含量的增加导致对非电解质和电解质溶质的膜穿透性急 剧下降。一种优化的通过脂质体进行的药物递送要求脂质体载体最终变得可 穿透，并在靶向区域上释放其包裹的药物，但还要求在血流中的高稳定性”。 因而整个脂质体领域多数都放弃了将胆固醇作为脂质体的成分，认为含有胆 固醇的脂质体的分子释放性质会被劣化，并为整个领域提供了与本发明的具 体纳米颗粒相反的教导。

应注意，在本发明中，发明人选择具有高负载量和缓慢释放性质的胆固 醇酯以特别用于在其穿过GI道肠上皮细胞的膜、然后进入乳糜微粒、然后穿 过细胞膜的过程中保护分子的目的。仅在体细胞内发生胆固醇体包裹的蛋白 的解包(Unpacking)，相比于任何现有系统，这为所公开的递送方法提供了极 大的优势。我们将这比作特洛伊木马，当然其在专利存在之前就被发明，但 至今从未被用作药物递送系统。

还应注意，所公开的方法仅旨在用于胆固醇酯，因为在脂质中只有这些 分子在通过乳糜微粒进行的胞内递送中自始至终保持完整。

考虑到现有大分子治疗的局限性，仍然需要这样的制剂和治疗，其以更 方便的方式(例如口服)给药药物活性大分子，并且仍然需要允许蛋白质和其它 分子进入细胞的制剂。使用一种制剂同时实现这两个方面是本发明的首要目 标。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供了包含药物活性剂的胆固醇酯纳米颗粒 药物组合物(负载物质的胆固醇体)，所述药物活性剂被包含一种或多种非离子 胆固醇酯的表面层所包裹。本发明中所用的胆固醇酯由胆固醇(如本文所定义 的)和本文另外描述的一种或多种饱和或不饱和脂肪酸所产生，该脂肪酸优选 C₄-C₃₆脂肪酸，通常为C₈-C₂₆脂肪酸，更通常为选自肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、 萨芬酸(Sapienicacid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反式亚麻酸(Linoelaidic acid)、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛 酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四 烷酸、蜡酸或其混合物的脂肪酸。本发明的胆固醇体被胃肠道的肠上皮细胞 大量吸收，并与其内容物一起被快速转移至乳糜微粒中，从而提供了将包裹 的分子直接运输到体细胞中的方法，并且随附且重要地，绕过了肝首过摄取 途径。意料不到的是，这里要求保护的负载物质的胆固醇酯囊泡能够向细胞 内递送多种分子以进行有效治疗或诊断，该分子包括肽(包括多肽，如单克隆 抗体)和蛋白质以及其它大分子，包括多核苷酸(如DNA和RNA)、大分子抗 微生物剂(抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和抗朊病毒)，其在尺寸和分子 量方面都有很大变化。

在本发明中，活性分子(优选包括药物活性剂)与一种或多种胆固醇酯的质 量比在约4:96至约96:4之间、约10:90至约96:4、通常约10:90至约96:4、 通常约20:80至约90:10、约20:80至约50:50、约50:50至约96:4、约90:10 至约96:4。

物理性质

在某些实施方案中，该药物组合物为单层囊泡，其中该囊泡体积的约10％ 至约98％、约20％至约96％、通常约50％至约96％、通常约90％至约96％被 药物活性剂所占据。

在另一实施方案中，使用交叉交错的烷基链(interdigitatedalternatingalkyl chain)模型，通过根据药物活性剂-胆固醇酯的官能团相互作用来选择一种或 多种胆固醇酯，从而使活性分子(包括药物活性剂)与一种或多种胆固醇酯的质 量比最大化。以下实施例2描述了确保最佳药物活性剂-胆固醇酯的官能团相 互作用的制剂标准。

在另一实施方案中，药物组合物为胆固醇体囊泡，其通过这一方法制造， 该方法包括使乙醚中的一种或多种胆固醇酯反应、在真空下除去所得有机相 和加入水相。

在又一个实施方案中，根据其与十二指肠的肠上皮细胞表面上的胆固醇 运载体的反应性以及在进入乳糜微粒之前在肠上皮细胞中保持完整的能力来 选择胆固醇酯。

在本发明的实施方案中，通过用C₄至C₃₆饱和或不饱和脂肪酸、通常C₈至C₂₆脂肪酸来酯化胆固醇，从而获得胆固醇酯。在一些实施方案中，胆固 醇酯通常选自肉豆蔻酸胆固醇酯、月桂酸胆固醇酯、十二烷酸胆固醇酯、棕 榈酸胆固醇酯、花生四烯酸胆固醇酯、山嵛酸胆固醇酯、亚油酸胆固醇酯、 亚麻酸胆固醇酯、油酸胆固醇酯和硬脂酸胆固醇酯。

胆固醇体中的抗感染分子

在优选的实施方案中，本发明提供了负载物质的胆固醇体药物组合物， 其包含抗感染化合物，该化合物(1)选自咪康唑、特康唑、益康唑、异康唑、 噻康唑、白呋唑、克霉唑、酮康唑、布康唑(butaconazole)、依曲康唑、奥昔 康唑、芬替康唑、制霉菌素(Nystal)、萘替芳、两性霉素B、齐诺康唑和环吡 酮胺、米卡芬净、卡泊芬净、阿尼芬净、万古霉素、达托霉素、奥利万星、 WAP8294A、达巴万星、头孢洛林(ceftaroline)、头孢吡肟、头孢三嗪、头孢 他定、奎奴普丁/达福普汀(共杀素)、磷霉素、可立其丁、替加环素；且(2)被 基本由此处另外定义的胆固醇酯组成的表面层包裹。该组合物可用于治疗感 染，并可被局部给药，包括经口或阴道内。

肽分子胰岛素及其它

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了包含肽的负载物质的胆固醇 体药物组合物，所述肽通常选自亲水性肽、人生长激素、催乳素、催产素、 降钙素、牛生长激素、猪生长激素、生长素释放肽、GLP-1、PYY36、泌酸 调节肽、GLP-2、胰高血糖素和胰岛素，且该肽被此处另外所述的胆固醇酯 包裹。可给药该组合物以增加奶产量、改善器官和组织(如胰脏或肝脏)的结构 或功能、增加或刺激哺乳动物的生长或向需要胰岛素治疗的个体给药胰岛素。

在一些实施方案中，纳米颗粒的表面层被肠溶包衣进一步包裹，以避免 药物组合物在胃肠道中的降解。

在一些实施方案中，负载物质的胆固醇体的表面层在约2至约14的pH 范围内保持完整。

在其它实施方案中，负载物质的胆固醇体为单层囊泡，其具有的直径为 约5nm至超过10,000nm(10微米)，约10nm至约1000nm、通常约50nm 至约750nm、约100至约500nm、约200至约300nm，取决于材料经过挤出 步骤或未被挤出。因此需注意，当活性分子较大时使用较大的胆固醇体，当 活性分子较小时使用较小的胆固醇体。

口服吸收的特征以及有利的相关性质

不被理论限制，本发明使得制剂能够被经口递送，该制剂将分子包裹到 胆固醇体内，该胆固醇体通过分子识别进入GI肠上皮细胞、被摄取、进入乳 糜微粒，从而在胃肠道内、肠上皮细胞内、淋巴系统内、血液内以及穿过体 细胞膜期间完全保护了该分子的完整性。本发明的制剂在其进入体细胞之前 不释放活性成分。因而本发明的特征包括以下几点：

1)完整通过Caco2肠上皮细胞屏障；

2)完整通过细胞膜屏障；

3)极大地避免内体(endosome)摄取的胞内递送方法；

4)经口递送不受活性分子的尺寸、电荷、结合或降解途径的影响，不过 负载物质的胆固醇体的表面本身是中性的；

5)活性成分在绕肝淋巴系统中循环-避免首过肝摄取的经口递送方法； 和

6)分子递送通过在乳糜微粒表面附着载脂蛋白而促进，能够与细胞对接 和胞内负载，随后在细胞质中卸下包囊的分子。

因此，相对于缺少胆固醇体给药的情况(即通过常规药物递送方式，包括 在脂质体中递送)，本发明的负载物质的胆固醇体能够在向其给药该组合物的 患者或受试者的细胞内将负载物(即活性分子)递送至少两倍的浓度。在多数实 施方案中，相对于在缺少胆固醇体给药的情况，本发明在细胞内递送活性分 子的浓度为至少10倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍和1,000倍或 更多。因而，本发明提供了包裹具有不同尺寸和分子量、且此前无法包裹的 分子的方法(其本身就是意料不到的结果)，且无论尺寸是多少，本组合物都能 够以比现有技术中更高水平的浓度将活性分子递送至细胞中的靶标处。

在本发明的详细描述中将更详细地描述本发明的这些方面以及其它方 面。

附图说明

表1显示了胆固醇体与替代的递送形式的性质比较，表明胆固醇体在各 方面都更好，或至少性质相当。该比较的一个特别重要的方面是，几乎所有 分子都可被包裹到胆固醇体中，而不会改变分子本身。其它递送系统不具有 该特征，其趋于对分子自身具有特异性。

图1显示了比较乳糜微粒、胆固醇体和脂质体的结构性质的图，还显示 了含有包裹分子的胆固醇体的乳糜微粒的组装。该图显示，在胆固醇体进入 乳糜微粒之前，分子就在胆固醇体以内。在乳糜微粒内加入载脂蛋白(APO) 结构允许其与细胞对接，并释放其内容物，其中包括胆固醇体及其内容物。 相反，脂质体是完全不同的物理结构，主要由磷脂组成，并具有带正电荷的 表面。具有正电荷的脂质体不被肠上皮细胞摄入，并因而无法进入乳糜微粒 中。当其被静脉注射后，脂质体通常主要由肝脏清除。胆固醇体和乳糜微粒 通过淋巴通道绕过肝脏，这是它们负载着包囊的构造体进入细胞的主要原因。

图2显示了1:1摩尔浓度比的月桂酸胆固醇酯/肉豆蔻酸胆固醇酯的3D 模型。A)仰视图片，B)俯视图片。红色表示负电荷(白色细箭头)，蓝色表 示正电荷(白色粗箭头)，且黄色表面显示从一个带电区域转化到另一个(黑色 箭头)。B中的白色箭头表示酯化脂肪酸部分的预测位置。注意在这些剖面图 中，表面可被视为可发生对接的区域，根据酯化脂质的性质，腔室可具有用 于结合分子的多个独立位点。

图3显示使用DLLS测量的还未负载的胆固醇体制剂中胆固醇体尺寸的 高斯分布。在该制剂中胆固醇体的直径为217+/-116nm。尺寸在约50nm至 约500nm的范围内。刻度(Scale)为1000nm，等于1微米。

图4显示了通过透射电镜的图像所见的胆固醇体的尺寸。使用钼酸铵对 胆固醇体进行负染色，并在HitachiH-500透射电镜上成像。显示比例尺以用 于估计尺寸。1000nm的刻度单位等于1微米(micro)，等于1微米(micrometer)， 等于百万分之一米。在该显微镜下所观察到的胆固醇体中值尺寸范围(约250 nm)与通过DLLS确定的尺寸分布一致。

图5显示了由胆固醇体介导的FITC向MCF7细胞中的递送，在24小时 的培养后测量。(A)加入包裹有FITC的胆固醇体(ChF)。(B)加入游离的FITC 溶液(FITC,0.5M)。(C)加入100μl的蒸馏水。在完全培养基中用ChF、FITC (100μl)或囊泡(水)培养细胞。用培养基清洗细胞两次，然后用10μMHoechst 33342培养15分钟以使细胞核染色。后者证明细胞存活力。注意在ChF处理 的细胞中的均匀荧光(A中的左图)，这表明细胞质中的均匀分布。

图6显示在HPXW8000工作站上使用SYBYL(Tripos,StLouisMO)对胆 固醇酯进行分子模拟时酯链长度的影响。显示了使用不同对的具有近似相等 的烷基链长度的胆固醇酯形成的对照模型。使用GASTIGERHuckel方法计算 电荷，将该电荷作为静电等电位图的输入。所显示的等电位表面为-10kcal 和+10kcal，以强调酯连接和固醇核。红色为-10kcal；蓝色为+10kcal。图中 央所得出的不同处为酯连接。注意改变模型中的酯长度并不改变表面或内部， 但该变化确实使固醇核彼此更加接近。其还改变了内径大小，以及疏水性“轨 道”的特征。

图7显示了由肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯形成的基质的截面 图。计算电荷并生成静电势图。注意蓝/红区域，其表示更亲水的区域，其中 烷基链交错形成双层。所显示的分子为头孢洛林，其是亲水性分子，分子量 约为600道尔顿，在其最宽处尺寸为1.8nm。

图8显示了与基质相关联的头孢洛林，该基质通过在HPXW8000工作站 上使用SYBYL(Tripos,StLouisMO)进行肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇 酯的分子模拟而形成并显示。显示了来自两种胆固醇酯(在该实例中为肉豆蔻 酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯)的交错烷基链。在该情况中，该结构形成与头 孢洛林分子相容的外膜和内表面。在其最宽处，头孢洛林为1.8nm。胆固醇 体直径为250nm。基于膜尺寸，完全负载的胆固醇体内部含有96％的具有水 溶性的分子。

图9显示一种闭合(close)，说明了在以环形排列的基础胆固醇体基质中 的头孢洛林。为了显示其相对尺寸，头孢洛林为非常小的分子(1.8nm)，并被 载入115nm的胆固醇体中。环为胆固醇酯的链。

图10显示了围绕头孢洛林(显示了一个分子)部分组装的胆固醇体。该部 分组装的胆固醇体基质显示了与头孢洛林分子相关联的壁和结构。尺寸包括： 所显示的膜为4nm宽。头孢洛林为1.8nm长。亲水性内芯袋的内径为65nm。

图11显示了通过在HPXW8000工作站上使用SYBYL(Tripos,StLouis MO)进行的与胆固醇酯基质相关联的胰岛素的分子模拟。显示了来自两种胆 固醇酯(在该实例中为肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯)的交错烷基链。该 结构形成与所显示的分子(在该情况中为胰岛素)相容的外膜和内表面。尺寸包 括：所显示的膜为36nm长和4nm宽。胰岛素在其最宽处为4nm。胆固醇 体直径为250nm。基于膜尺寸，完全负载的胆固醇体中空内芯可含有高达96％ 的内容物，假定具有水溶性分子的紧密堆积中心。

图12显示了由肉豆蔻酯和月桂酸酯形成的基质的截面图，该基质围绕胰 岛素组装为相互交错的烷基链模型。计算电荷，并生成静电势图。注意蓝色/ 红色区域表示更亲水的区域，烷基链交错形成囊泡。所显示的胰岛素基质(黄 色)内部的分子为头孢洛林，一种分子量约600道尔顿的亲水性分子。进行该 重叠(overlay)是为了显示尺寸差异，并不表示发明人希望将这两种分子在同一 胆固醇体中结合。

图13显示了一种闭合，说明在基础胆固醇体基质中的胰岛素，在该情况 中该胆固醇体基质由肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯形成。尺寸包括： 显示为基质的膜为36nm长和4nm宽，胰岛素在其最宽处为4nm。为了说 明的目的，所显示的胆固醇体囊泡的直径为100nm。

图14显示了在HPXW8000工作站上使用SYBYL(Tripos,StLouisMO) 进行的与胆固醇酯相关联的贝伐单抗的分子模拟。显示了两种胆固醇酯(在该 实例中为肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯)的交错烷基链。该结构形成与 所显示的分子(在该情况中为贝伐单抗)相容的外膜和内表面。尺寸包括：贝伐 单抗为17nm长和4nm宽，而所显示的膜在单个基质环中为36nm长和4nm 宽。未被挤出的用于贝伐单抗的胆固醇体直径为10,000nm，且挤出的直径为 250nm。根据膜尺寸，与单个双层环结合的完全负载的胆固醇体具有96重量 ％的内容物，其为水溶性分子。

图15显示一种闭合，说明在基础胆固醇体基质(在该情况中由肉豆蔻酸 胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯形成)中的贝伐单抗。250nm的胆固醇体体积为七 百万立方纳米，或7x10^-15ml。假设其为单层的，如果我们由此计算负载因 子，该胆固醇体占体积的4％，且其内部所含的溶液为体积的96％。尺寸包括： 贝伐单抗为17nm长和4nm宽；所显示的膜具有100nm的直径。

图16显示在HPXW8000工作站上使用SYBYL(Tripos,StLouisMO)进 行的贝伐单抗、胰岛素、头孢洛林在由胆固醇酯形成的基础胆固醇体基质中 的分子模拟。显示两种胆固醇酯(在该实例中为肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆 固醇酯)的交错烷基链。该结构形成与所示分子(在该情况中为贝伐单抗、胰岛 素和头孢洛林)相容的外基质和内表面。根据膜尺寸，当负载有水溶性分子时， 完全负载的胆固醇体内部有96％的内容物。可以v/v(囊泡的体积和分子的体 积)计算负载量。假设：胆固醇体为直径为250nm的球体。因此内芯亲水性 袋的直径为242nm，半径121nm。这使得胆固醇体的总体积为约七百万nm³(立方纳米)。我们可计算分子的体积，并计算可能的总数量(不包括溶剂)，并 以该方式计算囊泡与分子的质量比。另一种方式是考虑囊泡的体积，并考虑 待包囊的类似物的浓度。例如，溶液中的贝伐单抗为100mg/ml。将立方纳米 转换为ml，然后确定多少可被装进胆固醇体中，并以这种方式比较质量。转 换后产生的内容物中贝伐单抗与脂质的比例(质量比)为约96:4％(。

图17显示了用于在将Caco2细胞单层的顶侧暴露于包裹有分子的胆固醇 体之后收集底侧流体的装置的示意图。所有尺寸的胆固醇体包裹的分子都被 摄入Caco-2细胞，并且从那里，通过高尔基体，负载的胆固醇体完整进入乳 糜微粒。肠上皮细胞的摄取过程比此处所示的Caco-2细胞的过程更快且效率 更高。乳糜微粒的其它典型成分为APO-B、其它载脂蛋白和甘油三酯。形成 后，乳糜微粒被Caco-2细胞分泌到单层底侧的淋巴液中。在该Caco2单层底 侧上的流体中捕获负载有胆固醇体的乳糜微粒。

图18显示在Caco-2细胞上放置1小时(并非在胆固醇体中)的FITC胰岛 素的顶侧放置。在1小时时通过荧光显微镜拍摄图片，并且这里的图片是在 整个细胞系统的两侧拍摄的，绿色为FITC标记。无需怀疑，FITC信号主要 停留在顶层上。然而，有迹象表明FITC胰岛素(或者在被消化的胰岛素的情 况中为FITC片段)可被摄入Caco-2细胞中，注意聚合颗粒(如箭头)。这可被 认为是乳糜微粒摄取FITC或FITC胰岛素的片段，其在右侧底部(箭头处)产 生较大的荧光结构。

图19显示了transwell实验的结果，其中拍摄图片以通过底侧流体的图像 显示基线情况。没有对Caco2的顶层加入任何物质(仅为PBS/葡萄糖)，在底 侧室中仅有PBS，因此该图像反映了用于我们的测试中的Caco-2细胞系统的 自身的荧光。从底侧获得流体，并然后以200x的放大率成像。刻度为10μm， 即10,000nm。

图20显示了FITC胆固醇体的transwell实验结果，其条件与前述完全相 同；这次发明人向顶侧加入具有FITC的胆固醇体的PBS溶液，并放置2小 时。根据这些成像的乳糜微粒的尺寸(20至30μm＝27,000纳米(其为被加入 顶侧的FITC胆固醇体的100倍))，发明人认为这些可能是内部含有很多250 nm的FITC-胆固醇体的中到大型乳糜微粒。注意仅对来自底侧的流体拍摄这 些图片，而非在取出流体之前对该制剂的成像。此处的图像被放大200倍。 在被加入顶侧的溶液中有可能残留有游离的FITC-胆固醇体，但其无法在这 里量化，因为该图像仅显示从transwell制备中去除后的底侧流体。

图21显示了transwell实验的结果，其条件与前述完全相同，这次发明人 加入了胆固醇体-FITC-胰岛素在PBS中的溶液，并使其放置2小时。根据乳 糜微粒图像中的尺寸(40至60μm，即40,000至60,000纳米)，这些是内部已 含有FITC-胰岛素-胆固醇体的相对较大的乳糜微粒。注意发明人仅对来自底 侧的流体成像。此处的图像被放大200倍，刻度显示为10,000nm。

图22显示了用于暴露于MCF-7细胞的FITC-胰岛素的原起始浓度为466 mcg/ml，在行A中没有在MCF-7细胞内部产生可测量含量的FITC胰岛素。 对于下面两张图(行B和C)，FITC胰岛素胆固醇体的浓度为0.46mcg/ml，这 与前两张图中所总结的实验一致。0.46mcg/ml的FITC胰岛素胆固醇体(行 B)所产生的胞内荧光与466mcg/ml的不含胆固醇体的FITC胰岛素(行A)基本 相同。与466mcg/ml的不含胆固醇体的FITC胰岛素(行A)相比，通过Caco-2 细胞将FITC胰岛素胆固醇体进一步加工成乳糜微粒，这使得源自FITC胰岛 素胆固醇体-乳糜微粒的细胞中胰岛素的含量大幅增加(行C)，达到远大于仅 有FITC-胰岛素时的含量的1000倍，且比未经Caco-2细胞加工的0.46mcg/ml 胰岛素的效果大得多。假设经过Caco2细胞的量是被加入顶侧的胰岛素的全 部，则行C的FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒中胰岛素的浓度与中间行B中 胰岛素的浓度相同。该具体制剂残留有游离的胰岛素，且如果穿过Caco-2细 胞的量低于100％，则该胞内负载比会更高。显然，FITC胰岛素胆固醇体乳 糜微粒在细胞内部实现更高的负载量，这与此前通过单独FITC胆固醇体所示 的一样，再一次证明仅仅胆固醇体就能够允许肽穿过细胞膜进入细胞。底下 的行C中的图像反映了在细胞内部观察到的FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒 的渗透。在该图片中，不仅细胞膜上具有浓度更大的FITC胰岛素，这些细胞 的细胞质中也负载有FITC胰岛素。这是在仅仅2小时的暴露后，证实了乳糜 微粒的负载量不仅更大，而且其相对于胆固醇体本身还负载得更快。

图23显示了通过亮视野相对于FITC荧光成像所比较的被暴露于FITC 妥布霉素制剂的MCF-7细胞，其在1)中显示：在被暴露于FITC-胆固醇体24 小时后，MCF-7细胞总体上实现成功负载，我们使用胆固醇体进行的研究已 经几次证实了这一点。在2)中，将该响应(基本不受700mcg/ml的外部浓度 的影响)与被暴露于FITC-妥布霉素的MCF-7细胞总体缺少胞内负载相比较。 这一点是可以预期的，因为妥布霉素不进入多数体细胞，且任何主动摄取妥 布霉素的细胞都经受妥布霉素的胞内杀灭。这是妥布霉素的肾毒性和耳毒性 的基础。在最感兴趣的3)中，当MCF-7细胞被暴露于FITC-妥布霉素-胆固醇 体中24小时时，这些MCF-7细胞全部死亡，由最后一框图的上图和下图可 见。此处的目的是显示当妥布霉素进入细胞时其普遍对线粒体有毒，且即使 当妥布霉素进入在其它情况下对其胞内效果有抵抗力的细胞时，仍存在胞内 摄取和损害的可能。

图24.万古霉素在24小时进入MCF-7细胞。在该系列实验中，万古霉 素的原起始浓度为41至666mcg/ml。在每列中，上图为荧光，下图为暗视野。 在这组FITC-万古霉素中，在B列中显示的是83mcg/ml的FITC万古霉素。 在A列中，0.83mcg/ml的FITC-万古霉素-胆固醇体产生更大的摄取量，而其 浓度值是B列中FITC-万古霉素中万古霉素浓度的百分之一。A列中的荧光 图片比B列中的图片显示出更多的负载量，这表明FITC-万古霉素-胆固醇体 的MCF-7细胞负载比大于100倍。当在列C中，FITC-万古霉素的浓度增加 至666mcg/ml时，这些细胞的负载量仍然不与列A中一样高。因此，当使用 胆固醇体时，FITC万古霉素负载的荧光数据达到1000倍。应注意高含量的 FITC万古霉素胆固醇体对这些MCF-7细胞没有影响。这三组图中的图像确 认了我们所观察到的FITC万古霉素胆固醇体在细胞内部的渗透。不仅在该图 像中细胞膜上FITC万古霉素的浓度更大，这些细胞的细胞质中也负载有FITC 万古霉素。这仅仅是在24小时暴露后，证实了胆固醇体使细胞内负载更多的 万古霉素。

图25显示，相比我们此前使用FITC胰岛素胆固醇体进行的一些实验， MCF-7细胞的FITC胰岛素胆固醇体的负载量得到了改善，且这里通过使用 FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒，该负载量甚至变得更多。在所有情况中，通 过Caco-2细胞将FITC胰岛素胆固醇体加工进入乳糜微粒，使得细胞内部从 FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒中获得的胰岛素量显著增加(B行)，不仅该图 像中细胞膜上FITC胰岛素的浓度显著更大，这些细胞的细胞质中也负载有 FITC胰岛素。这仅仅是在2小时暴露后，证实了乳糜微粒不仅负载更多，它 们还负载得比胆固醇体自身更快。向4只小鼠给药该制剂。

图26.使4只小鼠口服FITC胰岛素胆固醇体制剂，30分钟后使用血糖 仪测量血糖。在经口强饲FITC胰岛素胆固醇体制剂后30至60分钟时，四只 小鼠中的三只的血糖大幅下降。第四只小鼠的血糖直到给药后2小时才开始 下降，但具有相似的下降和恢复时间。在该图中将数据分别进行单独显示和 组合显示。

图27显示在向MCF-7细胞加入173mcg/ml的目标浓度的FITC贝伐单 抗后2小时、4小时和24小时的暗视野(上行)和荧光图像。这些浓度是通常 在用贝伐单抗治疗的患者中所观察到的5到10倍。没有证据表明FITC贝伐 单抗进入这些MCF-7细胞的MCF-7细胞膜内。在任何时间点都没有证据显 示MCF-7细胞对FITC贝伐单抗有任何荧光摄取，也没有证据显示FITC-贝 伐单抗对这些MCF-7细胞有效果。贝伐单抗对MCF-7细胞的IC50为约1.0 mcg/ml。

图28显示了FITC贝伐单抗胆固醇体和FITC-贝伐单抗胆固醇体乳糜微 粒，其被制备并用MCF-7细胞测试。在2小时处没有效果，此时MCF-7细 胞显示对FITC贝伐单抗胆固醇体的极少的摄取量。将这些相同的FITC贝伐 单抗胆固醇体置于Caco-2细胞的顶侧，并收集所得FITC贝伐单抗胆固醇体 乳糜微粒，在MCF-7细胞上测试这些FITC贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒。下 行的第一张框图显示FITC贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒被大量摄取，而如后一 框图所示，在实验4小时时，所有MCF-7细胞均被杀死。而根据贝伐单抗的 已知作用机制，这是完全意料不到的。

图29显示由肉豆蔻酸胆固醇酯、月桂酸胆固醇酯和在中空芯中的胰岛素 形成的脂质纳米颗粒的组件。

发明详述

相对于任何现有技术，胆固醇体都是独特且新颖的。

在分子的递送系统中，依照本发明的胆固醇体是独特的。与其它药物递 送方式不同，发明人成功地将蛋白质和其它分子及化学化合物伪装成本领域 通常认为是食物的成分。更具体地，所选择用于经口摄取的物质为膳食胆固 醇酯。令人惊讶的是，胆固醇酯提供了具有以下性质的独特的胆固醇酯纳米 颗粒，这些性质使被胆固醇体包裹的产品(尤其是在其它情况下无法真正被成 功递送到患者中的大分子)与脂质体或任何其它纳米颗粒区分开：

1.递送方式和系统的所有成分材料均是常见的膳食成分，且在多 数应用中，这些物质每天的总剂量低于来自食物的量。

2.包裹到胆固醇体中的操作温度通常为35至45摄氏度，而这是 使体循环形式的肽和蛋白稳定的最佳温度。

3.所述递送方式将提供所有有利的方面，而无需考虑分子尺寸、 电荷、结合或降解途径。

4.胆固醇体包裹的蛋白质显示出完全穿过Caco2肠上皮细胞屏 障，并完整地进入乳糜微粒中。

5.绕过了肝脏以及与之相关的首过清除途径。

6.在经口摄取一直到胞内摄取的全过程中，胆固醇体和含有该胆 固醇体的乳糜微粒在穿过细胞膜时都为分子提供保护。

7.与细胞对接(Docking)；定量的细胞内负载；完全穿过细胞膜屏 障。

8.通过胆固醇酯水解酶(一种内源性途径)在细胞质中卸下包囊的 内容物。

9.有效负载分子在胞内位点有较高胞内浓度，而胆固醇体不使用 内体摄取途径。

10.当进入天然形成的乳糜微粒时，胆固醇体及其包裹的内容物分 布到所有细胞中。

尽管一些递送系统可实现这9个特征中的一个或一小部分，但没有其 它的递送系统能够实现所有这些宽泛的有利性质，尤其是当该递送系统使得 此前无法被吸收的蛋白质能够被口服使用，并不改变有效负载的分子且基本 上对任何分子或化学化合物都可使用时。胆固醇体是第一种能够被用于任何 分子的胞内递送系统。事实上，胆固醇体至少对大分子像对小分子一样有效， 其中该大分子尤其包括蛋白质、肽、多核苷酸(RNA和DNA，例如包括裸露 DNA、质粒DNA、干扰RNA或“RNAi”(其中包括小型干扰RNA或“siRNA”)、 小型发夹“shRNA”、双功能shRNA、微RNA和各种DNA和RNA的寡核苷 酸)和大分子抗生素。

由于向患者或受试者的细胞内靶标递送活性分子的独特机制，本发明的 负载物质的胆固醇体能够将负载物(即活性分子)递送至患者或受试者(向该患 者或受试者给药该组合物，优选口服)的细胞内，其浓度达到当以不含胆固醇 体的形式提供时(即通过常规药物递送方式，包括在脂质体中递送)的至少2 倍。在多数实施方案中，本发明将活性分子递送到细胞内的浓度为当以不含 胆固醇体形式提供(递送至细胞内)时的至少10倍、25倍、50倍、100倍、250 倍、500倍和1000倍或更多倍。

由于在用于分子和化学化合物递送的现有技术中，胆固醇体是新颖的， 发明人向读者提供了详细的比较数据来说明为何现有技术没有公开任何类似 的系统；

根据以下比较，将提供非限制性实施例。

在说明书中使用以下术语来描述本发明。如果此处没有对一个术语进行 具体定义，则该术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。对那些可 使用本发明的一种或多种脂质纳米颗粒包裹的化合物治疗的疾病状态或状况 为本领域通常已知的那些。

应注意，除非被清楚明确地限定为一种指示物，否则在本说明书和所附 权利要求中所用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”都包括复数 形式。因此，例如，提到“一种(a)化合物”则包括两种或更多种不同的化合 物。如此处所用，术语“包括”及其语法变体旨在为非限定性的，这样在列 表中所引用的项目就不会排除其它可取代的类似项目或其它可被加入所列项 目中的项目。

通常，胆固醇在膜中以及在脂质代谢中具有重要的结构功能。其是胆汁 酸、维生素D和类固醇激素(糖皮质激素、雌激素、黄体酮、雄激素和醛固酮) 的生物合成前体。此外，其有助于中枢神经系统的发育和运作，并且其在信 号传导和精子发育方面具有主要功能。发现其与具体的膜蛋白或蛋白脂(‘刺 猬’蛋白)共价相连，这在胚胎发育中具有重要功能。

胆固醇酯，优选具有连接到羟基的长链脂肪酸(通常通过含有至少8个至 26个碳原子的脂肪酸制备)，比游离胆固醇的极性小得多，并似乎是用于在血 浆中的传输以及作为生物惰性储存(去毒)形态的优选形式。它们不有助于生物 膜，而是包装成为胞内脂质颗粒。

当需要用于膜形成和脂蛋白形成时，动物中的胆固醇酯水解酶从酯形式 释放胆固醇和游离脂肪酸。它们还为肾上腺细胞中的激素合成提供胆固醇。 已确定很多胆固醇酯水解酶，包括羧酸酯水解酶、溶酶体酸胆固醇酯脂肪酶、 激素敏感性脂肪酶和肝细胞内胆固醇酯水解酶。这些酶位于不同组织和细胞 器中，并具有多种功能。

发明人公开了一种新型递送技术，其将分子包裹到被称为胆固醇体的胆 固醇酯颗粒中，并且当该颗粒经口被肠道细胞吸收后，其进入乳糜微粒中以 通过淋巴运输被递送至所有体细胞。当该纳米颗粒从乳糜运输微粒中被细胞 摄取后，胆固醇酯水解酶卸下该颗粒并在胞内位点释放分子。

本申请中胆固醇体结构的相关背景信息可见于2007年3月20日递交的、 题目为“药物递送方式”的美国专利申请文件20070225264。

此处所用的交错(interdigitation)的原理为本领域技术人员已知。例如参见 Yeagle,TheStructureofBiologicalMembranes(CRCPress2010)。

“乳糜微粒”为非常大的、非均质、富含脂质的颗粒，其直径在约750至 约40,000nm的范围内。它们在GI道的肠上皮细胞中形成，并具有通过血流 中的循环向细胞传输膳食脂肪和脂溶性维生素的功能。图1中显示了由胆固 醇体和其它脂质颗粒形成乳糜微粒的图。所分泌的乳糜微粒的尺寸不均匀性 取决于脂肪吸收速率、所吸收的脂肪的类型和量。当胆固醇体非常大时，所 得的包含这些大型胆固醇体的乳糜微粒也可较大。

“胆固醇体”在GI道的不利条件中稳定，具有较大的设计灵活性，且对多 种分子呈现出较大的包裹效率，并具有易于制备的优点。在表1中强调了这 些有利的胆固醇体的性质，其中比较了多种递送系统。胆固醇体与脂质体之 间的结构差异使得胆固醇体具有不同的物理和化学性质，并因此使得它们在 希望的性质和功能方面具有优越性。例如，已显示胆固醇体在2至13的较宽 pH范围内稳定。相反，根据2005年在JournalofMolecularstructure中一篇描 述脂质体的综述文章中所述，“由于脂质体对胃液(pH1.9)、消化道中的酶以 及肠道中的胆汁酸(pH8)的抵抗力较差，它们的经口给药是无效的。”胆固醇 体抗pH降解，并因此能够被用作分子经口递送的首选方式，这是本发明的 一个尤其新颖的方面。

“负载物质的胆固醇体”是指包裹有药物活性剂并将该试剂主要(尽管并 不必一定是排他性的)包含在胆固醇体囊泡的芯中的胆固醇体。

其次，基于胆固醇酯的相互作用的结构特征产生经计算与PEG表面相似 的静电表面性质，而脂质体使用该PEG表面以在血液系统赋予更长时间。这 使得胆固醇体中所含的药物或分子在体内停留时间更长，通常这是药物递送 系统的优点，但如果当分子无法从药物递送纳米颗粒中释放时则不一定是优 点。

关于这一点的证据是，Zeta电势测量显示胆固醇体具有中性表面。在一 种制剂中，胆固醇体具有-14的Zeta电势测量值，这是典型的未负载形式的 胆固醇体自身的中性电荷。Zeta电势的中性电荷边界是指，具有约-20至约+20 的Zeta电势，通常约-40至+10、-5至+5或约0。对中性表面电荷的需要导致 在其它类型的制剂中使用PEG。在各发明的实施方案的某些比较中，胆固醇 体接近PEG的中性表面。

胆固醇体的结构修饰是基于改变酯的摩尔比，这造成不同的内部和外部 表面性质，并且在胆固醇体中，这些性质并不是由机体通过亲水/疏水隔离 (sequestration)来限定的(如在脂质体以及其它现有技术中的递送方式中那样)， 并因此更易于限定和制造(尺寸受到超声的影响、通常受温度影响、通常受pH 影响的证据(中性pH的水溶液在用于包裹的分子上具有不同电荷，这可影响 它们限定脂质纳米颗粒尺寸的能力))。在以下表1中总结了所有这些有利性 质，并将其与其它递送系统比较。

如表1所示，胆固醇体与其它递送方式的比较证实，在所有种类中，胆 固醇体具有优势，或至少效果相当。该比较的一个尤其重要的方面在于，几 乎所有分子都可被包裹到胆固醇体中，而不会对分子自身产生改变。其它递 送系统不具有该特征，它们趋于对分子自身具有特异性。设计灵活性是药物 递送系统的一个有利性质，而本发明明确地显示出了这一点。

表1

胆固醇体与其它常用药物递送方式的性质比较

在上表1中，合成聚合物通常是指例如PEG化的技术。载体蛋白是指附 着的生物分子，如病毒载体。PEG化和载体蛋白构造体都是静脉内给药，并 且与脂质体类似，如果以口服给药的话则不会被吸收，主要是因为它们在GI 道中被降解。

胆固醇体相对于脂质体的负载性质

即使当使用亲脂性分子(如多柔比星)时，脂质体也很少负载即使1％的重 量:重量。而如此处另外所述，发明人所开发的胆固醇体经常会负载至少20％， 理论上还可更高。

脂质体不负载蛋白质，但胆固醇体优先负载蛋白质。

脂质体不负载有效量的蛋白质、遗传物质(多核苷酸，如DNA和/或RNA， 如此处另外所述)、肽(尤其包括多肽，如单克隆抗体)和包括大分子抗体的很 多大分子(低于2％，意味着如果包裹100至1000mg的剂量，则载体的量会 非常大，而上述剂量是肽或单克隆抗体的典型剂量)。很多水溶性且带有正电 荷的分子不容易被负载到纳米颗粒中，如磷脂基脂质体。相反，胆固醇体的 内部(核)相对于包裹膜来说尺寸较大，其亲水但是为中性的，这是可与负载蛋 白质、肽、基因以及带有电荷的亲水性小分子相容的系统。由于所有这些分 子都无法穿过GI道屏障，胆固醇体的使用首次提供了口服吸收的蛋白质和肽 的前景。

胆固醇体的中性电荷相对于脂质体的正电荷

脂质体无法完整穿过Caco-2肠上皮细胞屏障，事实上，在GI道中很多 都被分解打开，从而收获其各自的磷脂成分。因而脂质体及其有效负载物无 法被肠上皮细胞摄取，这可能是由于它们的表面电荷。胆固醇体是由胆固醇 酯组成，其已经通过胆固醇酯酶转换为可吸收的部分。由于它们是由胆固醇 酯组成，胆固醇体已经是中性颗粒，并且优选以这种形式被十二指肠的肠上 皮细胞完整吸收并用于形成乳糜微粒。只要包囊的分子完全位于中空中心内， 胆固醇体就被完整摄取并在肠上皮细胞的高尔基体内完整进入乳糜微粒。

脂质体不穿过细胞膜

脂质体不仅无法与其负载物一起被口服吸收，它们还无法进入细胞，并 且确定的是，当其表面上缺少APO时，其无法与需要脂质的细胞对接。当通 过静脉内注射时，脂质体被肝脏收获，并在那里被分解为其磷脂成分。通常 这不会为其内容物提供胞内递送，尽管当靶细胞为肝细胞时肝脏内较高局部 浓度的负载分子可能提供好处。

脂质体及其内容物不进入乳糜微粒

脂质体的磷脂包衣在GI道内被降解，并因而在到达十二指肠吸收位点之 前脂质体自身就被降解，且其内容物在GI道中被释放。因而即使蛋白质可被 负载到脂质体中，在其被肠上皮细胞吸收之前就与脂质体一起被破坏。由磷 脂组成的脂质体无法进入到乳糜微粒中。

胆固醇体自身不进入细胞

当以静脉内给药时，胆固醇体不会与细胞对接，因为它们缺少与细胞对 接所需的表面载脂蛋白。然而，细胞膜似乎确实圈住了胆固醇体，并且由于 该优点，胆固醇体的肠胃外使用不允许某些分子被胞内摄取。如果同样的胆 固醇体被经口给药，则胞内摄取量会大得多。还优选包括阴道给药在内的局 部给药。

胆固醇体在口服吸收后明显使得细胞摄取量更大，因为它们首先进入乳 糜微粒中。然后乳糜微粒选择性地将脂质递送到有该需求的细胞中。有需要 的细胞表达对接位点蛋白，该蛋白之后可与乳糜微粒表面上的APO-B相连， 因而发生对接，并从乳糜微粒释放到该细胞的细胞质中。此外，由胆固醇体 形成的乳糜微粒在到达每个细胞的表面上具有载脂蛋白识别性质。当乳糜微 粒与细胞接触时，它们与表达表面蛋白的细胞对接，并因而要求运送包括甘 油三酯和胆固醇酯的脂质。当从细胞分泌出脂肪酶后，所述脂质，如甘油三 酯和胆固醇体，与其包裹的负载物一起被细胞摄入。

相反，当脂质体被注入血液中时，不会期望它们与细胞对接，因为它们 缺少用于与需要脂质的细胞对接的ApoE组分。脂质体在药物递送中用于使 分子产生延长的血浆释放特性。此外，在有利条件下，当脂质体缓释系统中 包裹的药物进入细胞时，则期望存在负载物的胞内递送，而这是由于药物被 从负载脂质体中释放后其自身的性质。

负载物质的胆固醇体的配制–本领域技术人员可以很容易地寻找任何 分子并预测应使用何种胆固醇酯来形成胆固醇体

以几个阶段形成胆固醇体，首先通过将选定的一对胆固醇酯溶于有机溶 剂(如醚)中，然后除去有机溶剂，并接着加入含有待包囊的分子的水性成分， 进行超声以形成单层膜，并在水中分子周围产生亲水的且相对不带电的中空 袋。

所有配制阶段都是在严格限定的温度下在水浴中进行，该温度是基于酯 的最低熔融温度。操作温度是选择胆固醇酯对(cholesterylesterpairs)的首要条 件，因为所选择的酯对的熔融温度必须等于或低于会使选定用于包裹的分子 降解的温度。考虑到温度限制，必须选择在低于40℃的温度下形成双层膜的 胆固醇酯对，而这是在该公开的发明中很多包裹的单克隆抗体的实施例中选 择肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的基础。

图2描述了月桂酸胆固醇酯/肉豆蔻酸胆固醇酯(1:1摩尔浓度)胆固醇体 的三维模型。如图3和4所示，胆固醇体可具有较宽范围的尺寸。可通过计 算确定活性成分负载量，如图15和16中所示。

一旦加入水性分子或构造体，就对混合物进行超声，直到形成混浊溶液， 从而使由未溶解的酯产生的废物最少，同时超声提供了用于形成单层囊泡的 能量。在加入前，水性成分也被保持在目标温度，并且如此前所述，对于多 数肽、蛋白质和基因，可承受的最高温度仅为约40℃。

然后过滤该溶液，并保存滤液进行挤出，以使尺寸统一。然后将该样品 储存在冰箱中。

刚刚包囊的分子被单层胆固醇酯囊泡所包围，并且在中空袋内部，包囊 的分子被保护，从而不与GI道的不利环境接触，并且远离免疫系统的酶和细 胞。内部分子保持不变。因此，依照本发明提供负载物质的胆固醇体是一种 容易且常规的手段。

胆固醇酯链长度

胆固醇体的外膜由胆固醇酯组成，该胆固醇酯排列以形成基于胆固醇酯 的脂质纳米颗粒，通常情况下，多种胆固醇酯具有相同或类似的分子长度， 从而围绕由所述胆固醇体包裹的大分子形成均匀的囊。只要它们可共溶，则 胆固醇酯可具有不同长度，这使得它们彼此聚集以形成囊泡，该囊泡具有相 对于脂质纳米颗粒的总尺寸相对较大的中空芯。事实上，一些结构具有占全 部纳米颗粒的超过80％的芯，这对于水溶性分子(如胰岛素)的高负载量是有 利的。

这是基于不同摩尔分数的不同酯能够以最低能量构象共存且聚集的能 力，其中囊泡的形成由胆固醇酯的性质及其相对摩尔分数决定。

图29中示出了围绕分子(该情况中为胰岛素)组装的纳米颗粒。这里，链 以环状形式构造，从而形成具有中性或极少负电荷的中空中心(进行Zeta电势 测量以限定该性质，如每种所公开的制剂的实施例中所示。胆固醇体本身具 有-14的Zeta电势读数)。

当胰岛素位于胆固醇体内时，其Zeta电势进一步变为负性。与脂质体相 反，胆固醇体包裹的制剂不具有较高的正电荷，而在脂质体中，在一些实验 中Zeta电势范围可高达+76。

在该实例以及其它实例中，胆固醇酯可具有不同长度，只要它们是共溶 的，而这将允许其聚集在一起形成单层囊泡。这是基于不同摩尔分数的不同 酯能够以最低能量构型共存并聚集的能力，其中纳米颗粒的中空芯由胆固醇 酯的性质及其相对摩尔分数决定。

考虑到胆固醇体的组装，并参照图2的3D图，首先假设胆固醇体基质 的内部和外部结构相同，因为固醇核指向腔室内和外部表面二者。

可通过选择胆固醇酯来改变的是酯尾部的长度。具有更短的尾部长度使 得固醇核彼此更加接近，并减弱了囊泡的疏水性质(由于链长度)。这可具有对 胆固醇体的亲水性增强的影响。可对此进行模拟，实例示于图6和7中。

此外，假设脂质纳米颗粒内芯的相同包装与链长度无关，围绕更大分子 的更短链会增加分子与脂质的质量比。显然，更大的分子需要更大的内芯， 并因此酯链长度对用来适应更大分子(如单克隆抗体)的更大胆固醇体的构造 来说是重要的。

与这些考虑平衡的是，酯链长度对内芯的相对疏水性的影响。更长的酯 链增加了疏水特性，并允许在芯中包装更疏水的分子。

还存在胆固醇酯基质与溶剂的相互作用的问题。总体来说，包括乙醇的 水性溶剂组合可有助于包裹过程，并增加固定比例的胆固醇酯的包裹量。这 是构造体的电荷与胆固醇体内芯电荷的影响。

例如，在氧化固醇的晶体结构中，通过加入醇(如乙醇)来改变溶剂比有助 于使得氧分子彼此接近，这有助于酯在胆固醇体内的定向，并且还有助于使 分子更容易进入胆固醇体的芯中。

在模拟这些相互作用时，发明人可检查胆固醇酯基质结构的模型，并预 测对具体分子或药物来说何种酯是最佳选择。当同时考虑酯之间的相互作用、 电荷、溶剂和分子时，可存在系统性的方法。

颗粒尺寸对靶标的影响

根据大分子成分的离子和物理化学特性，胆固醇体成分的混合物以新颖 的方式各不相同。负载物质的胆固醇体的尺寸通常影响靶标，因为某些胆固 醇酯(当形成胆固醇体时)更适于递送某些分子的靶标，因此影响酯链长度。

电荷与分子形态如何影响胆固醇体的尺寸

具有更大的净正电荷的更大分子需要更长的胆固醇酯链长度以优化包 裹，前提是在包裹过程中熔融温度与被包裹分子的稳定性相容。具有更低的 净正电荷的更小的分子可被具有更短链长度的胆固醇酯包裹。调整胆固醇酯 的链长度以提供基于本发明的胆固醇酯的脂质纳米颗粒属于常规技术。

所述胆固醇体的表面可以是光滑的或粗糙的，这取决于成分平衡和混合 物的特性。囊泡表面的特性将取决于酯本身以及酯之间的相互作用。希望酯 聚集以优化分子相互作用并减少其间的空穴或空间。因此这些排列可产生粗 糙表面。

本公开的图中的多数图例都具有粗糙的构象，这是因为酯本身排列以使 得结构成分在囊泡表面上彼此交错，从而产生不均匀的结构排列(粗糙的)。在 一些情况中，酯本身排列从而对齐，以产生具有恒定形状和尺寸的表面(光滑 的)。

最终表面构象的性质将取决于所用的酯及其在制剂中的相对浓度的组 合。总结来说，酯的选择以及分子的选择影响脂质纳米颗粒的最终排列。尽 管各种成分均影响表面构象，但新的表面性质，即允许被肠上皮细胞摄取的 中性表面自身，应是最终制剂中所选定的分子电荷的净效应。表面应一直是 中性的。

所形成的胆固醇体以及所述实例的性质

为了使包裹优化，具有更多净正电荷的更大分子需要更长的胆固醇酯链 长度。

与较大水溶性大分子(如蛋白质和肽)一起使用的优选的胆固醇酯为通过 C₈至C₂₆饱和或不饱和脂肪酸的酯化(或提供相应胆固醇酯的相关过程)而制 备的那些胆固醇酯，通常该脂肪酸为选自以下的脂肪酸：肉豆蔻脑酸、棕榈 油酸、萨芬酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反式亚麻酸、α-亚麻酸、 琥珀酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉 豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、蜡酸或其混合物。

混合超过一种(优选两种)胆固醇酯以形成胆固醇体可适应具有不同递送 特性的不同大小的活性分子。

图2描述了月桂酸胆固醇酯/肉豆蔻酸胆固醇酯(1:1摩尔浓度)胆固醇体的 三维模型。如图3和4所示，胆固醇体可具有较宽范围内的尺寸。可通过计 算确定活性成分负载量，如图15和16中图例所示。

已讨论了现有技术的递送方法，这些方法被试图用于蛋白质和肽，但并 未成功，这使得本领域技术人员理解，此前的递送方法不具有使蛋白质在人 类患者中成功经口使用所必需的多数重要的实施方案。通过本公开，本领域 技术人员还可明了胆固醇体是如何解决每一种以及所有此前关于口服吸收以 及在进入乳糜微粒中后递送至体细胞的缺陷。

例如，图5描述了由胆固醇体介导的FITC向MCF7癌细胞的递送，证 实本发明能够将活性成分递送至治疗位点，该递送需要精确的活性成分靶向。 此后的实例显示了更多以图5的方式穿过细胞膜的胆固醇体制剂，但事实上， 当胆固醇体被肠上皮细胞吸收并然后完整进入乳糜微粒时，细胞内的递送会 更多。还将显示具有更多的胞内渗透的实例。

对于各分子，具体的商业机会为：

已知对于此前公开的递送方法以及涉及在制剂中的脂质的组合物，不穿 过胃肠道的肠上皮细胞，不进入乳糜微粒中，并且不穿过多数细胞的膜。

根据种种现有技术，胆固醇体包裹所带来的先进能力是意想不到的。简 单来说，还没有递送系统在经口递送大的亲水性分子(尤其是大分子，如多肽 (尤其包括单克隆和多克隆抗体)、蛋白质和多核苷酸，该多核苷酸尤其为 RNA(包括小型干扰RNA、小型发夹RNA、微RNA)和DNA(尤其包括质粒 DNA和裸露DNA))方面能够顺利起作用。

在这些分子中，由于在疾病治疗中长期使用的需要，存在优选的备选物， 这仅仅是因为现在它们必须被注射，而当形成胆固醇体后，它们可经口给药、 或作为油膏或乳剂涂抹在皮肤上、或作为脂质纳米颗粒被吸入。它们将被公 开。

胆固醇体促进的大分子向细胞中的两步递送

在本发明中，如图1所示，在配制和生物处理的两步连续步骤后，可将 大分子(如胰岛素)递送至体细胞内。在第一步中，我们制备了胆固醇体，并在 所形成的胆固醇体中包裹所述大分子，充分认识到该胆固醇体必须由被选定 与每种所选择的分子相容的具体胆固醇酯构成。还必须选择胆固醇体的胆固 醇酯组分以确保在十二指肠肠上皮细胞的表面上存在运载体。当十二指肠的 肠上皮细胞使胆固醇体-大分子构造体进入乳糜微粒并将这些现已负载并刚 刚被转化的乳糜微粒分泌到淋巴流体中时，在该大分子递送系统的制剂中发 生第二步骤，其中所述淋巴流体将乳糜微粒带到胸导管中，并最终在所述患 者的血液中循环。

由于在乳糜微粒中加入APO-B而产生的对接

当含有负载物质的胆固醇体(其含有活性分子负载物)的乳糜微粒与需要 胆固醇和甘油三酯的细胞对接、并无需内体(endosome)包裹就将包含所述胆 固醇体的所述成分转移至细胞中时，实现了被包裹到胆固醇体内并进入乳糜 微粒内的大分子的胞内递送。本方法的其他新颖之处在于，随着外表面胆固 醇酯在细胞质中被除去、并因而将分子从其胆固醇体递送囊中释放出来，该 掺入大分子的胆固醇体以完整形式被释放到细胞的细胞质中。只要该胆固醇 体的表面还被靶细胞识别为所需的胆固醇酯，该靶细胞就会接受负载物，并 且在通过胆固醇酯水解酶分解表面后，该大分子就会在靶标体细胞的膜内部 被释放。

由图22中的MCF-7细胞的图像可见，几乎总是存在一些来自单独的胆 固醇体的分子被摄入，如图5中的胆固醇体包裹的FITC(对照)所示。然而， 当FITC胆固醇体被首先暴露于Caco-2细胞并在装置底外侧收集所得FITC- 胆固醇体-乳糜微粒(如图17所示)、然后将其用于暴露于MCF-7细胞时， MCF-7细胞的差示(differential)摄取意想不到地更大(至少大1000倍)。应注意， 使用相同量的FITC-胰岛素-胆固醇体在Caco-2细胞上制备这些FITC-胰岛素 -胆固醇体乳糜微粒，因此几乎所有FITC-胰岛素-胆固醇体都被Caco-2细胞 结合到FITC胰岛素乳糜微粒中。

将胆固醇体载入乳糜微粒中

通过高尔基体将胆固醇体及其分子负载物载入乳糜微粒中的过程似乎是 定量的，通过再次测量Caco-2的顶侧并从其中减掉在底侧的乳糜微粒中回收 的量中的残留量证实了这一点。因而Caco-2细胞对胆固醇体的亲合性似乎很 高。Caco-2细胞使所有顶侧上可获得的胆固醇体都转化到底侧上的乳糜微粒 中。因而，先前选择用于包裹活性分子的胆固醇酯是本发明的实践中一个重 要步骤。

在GI道中保护分子负载物免受酸和/或酶的降解

胆固醇体在2至14范围内的pH值下保持完整，与之相反，脂质体在该 相同条件下被迅速降解，并与本申请的组合物相比相对不稳定。如果必须保 护其负载物组分免于在胃肠道中被降解，则可用以肠道为靶标的外层包裹与 不稳定负载物一起制备的胆固醇体，从而使得该负载物质的胆固醇体到达十 二指肠(肠上皮细胞的GI位点，其产生了结合胆固醇体的乳糜微粒)。

例如胰岛素和其它蛋白质/多肽的负载物是酸不稳定的，因此需要在被用 于动物或体内系统(其中可能发生酸降解或酶降解)中之前施加保护胆固醇体 中的胰岛素的肠溶包衣的额外步骤。在本领域实践的通常情况下，当胆固醇 体的内容物是酸不稳定的肽和蛋白质、且当这些产品在用于经口吸收的制剂 中被胆固醇体包裹时，最终产品应与肠溶包衣一起给药，从而保护胆固醇体 的内容物免受胃内的酸的影响。在多数情况中，当胆固醇体在十二指肠中被 释放后，存在在十二指肠中被酶降解或发生胆汁盐介导的皂化的可能性，因 此需要进行单独的胆固醇体与胆汁盐、胰脂肪酶和胰酯酶接触时的稳定性研 究。因此除非或者直到蛋白质或肽被确切证明不会被酸降解，否则该剂型将 是填充有胆固醇体构造体的小胶囊，其之后被肠溶包衣包裹，从而在pH5.5 至6.0时释放其内容物。用于此目的的合适的包衣可为丙烯酸树脂(Eudragit) (64，65)或其它对酸稳定但具有与丙烯酸树脂聚合物相似的降解特性的肠溶聚 合物，并且尽管胆固醇体自身在低pH下稳定，仍需要使用本领域已知的肠 溶包衣来保护胆固醇体的内容物免于被酸降解。

在某些实施方案中，药物组合物为单层囊泡，其具有约100至约750nm 的直径，优选约225至约275nm，更优选约250nm。DLLS测量表明囊泡具 有50nm至超过1000nm范围内的直径。所用的最终尺寸可通过合适孔径的 选择性挤出，以及通过控制超声时间以及其它制备参数而获得。

“免疫胶束”以及“胶束”为由水中或水性溶剂中的两性分子形成的聚集 体，以使它们的极性尾端或极性部分与水或水性溶剂接触，且其非极性尾端 或非极性部分位于聚集体内部。胶束可具有任何形状或形式，包括但不限于： 不包裹部分水或水性溶剂的非层状“去污剂(detergent)类”聚集体、或包裹部 分水或水性溶剂的单层或多层“囊泡类”聚集体，后者例如脂质体。在“胶 束”的定义中具体包括的有小单层囊泡或脂质体(“SUV”)、小多层囊泡或脂 质体(“SMV”)、大单层囊泡或脂质体(“LUV”)和大多层囊泡或脂质体 (“LMV”)。

如美国专利申请文件20110268653中所定义的，“脂质颗粒”是指具有膜 结构的颗粒，其中两亲脂质分子排列为其极性基团朝向水相。该脂质膜结构 的实例包括如脂质体、多层囊泡(MLV)和胶束结构的构型。‘脂质体’是指封 闭纳米球，其通过在水中形成磷脂分子的双分子层膜并封闭该双分子层膜的 尾端而形成，其中磷脂分子的疏水性部分位于内部，且亲水性部分位于外部。 脂质体的实例包括具有由磷脂双分子层膜形成的单层的纳米球，和具有由多 个磷脂双分子层形成的多层的纳米球。由于脂质体具有该结构，因此在该脂 质体的内部和外部都存在水溶液，且脂质双分子层起到了边界的作用。‘胶 束’是指两亲分子的聚集体。胶束在水性介质中具有这样一种形式，其中该 两亲分子的亲脂性部分的位置朝向胶束的中心，且亲水性部分的位置朝向其 外部。在该胶束中，球体的中心是亲脂性的，且外周部分是亲水性的。胶束 结构的实例包括球状、层状、柱状、椭圆体、微粒体和片层结构以及液态晶 体”。注意该结构很难包裹亲水性分子，如蛋白质和肽，其负载量为1:1000 或更差。这与具有亲水性中心(源自酯官能团的取向)和疏水性外侧的胆固醇体 相反。在某些实施方案中，内部和外部可相同，其中固醇核位于外表面和内 腔室上，而酯尾端在分子的假双分子层类型中交错。当乳糜微粒摄入胆固醇 体时，真正亲水的外侧通过被转化且负载的乳糜微粒的载脂蛋白组分被重建， 且该载脂蛋白还有助于该转化的乳糜微粒与细胞的对接。简单来说，相对于 此前的努力，胆固醇体以两个阶段形成乳糜颗粒的这一过程是完全新颖且意 料不到的。

术语“患者”或“受试者”在说明书中被用于描述向其提供本发明的组 合物的治疗(包括预防性治疗)的动物，优选人类。对于那些专属于特定动物(如 人类患者)的感染、疾病状况或疾病状态的治疗，术语患者指的是该具体动物。

此处所用术语“化合物”是指任何具体的或此处所公开的化学化合物。 当在文中使用时，该术语通常是指此处所公开的单个小分子，但在某些例子 中也可指所公开化合物的立体异构体和/或光学异构体(包括外消旋混合物)。 术语化合物包括化合物的活性代谢产物和/或其药物活性盐。

术语“活性分子”、“活性剂”或“活性化合物”应指任何在生物系统中 具有活性且可被掺入此处所述的胆固醇体中的分子。本发明的胆固醇体能够 容易适应大量活性化合物，包括小分子和大分子，尤其包括在其它情况下无 法有效被口服递送的化合物。这是由于负载物质的胆固醇体在递送活性化合 物时提供的独特机制(如此处所述)，其通过肠上皮细胞进入乳糜微粒，并然后 进入向其给药该负载物质的胆固醇体的患者或受试者的细胞中。这些活性分 子包括在标准口服递送技术中不稳定并通常仅能以肠胃外给药的小分子、和 大分子，如蛋白质(包括糖蛋白)和多肽(如胰岛素、干扰素、hCG、C-活性蛋 白、包括各种白介素的细胞因子、生长因子)，包括抗体(如多克隆抗体、单克 隆抗体(如此处其它地方所述)、抗体片段(单链可变片段或scFv、抗原结合片 段或Fab、₃G抗体))、免疫原性多肽和寡肽的其它多肽、多核苷酸(包括DNA 和RNA，如裸露DNA、质粒DNA、mRNA、siRNA、shRNA、双官能shRNA、 微RNA(其中包括miR-122)以及DNA和RNA的各种寡核苷酸)。也可通过本 发明递送多种抗感染剂，包括抗生素(如万古霉素和青霉素)和抗病毒剂以及其 它活性分子，尤其包括大分子抗生素以及此处详细公开的多种抗癌剂。注意 依照本发明的胆固醇体事实上可用于递送具有各种尺寸和分子量的任何活性 分子。本发明的胆固醇体还可用于局部递送一些活性分子以通过患者或受试 者的皮肤提供较高的生物利用度，其中包括局部抗生素、局部抗真菌剂、局 部血小板衍生的生长因子、其它生长因子、用于牛皮癣的局部抗TNF以及例 如局部疫苗和美容剂的局部递送，等等。可将多种化疗剂、抗生素和抗病毒 剂掺入到本发明的胆固醇体中。根据本发明的胆固醇体特别适合这些化合物， 甚至是小分子，因为通过本发明的组合物依照活性分子递送机制将化合物递 送到细胞中产生了对各种微生物，包括细菌和病毒，都十分有效的疗法。

用于本发明的抗真菌剂例如包括：咪康唑、特康唑、益康唑、异康唑、 噻康唑、白呋唑、克霉唑、酮康唑、布康唑、依曲康唑、奥昔康唑、芬替康 唑、制霉菌素、萘替芳、两性霉素B、齐诺康唑、环吡酮胺或其混合物。

用于本发明中的抗生素包括：氨基糖甙类，包括庆大霉素、硫酸庆大霉 素、卡那霉素、新霉素、奈替霉素、妥布霉素、巴龙霉素、大观霉素；安莎 霉素类，包括格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明和链霉素；碳青霉烯类，包 括厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和倍能；头孢菌素类，包括头孢 羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩/头孢金素、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟唑、 头孢西丁、头孢罗齐、头孢呋新、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌 酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他定、头孢布坦、头孢去甲噻肟、头孢三嗪、 头孢吡肟(Cefipime)、头孢洛林酯和头孢托罗；糖肽类，包括替考拉宁、万古 霉素和特拉万星；林克酰胺类，包括克林霉素和林可霉素；脂肽类 (lipopeptipdes)，包括达托霉素、奥利万星、WAP-8294A；大环内酯类，包括 阿齐红霉素、克拉仙霉素、地红霉素、乙琥红霉素、罗红霉素、泰利霉素和 乙酰螺旋霉素；单酰胺菌素类，包括氨曲南；硝基呋喃类药物、包括呋喃唑 酮和呋喃妥因；噁唑烷酮类，包括利奈唑胺、Posizolid、雷得唑来和泰地唑 利；青霉素类，包括阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青 霉素、双氯青霉素、氟氯青霉素、磺唑氨苄青霉素、甲氧苯青霉素、乙氧萘 胺青霉素、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、氧哌嗪青霉素、替莫西林和替 卡西林；青霉素组合，包括阿莫西林/克拉维酸钾、氨苄西林/舒巴克坦、氧哌 嗪青霉素/他佐巴坦和替卡西林/克拉维酸钾；多肽类，包括杆菌肽、可立其丁 和多粘霉素B；喹诺酮类/氟喹诺酮类，包括环丙沙星、氟啶酸、加替沙星、 吉米沙星、左氧氟沙星、洛米沙星、莫西沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、 曲伐沙星、格雷沙星、施怕沙星和替马氟沙星；磺胺类，包括磺胺米隆、磺 胺醋酰、磺胺嘧啶、碘胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异噁唑、柳 氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和磺酰胺柯衣定 (Sulfonamidochrysoidine)；四环素类，包括脱甲氯四环素、脱氧土霉素、多西 环素、米诺环素、地霉素和四环素；抗分枝杆菌类，包括氯苯吩嗪、卷曲霉 素、环丝氨酸、乙胺丁醇、利福平、利福布丁、利福喷丁、胂凡纳明、氯霉 素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普汀/达福普汀、 甲砜氯霉素、替加环素、替哨唑和甲氧苄氨嘧啶。

抗病毒剂包括本领域已知的抗HIV剂、抗HBV剂和抗HCV剂。抗HIV 剂包括3TC(拉米夫定)、AZT(齐多夫定)、(-)-FTC、ddI(地达诺新)、ddC(扎 西他宾)、阿巴卡韦(ABC)、替诺福韦(PMPA)、D-D4FC(Reverset)、D4T(司他 夫定)、Racivir、L-FddC、L-FD4C(艾夫他滨)、Festinavir、NVP(奈韦拉平)、 DLV(地拉夫定)、EFV(依法韦仑)、SQVM(甲磺酸沙奎那韦)、RTV(利托那 韦)、IDV(印地那韦)、SQV(沙奎那韦)、NFV(那非那韦)、APV(安泼那韦)、 LPV(洛匹那韦)、融合抑制剂如T20等、fuseon及其混合物，包括仍处于临 床试验或开发阶段的抗HIV化合物。

可用于本申请的其它抗HIV剂包括：不同NNRTI，其选自奈韦拉平 (BI-R6-587)、地拉夫定(U-90152S/T)、依法韦仑(DMP-266)、UC-781(N-[4- 氯-3-(3-甲基-2-丁烯基氧基)苯基]-2-甲基-3-呋喃硫代甲酰胺 (furancarbothiamide))、依曲韦林(TMC125)、曲韦定(Ly300046.HCl)、MKC-442 (乙米韦林、coactinon)、HI-236、HI-240、HI-280、HI-281、利匹韦林(TMC-278)、 MSC-127、HBY097、DMP266、黄芩苷(TJN-151)、U-104489或PNU-104489)、 卡普韦林、阿替韦啶、胡桐素A(NSC675451)、胡桐素B和膦甲酸(膦甲酸钠) 等。

可加入本发明的胆固醇体中的抗HBV剂包括：贺维力(Hepsera)(阿德福 韦二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、恩曲他滨、克来 夫定、valtoricitabine、氨多索韦、帕拉德福韦、racivir、BAM205、硝唑尼特、 UT231-B、Bay41-4109、EHT899、日达仙(胸腺素α-1)及它们的混合物。

可加入本发明的胆固醇体中的抗HCV剂包括：利巴韦林、干扰素、PEG 化的干扰素、波普瑞韦、达卡他韦、asunapavir、INX-189、FV-100、NM283、 VX-950(特拉匹韦)、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、 R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、 MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS9190、GS9256、GS9451、 GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、 TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GNI-104、 IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI201335、BI207127、BIT-225、 BIT-8020、GL59728、GL60667、PSI-938、PSI-7977、PSI-7851、SCY-635、 TLR9激动剂、PHX1766、SP-30及它们的混合物。

也在此后实施例中在以下描述了用于本发明的其它化合物。

在本发明中注意到，相比于通过现有技术方法递送的相同活性分子，向 胆固醇体中加入活性分子并将其给药至患者或受试者将在相同剂量水平产生 更大的疗效。实际上，将负载物质的胆固醇体包装到乳糜微粒中的机制使得 活性分子在其实际活性位点(细胞中)的量或浓度变得大得多，因而导致比现有 技术方法大得多的疗效。在很多例子中，相比于通过现有技术(现有)手段递送， 根据本发明被递送到细胞中的活性剂的量或浓度是其活性剂浓度的至少2 倍，通常为10倍到1000倍。

在说明书中使用术语“有效量”是用来描述制剂或其它成分的浓度或量， 该制剂或成分在其用途范围内的用量能够产生本发明预期的效果。该制剂或 成分可用于在所治疗的疾病或状况中产生有利改变，根据所治疗的疾病或状 况，该改变可为减缓、有利的生理结果、所治疗的疾病状态或状况的恢复或 减轻、避免或减少状况或疾病状态发生的可能性。当结合使用制剂时，每种 制剂都以有效量使用，其中有效量可包括协同量。本发明中所用的制剂量可 根据制剂的性质、患者的年龄和体中以及多种可影响制剂的生物利用度和药 代动力学的其它因素而变化，向患者给药的制剂量通常为每天约0.001mg/kg 至约50mg/kg或更多、约0.5mg/kg至约25mg/kg、约0.1至15mg/kg、约 1mg至约10mg/kg，以及此处所述其它量。为了避免疑虑，在对递送系统所 增加的质量进行校正后，给予所述动物的所述制剂中成分的剂量与通过肠胃 外手段给药的剂量大致相同。普通技术人员可以容易地认识到在治疗过程中 可对服药日程或剂量进行改变。

术语“共同给药”被用于描述有效量的两种以上活性化合物(在该情况中 为根据本发明的化合物)与另外的试剂或其它生物活性剂结合给药。尽管术语 共同给药优选包括同时向患者给药两种以上的活性化合物，但只要向患者或 受试者给药的化合物量能够在血液、血清或血浆中、或者在肺部组织中同时 产生有效浓度，则这些化合物实际上不必在完全相同的时间或在相同组合物 中给药(尽管这可以是优选的)。

术语“回肠制动激素释放剂”用于描述调节回肠内激素的营养物质。该 营养物质包括但不限于：蛋白质以及相关氨基酸、包括饱和脂肪、单饱和脂 肪、多饱和脂肪的脂肪、必需脂肪酸、Omega-3和Omega-6脂肪酸、反式脂 肪酸、胆固醇、脂肪替代物、例如膳食纤维(可溶性以及不可溶的纤维)、淀粉、 糖(包括单糖单糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、二糖二糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖 和醇)、包括菊糖和聚葡萄糖的聚合物糖、天然糖取代物(包括布拉齐因 (brazzein)、仙茅甜蛋白、赤藻糖醇、果糖、甘草酸、甘草酸、甘油、氢化淀 粉水解物、异麦芽糖、拉客替醇、马槟榔甜味蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、奇 果甜素、莫尼糖蛋白、潘塔亭(pentadin)、山梨醇、甜叶菊、塔盖糖、竹芋蛋 白和木糖醇)、食用淀粉(sahlep)和哈瓦(halwa)根提取物。D-葡萄糖(右旋糖)是 优选的营养物质。营养物质包括所有在消化后产生前述营养素或包括这些营 养素的组合物，包括该营养素的聚合形式。当这些组合物与患者的回肠相关 时，调节回肠制动激素，这通常导致活性增加，从而对一系列疾病状态和状 况提供有益疗效。在于2011年11月3日公开的美国专利公开2011-0268795 和于2010年3月11日公开的国际专利申请WO2010/027498以及于2013年 5月2日公开的WO2013/063527中详细描述了回肠制动激素释放剂的效果， 其可做为被合并于此的教导来参考。优选的回肠制动激素释放剂为在患者的 回肠中给药的葡萄糖，其剂量为约7.5g至约12g以上。

术语“回肠激素”包括所有与刺激所述激素释放的管腔内食物物质相关 的激素，该释放可由患者或受试者的回肠内的回肠相关的刺激(胰岛素分泌或 抑制高血糖素的分泌或本领域教导范围内的营养物质的递送)而造成。因此 “回肠激素”包括但不限于：GLP-1、肠高血糖素、C-末端甘氨酸扩展的GLP-1 (737)、(PG(78108))；干扰肽-2(PG(111122)酰胺)；GLP-2(PG(126158)、 GRPP(PG(130))、泌酸调节肽(PG(3369)和其它将被分离的肽片段、PYY (PYY1-36)和(PYY3-36)、胆囊收缩素(CCK)、胃泌激素、肠高血糖素和促胰 液素。

术语“营养物质的回肠激素刺激量”是指任何量的营养物质，所述量能 够有效在回肠中引发可检测的激素释放并引发由胰岛素分泌或抑制高血糖素 的分泌或其它效果(如关闭或减少胰岛素抗性并增加葡萄糖耐受性)的回肠或 回肠相关的刺激而产生的饱腹感反馈。因此，“营养物质的回肠激素刺激量” 可为不同剂量，其取决于多种因素，如组织处的具体营养物、给药所需要的 效果、减少卡路里摄入的所需目标以及向其给药该营养物质的受试者的特征。 例如，使用至少约500mg的D-葡萄糖，且D-葡萄糖的尤其优选的回肠激素 刺激量包括：约7.5-8g至约12-12.5g或更多(优选约10g)。

本发明的组合物中可包括的其它营养成分包括：大麦草，其已知为高度 可代谢的维生素和矿物质(如维生素A、B1、B2、B6和C、钾、镁和锌)的丰 富来源。此外，大麦草还具有高浓度的酶超氧化物歧化酶(SOD)，其被显示具 有高水平活性。大麦草被认为是消化过程调节中的重要营养物，因为认为大 麦草中所含的微量营养素、酶(如SOD)和大麦草中所含的纤维改善了肠道功 能。

紫花苜蓿的新鲜或干燥的叶茶也可用于本发明中，以促进食欲并作为叶 绿素和纤维的优良来源。紫花苜蓿包含生物素、钙、胆碱、纤维醇、铁、镁、 PABA、磷、钾、蛋白、钠、硫、色氨酸(氨基酸)和维生素A、B复合物、维 生素C、D、E、K、P和U。紫花苜蓿膳食补充物被推荐用来治疗消化不良， 并被显示在动物研究中降低胆固醇水平。紫花苜蓿被FDA归类为公认安全的 (GRAS)。剂量可在每天25至1500mg的干叶的范围内，优选500至1000mg。

小球藻是另一种可与其他营养物质(优选D-葡萄糖或右旋糖)组合用于本 发明中的物质，其为单细胞绿藻属，在水槽中生长并被收获，被纯化、加工 并干燥以形成粉末。小球藻富含叶绿素、胡萝卜素，并含有完整的维生素B 复合物、维生素E和C，并具有多种矿物质，包括镁、钾、铁和钙。小球藻 还提供膳食纤维、核酸、氨基酸、酶、CGF(小球藻生长因子)和其它物质。剂 量可在300至1500mg/天的范围内。

叶绿酸是另一种营养物质，其为已知的食物添加剂，并已被用作替代性 药物。叶绿酸是叶绿素的水溶性半合成的钠/铜衍生物，也是一系列通常旨在 减少与失禁、结肠造口术和类似过程相关的气味以及体味的内部摄取制剂中 的活性成分。其还可用作局部制剂，据称可用于伤口、损伤和其它皮肤状况(如 放射性烧伤)的治疗和气味控制中。

藻酸钠也可被用作营养物质，优选与D-葡萄糖或右旋糖组合。

术语“预防性”被用于描述此处所述的制剂用途，其降低了状况或疾病 状态在患者或受试者中发生的可能性。术语“降低可能性”是指这样的事实， 即在给定的一群患者中，本发明可用于降低在所有这群患者中的一个或多个 患者中降低疾病的发生、复发或转移的可能性，而非在所有患者中避免疾病 状态的发生、复发或转移。

术语“药学可接受”的是指该化合物的盐形式或其它衍生物(如活性代谢 物或潜药形式)或载体、添加剂或赋形剂，其对被给药的受试者并不具有不可 接受的毒性。

炎症相关的代谢病

“炎症相关的代谢病”包括但不限于：肺病、包括糖尿病和由胰岛素抗 性导致的疾病(如I型和II型糖尿病)以及严重的胰岛素抗性导致的高血糖症、 高胰岛素血症、和血脂障碍(如高脂血症(如肥胖受试者所表达的)、升高的低 密度脂蛋白(LDL)、降低的高密度脂蛋白(HDL)以及升高的甘油三酯)和与胰岛 素耐受性和炎症相关的肝脏(或肝)损伤(包括肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝疾 病、肝硬化、由病毒(如肝炎病毒A、B或C)或毒素导致的肝炎)、以及胰岛 素抗性糖尿病(如Mendenhall综合征、维尔默综合征、矮怪病和脂肪萎缩性糖 尿病)、肾病(如急性和慢性肾衰竭、慢性肾功能衰竭终末期、肾小球肾炎、间 质性肾炎、肾盂肾炎、肾小球硬化症，如糖尿病患者中的基-威综合征和肾移 植后的肾衰竭)、肥胖症、GH缺乏症、GH抗性、特纳综合征、拉龙综合征、 身材矮小症、增加的脂肪与瘦肉比例(fatmass-to-leanratio)、包括降低的CD4+ T细胞数量和降低的免疫耐受性在内的免疫缺陷和化疗导致的组织损伤、骨 髓移植、心脏结构或功能的疾病或缺陷(如心脏机能障碍和充血性心力衰竭)、 动脉粥样硬化、神经元疾病、神经学疾病或神经肌肉疾病(如中枢神经系统的 疾病，包括阿尔兹海默症或帕金森氏症或多发性硬化)、以及周围神经系统和 肌肉组织的疾病(包括周围神经病变、肌肉萎缩症或肌强直性营养不良)、以及 分解代谢状态(包括与由任何状况造成的消瘦相关的那些，所述状况例如包括 精神健康状况(如神经性厌食症))、如由细菌或人类病毒(如HIV、肝炎病毒C 或B)导致的外伤或创伤或感染、伤口、皮肤病、需要恢复的消化道结构和功 能等。

“炎症相关的代谢病”还包括癌症以及此处所限定的“传染性疾病”，以 及儿童的骨或软骨生长障碍(包括身材矮小症)、和在儿童和成人中的儿童和成 人软骨和骨疾病(包括关节炎和骨质疏松症)。“炎症相关的代谢病”包括两种 以上的上述疾病(如骨质疏松症，其为分解代谢状态的后遗症)。此处的治疗尤 其感兴趣的具体目标疾病为糖尿病和肥胖症、心脏机能障碍、肾病、神经学 疾病、骨病、全身发育异常和免疫紊乱。

在一个实施方案中，“免疫相关的代谢病”包括：向心性肥胖症、血脂障 碍，尤其包括高甘油三酸酯血症、低HDL胆固醇、低密度LDL颗粒和餐后 脂血症；葡萄糖不耐受，如空腹血糖异常；胰岛素抗性和高血压、以及糖尿 病。术语“糖尿病”被用来描述I型或II型糖尿病。本发明涉及改善胰脏功 能、肝功能、脑功能、胃肠功能、心血管功能、肾功能以及如此处另外所述 的在患有糖尿病的患者或受试者中功能受损后发生的状况和疾病状态的方 法。注意在I型和II型糖尿病中，肾功能受损是由于胶原蛋白沉积，而非由 于本发明所治疗的其它疾病状态中的囊肿所导致的。

分枝杆菌感染通常显示为例如结核病的疾病。自古以来由分枝杆菌造成 的人类感染已被广泛传播，且结核病至今仍是造成死亡的主要原因。尽管自 十九世纪中期以来，随着生活标准的提高，疾病的发病率下降，但在医疗资 源受限的国家中，分枝杆菌疾病仍构成发病和死亡的主要原因。此外，分枝 杆菌疾病可在免疫妥协的患者中造成无法抵抗的传播性疾病。尽管在世界范 围内无数健康机构都作出了努力，但从未实现消灭分枝杆菌疾病，也不会在 短期内将其消灭。世界人口的几乎三分之一被结核分枝杆菌复合物所感染， 其通常被称为结核病(TB)，每年产生约八百万新病例，且由TB可造成两百 万至三百万人死亡。结核病(TB)是单一病原可造成的人类最大死亡数量的原 因(参见Dye等,J.Am.Med.Association,282,677-686,(1999)；和2000 WHO/OMS新闻稿)。

越来越多地在AIDS患者所患的机会感染中发现除了结核分枝杆菌以外 的分枝杆菌。来自鸟-胞内分枝杆菌复合菌组(M.avium-intracellularecomplex, MAC)的微生物，尤其是血清型4和8，占从AIDS患者中分离的分枝杆菌的 68％。发现了大量的MAC(高达每克组织含10¹⁰个抗酸杆菌)，并因此，被感 染的AIDS患者的预后较差。

在很多国家中，仅有的控制TB的手段为接种牛型分枝杆菌卡介苗 (BCG)。然而，BCG对TB的总体疫苗效能为约50％，并且在不同的现场试 验间其在0％至80％的范围内大幅变化。多种耐药性结核分枝杆菌菌株的广泛 出现也是个问题。

结核分枝杆菌属于胞内细菌的组中，其在休眠的巨噬细胞的吞噬泡中复 制，因此对TB预防取决于T细胞介导的免疫。然而，在小鼠和人类中的一 些研究显示分支杆菌刺激了抗原特异性的、分别由II类或I类主要组织相容 性复合体(MHC)限制的CD4和CD8T细胞。缺乏β2-小球蛋白的小鼠无法控 制实验性结核分枝杆菌的感染，因而有力地证明了MHCI类限制的CD8T细 胞的重要作用。

如此处所用，术语“结核病”包含通常与分枝杆菌物种(包括结核分枝杆 菌复合体)所造成的感染相关的疾病状态。术语“结核病”也与由除了结核分 枝杆菌以外的分枝杆菌造成的分枝杆菌感染相关。其它分枝杆菌种类包括鸟 胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansarii)、偶发分 枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、 非洲分枝杆菌(M.africanum)、和田鼠分枝杆菌(M.microti)、鸟分枝杆菌副结 核(M.aviumparatuberculosis)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、瘰疬分枝杆 菌(M.scrofulaceum)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、海分枝杆菌(M.marinum)、溃疡 分枝杆菌(M.ulcerans)。

传染性疾病

“传染性疾病”包括但不限于由细菌、真菌、寄生虫和病毒试剂造成的 疾病。这些传染性试剂的实例包括以下几种：葡萄球菌、链球菌、奈瑟氏球 菌、球菌、肠杆菌、假单胞菌、弧菌、弯曲杆菌、巴斯德氏菌、博德特氏菌、 弗朗西丝氏菌、布氏杆菌、军团杆菌、类杆菌、革兰氏阴性杆菌、梭菌、棒 状杆菌、丙酸菌、革兰氏阳性杆菌、炭疽、放线菌、诺卡氏菌、分枝杆菌、 梅毒螺旋体、包柔氏螺旋体、钩端螺旋体、支原体、脲原体、立克次体、衣 原体、系统性真菌、机会性真菌、原生动物、线虫、吸虫、绦虫、腺病毒、 疱疹病毒、痘病毒、乳头状瘤多型空泡形病毒、肝炎病毒、正粘液病毒、副 黏液病毒、冠形病毒、微小RNA病毒、呼肠病毒、披膜病毒、虫媒病毒、本 扬病毒、弹状病毒、人免疫缺陷病毒和逆转录病毒等。

在某些实施方案中，“传染性疾病”选自结核病、麻风病、克罗恩病、获 得性免疫缺陷综合征、莱姆病、猫抓病、落矶山斑疹热和流行性感冒。

癌症

在说明书中使用术语“癌症”是指导致形成癌性肿瘤或恶性肿瘤(即通过 细胞增殖生长的异常组织，该异常组织通常比正常组织生长更快，且在引发 新的生长的刺激因素停止后继续生长)的病理过程。恶性肿瘤显示出部分缺少 或完全缺少结构组织和与正常组织的功能协调，并且多数侵袭周围组织，转 移到几个位点，并在被尝试摘除后有可能复发，且如果不被充分治疗则会导 致患者死亡。如此处所用，术语肿瘤被用来描述所有癌性疾病状态，且包括 或涵盖与恶性血液肿瘤、腹水肿瘤和实体瘤相关的病理过程。

本发明制剂中的成分

本发明的制剂可包括药学可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防 腐剂和/或助剂。可接受的制剂材料优选在所用的剂量和浓度下对受试者无 毒。药物制剂可含有用于改变、保持或保留例如pH、渗透性、粘度、透明度、 颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、组合物的吸收或 渗透的材料。合适的制剂材料包括但不限于：氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠 或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐 或其它有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸 (EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)； 充填剂；单糖、二糖、和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质 (如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲 水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐 剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对 羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙 二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普流罗 尼、聚乙二醇(PEG)、脱水山梨糖醇酯、聚山梨糖醇酯如聚山梨糖醇酯20和 聚山梨糖醇酯80，在该实施例中使用吐温(Tween)；吐温可用于在挤出步骤之 前改善乳剂的产率；可在被加入脂质之前向水性制剂中加入吐温，或向脂质 中加入吐温，然后加水。可使用最小量的吐温，即在10ml的水中小于约100 微升。Triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、或四丁酚醛)；稳定性增强剂(如 蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、 或山梨醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物助剂。例如参见 REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版,(A.R.Gennaro, ed.),1990,MackPublishingCompany。

本领域技术人员可根据例如预期的给药途径、递送形式和所需剂量确定 最佳药物制剂。例如参见REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES, Id。该制剂可影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清 除速率。

药物制剂中的主要媒介(vehicle)或载体(carrier)可包括但不限于：注射用 水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其中有可能加入其它在用于肠胃外给药的 组合物中常见的材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水为进一步的 示例性载体。药物制剂可包含约pH7.0至8.5的Tris缓冲液或约pH4.0至5.5 的乙酸盐缓冲液，其可进一步包括山梨醇或合适的替代物。可通过将所选择 的具有所需纯度的组合物与任选的冻干饼(lyophilizedcake)或水溶液形式的 配方剂(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,Id.)混合来制备本 发明的药物制剂以用于储存。此外，可使用合适的赋形剂(如蔗糖)将制剂配制 为低压冻干物。

制剂成分以给药位点可接受的浓度存在。使用缓冲剂，以有利于将组合 物保持在生理pH或略微较低的pH下，通常pH在约5至约8的范围内。

本发明的药物制剂可被肠外递送。当考虑肠胃外给药时，用于本发明的 治疗制剂可为无热源的、肠胃外可接受的水溶液形式。制剂包括所需的免疫 胶束制剂，其可提供之后可被通过积存注射而被递送的产品的控释或缓释。 具有透明质酸的制剂具有在循环中延长缓释持续时间的效果。

根据本发明的制剂可被配制为吸入用制剂。在这些实施方案中，隐形 (stealth)胆固醇体-分子制剂被配制为用于吸入的干粉，或也可通过用于烟雾递 送(如通过喷雾法)的推进剂配制吸入溶液。在PCT申请PCT/US94/001875中 进一步描述了肺部给药，其中描述了被化学修饰的蛋白质的肺部给药，并通 过引用合并于此。

制剂可被配制为用于在皮肤上局部施用。在这些实施方案中，隐形胆固 醇体-分子制剂被配制为油膏或乳剂，并被涂敷在皮肤表面上。

本发明的制剂可通过消化道递送，如口服递送，这代表了一种优选的给 药途径。该药学可接受的组合物的制剂于此处被公开，并落入本领域的技术 范围内。此处公开的以该方式给药的制剂可与常用于混合固体剂型(如片剂和 胶囊)的载体一起配制，或不与上述载体一起配制。胶囊可被设计为，当生物 利用度最大且系统前降解(pre-systemicdegradation)最小时在胃肠道中的某点 释放制剂的活性部分。优选对酸稳定但在十二指肠的pH(约5.0至6.0，或略 微更高)下可降解的肠溶包衣。这些是本领域已知的。可包括其它试剂以促进 吸收。也可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片 剂崩解剂和结合剂。

制剂可包含有效量的胆固醇体，最优选胆固醇体制剂与此处公开的药物 组合物中的分子在具有无毒赋形剂的混合物中，该赋形剂适合制造片剂。通 过将片剂溶于无菌水中或另一种合适的载体中，可以单位剂量形式制备溶液。 合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、 乳糖或磷酸钙；或结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸 镁、硬脂酸或滑石。

用于体内给药的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可通 过透过无菌过滤膜过滤来实现。在某些实施方案中，当该组合物被冻干时， 可在冻干和重新构建之前或之后使用该方法进行灭菌。在某些实施方案中， 用于肠胃外给药的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。在某些实施方案中， 肠外组合物通常被置于具有无菌通道的容器中，例如静脉注射溶液袋或具有 可被皮下注射枕头穿透的塞子的小瓶。

一旦配制了本发明的制剂，可将其在无菌小瓶中作为溶液、悬浮液、凝 胶、乳剂、固体或作为脱水的或冻干的粉末储存。该制剂可以随时可用的形 式或以在给药前重新配制的形式(如冻干)储存。

本发明的制剂的给药途径包括口服给药、通过静脉注射、腹膜内注射、 脑内(间质内，intra-parenchymal)注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射、 动脉内注射、门静脉内注射、或病灶内注射的途径；通过缓释系统或植入装 置。该药物组合物可通过弹丸注射给药或通过输液连续给药，或通过植入装 置给药。该药物制剂还可通过在所需分子被吸收或包裹的位置上植入膜、海 绵或其它合适的材料而被局部给药。当使用植入装置时，该装置可被植入或 被局部涂敷到任何适合的组织或器官中，且所需分子的递送可通过扩散、定 时释放弹丸(time-releasedbolus)或连续给药来实现。

如此处所用，“肠溶包衣”在低于约5.0至7.0至约7.6(优选约5.0至约 6.0或在该范围内略微更高)的范围的pH下基本不溶，并可由多种材料组成， 包括单不限于一种或多种选自以下的组合物：聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)、被 PVA(聚乙烯醇)稳定的壳聚糖(Chi)、脂质、藻酸盐、羧甲基乙基纤维素(CMEC)、 乙酸-1,2,4-苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、 羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、colorcon、食品釉和羟丙基甲基纤维素与 乙基纤维素的混合物、聚乙烯醇乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)、醋酸纤维素邻苯 二甲酸酯(CAP)、虫胶、甲基丙烯酸与丙烯酸乙酯的共聚物、和甲基丙烯酸与 丙烯酸乙酯的共聚物，其中在聚合过程中加入甲基丙烯酸酯单体。

可通过常规涂敷技术涂敷肠溶包衣，如衣锅包衣或流化床包衣、使用聚 合物在水中或在合适的有机溶剂中的溶液、或使用水性聚合物分散体。作为 替代性的实施方案，控释肠溶包衣可在芯上隔离其它的抗原和/或药物层；例 如在涂敷了控释物质后，可涂敷其它的抗原和/或药物层，随后涂敷另一层控 释层，等。例如，用于控释层的合适的材料包括(丙烯酸酯和甲 基丙烯酸酯的共聚物)、(丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚 物)、纤维素衍生物，如乙基纤维素水性分散体羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物、等。

在以下非限制性实施例中进一步描述本发明的这些和其它方面。

本申请的非限制性实施例

实施例1.逐步地：胆固醇体包裹的蛋白质、肽和遗产物质的一般制备 和测试

用于口服蛋白质或肽的胆固醇体

制备口服用药物分子、口服用蛋白质、口服用肽、口服用基因或遗产物 质的构造体(该实施例中术语“分子”此后被用于限定一种或所有这些分子) 以及测试所述分子在Caco2细胞中的吸收中的步骤如下所述：

1.制备胆固醇酯以及用于包裹的组合物成分；

2.获得用于包囊的分子，并测试纯度和在37℃至45℃下的稳定 性；

3.使用酯和分子间相互作用的计算机模型来优化胆固醇体混合物 中的胆固醇酯成分，以实现所述分子在胆固醇体中的最大负载；

4.制备胆固醇体包裹的分子并加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记以 进行包括显微镜检测在内的生物学研究，所述FITC标记并非用于人类 检测或治疗用途的产品的成分；

5.在Caco2细胞单层中测试FITC标记的分子，并收集乳糜微粒 包裹的FITC-胆固醇体-分子，其现被限定为掺入负载有胆固醇体的乳糜 微粒中；

6.将所测试的细胞暴露于含有FITC-胆固醇体-分子的乳糜微粒 中，并确定这些测试细胞对FITC-分子的摄取。尽管通常选择MCF-7 细胞，因为其容易使用并与癌症相关，但人们会理解，如果以细胞靶向 作用作为科学研究的对象，则可测试多种不同细胞系的摄取，因为很多 生物活性分子的胞内摄取都是新颖的，并且在药物递送领域的现有技术 中是意想不到的；

7.使用显微镜确定胞内FITC-分子是否被包含在内体中，或是其 在细胞质中游离；使内体成像的典型的时间点为最初暴露后约24小时。

8.使用GLUT-运载体的西部吸印表达来确定是否分子的胞内行为 被表达为细胞表面介导的由胞内分子的行为所控制的对其它物质或分 子的吸收；

9.用FITC-分子-胆固醇体制备pH5.5下释放的肠溶包衣胶囊，用 于向动物或人类给药(对于对酸敏感的蛋白质、肽、基因或活性构造体 (如疫苗或病毒)来说优选的口服给药形式)；

10.向小鼠或人给药FITC-分子-胆固醇体的口服剂型；

11.在步骤10的实验中，通过口服给药与肠溶包衣胶囊中的FITC- 分子-胆固醇体、静脉内给药相同剂量的FITC-分子-胆固醇体；静脉内 (IV)给药相同剂量的FITC-分子-胆固醇体；

12.在三种模式间比较给药FITC-分子-胆固醇体后对分子生物标 记效果的作用，其中在每种模式下分子的剂量都相同：

a.作为FITC分子胆固醇体口服，其产生负载有FITC分子 胆固醇体的淋巴乳糜微粒，与

b.作为FITC-分子胆固醇体被静脉内给药，其不形成乳糜 微粒，并且可能促进细胞对分子的吸收，也可能不促进，与

c.被静脉内给药的FITC-分子，但其不在胆固醇体中，并 因此不在乳糜微粒中。

13.使用荧光显微镜检查上述步骤12的三种给药模式(a与b与c) 下FITC分子在取自小鼠的组织中的生物分布。事后将被检查的组织包 括肝脏、肾脏、脑、胰脏、十二指肠、回肠、结肠、脾脏、肌肉、腹部 脂肪。期望可通过该方法实现分子较高的胞内浓度，且在细胞中的分布 将是均匀的，而非局限于内体或消化液泡。对分子效果的测量与胞内分 布曲线相关，并且将从效果测量中得出对不同剂量下的总体生物活性的 测量。

图12包裹有蛋白质的胆固醇体的结构

在图12中显示了作为一个实例的具有包裹的胰岛素的负载胆固醇体结 构模型。假设这些理想的脂质颗粒聚集成为脂质团块，该团块的粗略生成尺 寸为约1000至5000nm。在优选的实施方案中，将这些大颗粒挤出以形成均 匀尺寸的250nm颗粒。这可通过使用本领域已知的标准高压挤出装置来实 现。

实施例2胆固醇酯组合物和分层

对考虑用于制造胆固醇体的胆固醇酯的初步研究。

确定每种酯的熔点。例如，肉豆蔻酸酯具有65摄氏度的熔融转变温度， 在该温度以上固体成分熔化。

配制的目标是在低于熔融温度的温度下使用胆固醇酯。(与脂质体制剂一 致)，并考虑到在约40摄氏度的温度下蛋白质就开始变性。

对所选择的酯，即肉豆蔻酸酯和月桂酸酯进行进一步的温度测试。当在 旋蒸仪中从脂质中完全除去有机溶剂后，进行DSC，其显示出两个熔融温度， 一个是约60摄氏度，且第二个熔点为更高的温度。

基于这些发现，并考虑到所配制的蛋白质和肽的稳定性，将包裹过程的 操作温度保持在45至55摄氏度之间。

选择用于将分子包裹在胆固醇体中的胆固醇酯以及组合物

选择适于形成包裹囊泡的具体的胆固醇酯涉及一种新方法和计算机化的 分子模型。胆固醇酯的性质和用于包裹的靶分子与由围绕该分子的酯所形成 的囊泡的中空内芯之间的相互作用可被用来确定有利的胆固醇体-分子性质， 如负载量，其要么是基于体积比体积，要么是基于重量比重量。

所制备的内部没有负载分子的胆固醇体囊泡在挤出后具有250nm的平 均直径。该尺寸可作为胆固醇酯的尺寸、不同胆固醇酯混合物中的摩尔比、 过滤技术、超声时间和温度的函数来改变。

a.要求保护的形成胆固醇体的胆固醇酯包括：任何由胆固醇和脂 肪酸产生的胆固醇酯，其中脂肪酸包括饱和以及不饱和脂肪酸，其包括 但不限于下表2中的以下化合物：

表2.用于形成胆固醇酯的脂肪酸列表，其特征为结构、碳与双键数量之 比C:D比、以及双键位置

在上表中，C为碳数，D为脂肪酸分子的烷基链中的双键数，其中显示 了分子的C:D比。双键的位置被表达为羰基(其在链中为1位)之后的碳数。 在这种方式中，对于肉豆蔻脑酸，n-5意味着在14-5位＝9位处发现双键。

在本发明中使用术语“胆固醇”以描述任何可用于制备胆固醇酯的胆固 醇化合物，该胆固醇酯可用于形成依照本发明的胆固醇体。术语“胆固醇” 包括被认定为胆固醇自身的分子，以及任何具有其它氧化位点的相关胆固醇 分子(“胆固醇的氧化类似物”)，例如(但不限于)：7-酮基胆固醇、25-羟基胆 固醇、7-β-羟基胆固醇、胆固醇、5-α、6-α环氧化物、4-β羟基胆固醇、24-羟 基胆固醇、27-羟基胆固醇、24,25-羟基胆固醇。可改变氧化固醇中被引入的 氧化官能团的类型(过氧羟基、羟基、酮基、环氧基)、数量和位置以及改变其 立体化学性质。这些不同胆固醇可被用于提供胆固醇酯，其具有不同的溶解 特性，从而在提供具有中性表面的胆固醇体时提供一些灵活性，并提供可向 胆固醇酯分子中引入亲水性的基团。胆固醇型分子还可包括任何含有酯形成 所必需的OH的基于固醇结构的化合物，如维生素D。

对于上表2中所列出的任意对酯(当使用一对酯时)，有益的胆固醇体形成 中的摩尔比为0.05至0.95。近似相等烷基链长度的胆固醇酯对与活性分子之 间的组成产物比为约2:2:96至约48:48:4，通常为45:45:10至2:2:96、约40:40:20 至约5:5:90、约40:40:20至约25:25:50。注意在很多胆固醇体制剂中，当使用 两种(或更多种)胆固醇酯时，该比例可在所使用的胆固醇酯的1:1比例的上下 浮动。

要求保护的过滤技术包括用于进行初始尺寸选择的真空过滤，以及随后 用于进行细致尺寸选择的对制剂的挤出。

超声时间在30分钟至120分钟之间。该时间表示为一个范围，因为离心 时间是可变的。最佳超声时间取决于在超声仪中发现最佳超声点的能力，并 且在最佳时机，溶液形成混浊外观，且在此处通过裸眼观察所确定的固体材 料的量应最小。

当使用表2中的多数胆固醇时，产生胆固醇体囊泡期间的温度范围为35 ℃至45℃。在制备囊泡期间将温度保持恒定(+/-5℃)。将温度保持在任何单独 的酯的熔融温度之下。作为实例，对于使用肉豆蔻酸酯/月桂酸酯制备胆固醇 体，温度被保持在40℃+/-5℃。在超声前向混合物中加入少量增加了胆固醇 体的总产率，并帮助产生更均匀的颗粒。

通过举例的方式，以下原则定义了选择胆固醇体中的酯成分的基础、选 择酯或酯对以用于包裹目的的方式，并取决于表2中所列的胆固醇酯的所公 开的生理化学性质：

1)被选定结合的酯应能够将其自身排列为优化酯对之间的酯连接 相互作用。该静电相互作用对于取向目的来说是十分重要的，其中该囊 泡具有所需的疏水性外表面和亲水性中心。

2)烷基相互作用应能够优化范德华力。

3)静电相互作用和烷基相互作用范德华力的总和是保持囊泡形状 并因而保留分子在内部的基本性质。胆固醇体囊泡稳定性的其它关键因 素包括酯的双疏水性末端与含有被包裹分子的水性成分之间的排斥程 度。

4)囊泡的总大小变成烷基链的长度的函数。所选定酯的增加的长 度将增加整个囊泡的总体疏水特性。

5)使用较小链长度的酯将实际上增加囊泡的总体疏水特性(就每 种酯的总体结构而言)。

6)需要更多疏水性区域以帮助囊泡内的包裹的分子可受益于具有 更长烷基链的酯。

7)更小且需要更多亲水性成分以帮助包裹的分子将受益于长度更 短的酯对。

8)其它的选择是使用不饱和烷基链(如表2中所列的那些)，其中 这些脂肪酸被用于制备用来形成胆固醇酯的酯侧链。

9)不饱和脂肪酸的使用提供了对囊泡结构的额外结构修饰，其增 加了水和双键特性之间的额外的静电相互作用。

10)在选择用于形成囊泡的酯的过程中，CH₂链长的选择范围为， 例如从2个CH₂单元但低于27个CH₂的长度，所产生的结构可能不会 很紧密，这是由于使烷基链适应以使其在囊泡中的相互作用最大化的挑 战。囊泡壁的胆固醇成分不会改变。CH₂单元内的范德华力相互作用决 定了烷基相互作用的柔性。然而，为了有益的亲水性囊泡中心，在该囊 泡中的最佳构型为更长的烷基链，意味着较大的酯分子在组成稳定性中 具有更大的效用来稳定暴露于水性环境的更亲水的囊泡中心。

图6-7通过由选自表2的两种不同的胆固醇酯对形成的胆固醇体囊泡基 质的实例说明了分子模型图。在此处所选择的肉豆蔻酸酯-月桂酸酯基质实例 的图8-10中，发明人使用分子模型来说明对较小的水溶性分子头孢洛林的影 响。为头孢洛林所形成的胆固醇体对所选定的胆固醇酯对具有5:5:90的组成 比。在图11-13中，代表性的肽分子为胰岛素，一种6kd大小的一般来说为 水溶性的肽。在图14-15中，胆固醇体囊泡结构被用来包裹贝伐单抗，一种 大小约150kd的代表性单克隆抗体。在图16中，显示了所有三种与由肉豆 蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯形成的胆固醇体囊泡相关的代表性分子。

对于大于6个CH₂单元的长度不同的酯对(其被定义为中间体)，有可能 保留酯相互作用并使分子转向相反方向，从而仍使烷基链填充在囊泡中。该 排列对具有疏水/亲水特性交替出现的结构区域的分子的填充来说是有效的， 并且当该分子被加入所述囊泡中时，可用于分离不同的分子类型。

酯对的选择取决于需要被包裹的分子结构以及其与囊泡相互作用的能 力。

在图8-10中，显示了整体胆固醇体的轮廓结构，其中所插入的分子为头 孢洛林。在图11-13中显示了胰岛素，且在图14-15中显示的分子为贝伐单抗。 在图16中，基质被显示为围绕头孢洛林、胰岛素和贝伐单抗(其彼此相邻显 示)，这很好地说明了这些分子的相对大小与胆固醇体基质大小之间的联系。 所有三种该分子可有效通过该方法包裹并在口服给药后用于人类。在每种情 况中，除了本发明所公开的以外，没有已知的口服吸收的有效方式。

实施例3用于口服用途的胆固醇体中的抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂及 其它小分子

在本发明中，用于治疗传染性疾病的分子通常适合被包裹到胆固醇体中 并口服使用。多数抗生素需要经静脉内(IV)注射，因为该分子通常是亲水的， 且不会被经口吸收。因而在胆固醇体中使用将使其能够被经口吸收。多种抗 生素可用于根据本发明的胆固醇体中，包括用于本发明中的抗生素，包括氨 基糖甙类，包括庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替霉素、妥布霉素、巴龙 霉素、大观霉素；安莎霉素类，包括格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明和链 霉素；碳青霉烯类，包括厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和倍能； 头孢菌素类，包括头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻酚、头孢力新、头孢克洛、 头孢羟唑、头孢西丁、头孢罗齐、头孢呋新、头孢克肟、头孢地尼、头孢托 仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他定、头孢布坦、头孢去甲噻肟、 头孢三嗪、头孢吡肟、头孢洛林酯(Ceftarolinefosamil)和头孢托罗；糖肽类， 包括替考拉宁、万古霉素和特拉万星；脂肽类，包括达托霉素、奥利万星、 WAP-8294A；大环内酯类，包括阿齐红霉素、克拉仙霉素、地红霉素、乙琥 红霉素、罗红霉素、泰利霉素和乙酰螺旋霉素；林克酰胺类，包括克林霉素 和林可霉素；单酰胺菌素类，包括氨曲南；硝基呋喃类药物，包括呋喃唑酮 和呋喃妥因；噁唑烷酮类，包括利奈唑胺、Posizolid、雷得唑来和泰地唑利； 青霉素类，包括阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、 双氯青霉素、氟氯青霉素、磺唑氨苄青霉素、甲氧苯青霉素、乙氧萘胺青霉 素、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、氧哌嗪青霉素、替莫西林和替卡西林； 青霉素组合，包括阿莫西林/克拉维酸钾、氨苄西林/舒巴克坦、氧哌嗪青霉素 /他佐巴坦和替卡西林/克拉维酸钾；多肽，包括杆菌肽、可立其丁和多粘霉素 B；喹诺酮类/氟喹诺酮类，包括环丙沙星、氟啶酸、加替沙星、吉米沙星、 左氧氟沙星、洛米沙星、莫西沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、曲伐沙星、 格雷沙星,和施怕沙星；磺胺类，包括磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、碘胺 二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异噁唑、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、 甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和磺酰胺柯衣定；四环素类，包括脱甲氯四环 素、脱氧土霉素、多西环素米诺环素、替加环素、地霉素和四环素；抗分枝 杆菌剂，包括氯苯吩嗪、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、利福平、利福布 丁、利福喷丁、胂凡纳明；未归类的，包括氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲 硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普汀/达福普汀、甲砜氯霉素、替加环素、 替哨唑和甲氧苄氨嘧啶。

这些分子都无法在天然状态下经口吸收，并且在每种情况中，相对于目 前在传染病的治疗中需要将其进行肠胃外注射，经口吸收将带来主要的优点。

用于本领域实践中的被加入胆固醇体包裹物中的抗真菌化合物的实例包 括但不限于以下几种：咪康唑、特康唑、益康唑、异康唑、噻康唑、白呋唑、 克霉唑、酮康唑、布康唑、依曲康唑、奥昔康唑、芬替康唑、制霉菌素、萘 替芳、两性霉素B、齐诺康唑和环吡酮胺、米卡芬净、卡泊芬净、阿尼芬净。

用于本领域实践中的被加入胆固醇体包裹物中的抗病毒化合物的实例包 括但不限于以下几种：利巴韦林、特拉匹韦(telaprevir)、达卡他韦、阿苏纳帕 韦(asunaprevir)、波普瑞韦、索氟布韦(sofosbuvir)、BI201335、BI1335； ACH-2928,ACH1625；ALS-2158；ALS2200；BIT-225；BL-8020；阿拉泊韦 (Alisporivir)；IDX19368；IDX184；IDX719；西咪匹韦(Simeprevir)； BMS-790052；BMS-032；BMS-791325；ABT072；ABT333；TMC435；丹诺 普韦(Danoprevir)；VX222；mericitabine；MK-8742、GS-5885或其混合物、 干扰素、聚乙二醇化的干扰素、聚乙二醇化的干扰素λ或任何其它所述干扰素 的合适制剂。

此处公开了在胆固醇体中的抗感染制剂的实例，以说明在胆固醇体中的 抗感染物质的性质。

妥布霉素

说明此处公开的分子的一个优选的实施方案为妥布霉素，其选自该用于 根据实施例1中所列举的原则来制备并测试胆固醇体包裹的妥布霉素的列表 中。该具体制剂被设计为用于口服使用，并增加抗生素妥布霉素对目标革兰 氏阴性细菌(如铜绿假单胞菌)的总体效果。

通过具体实施例，如实施例1中所述，以本发明的方式制备平均直径为 250至1,000nm的妥布霉素胆固醇体，其中胆固醇酯选自实施例2中所优选 公开的酯中。使用两种胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的新 型混合物制备含有妥布霉素的胆固醇体。

妥布霉素制剂性质

批次特性

DLLS粒度：2700nm

Zeta电势：-21.7

脂质浓度：1.9mg/ml。妥布霉素浓度：2.0mg/ml

细胞暴露：MCF-7细胞(参见图23)

仅有胆固醇体：在24小时内对生长或活力无效果。

仅有FITC：在24小时内对生长或活力无效果。

仅有妥布霉素：10mcg/ml至0.01mcg/ml在24小时内对生长或活力无效 果。

仅有FITC妥布霉素：10mcg/ml在24小时内对生长或活力无效果

FITC妥布霉素胆固醇体：3.0mcg/ml24小时杀灭，重复，相同结果。 假定100x内部相对于外部，细胞内杀伤阀值与肾小管衬细胞相似。

结论：仅有胆固醇体、仅有FITC胆固醇体、仅有妥布霉素均不杀灭 MCF-7细胞。MCF-7细胞上的FITC-妥布霉素也不对其造成伤害。然而，FITC- 妥布霉素-胆固醇体在24小时时杀灭。

没有对FITC妥布霉素胆固醇体进行乳糜微粒研究。

图23FITC妥布霉素胆固醇体

通过亮视野相对于FITC荧光成像比较MCF-7细胞，显示：1)在被暴露 于FITC-胆固醇体24小时后，MCF-7细胞总体上实现成功负载，我们使用胆 固醇体进行的研究已经几次证实了这一点。

在2)中，在MCF-7细胞内约100倍的妥布霉素浓度的响应是意料不到的， 尤其是当将通过胆固醇体的细胞负载与当仅被暴露于FITC-妥布霉素时 MCF-7细胞总体缺少胞内负载相比时。低负载是预期的结果，因为已知妥布 霉素不进入多数体细胞，且任何主动摄取妥布霉素的细胞都经受妥布霉素的 胞内杀灭，这是由于妥布霉素通过ATP的产生对线粒体和细胞能量供应的影 响。这是妥布霉素已知的肾毒性和耳毒性的基础。

在最感兴趣的3)中，当MCF-7细胞被暴露于FITC-妥布霉素-胆固醇体中 24小时时，这些MCF-7细胞全部死亡，由最后一方框的上图和下图可见。此 处的目的是显示当妥布霉素进入细胞时其普遍对线粒体有毒，且即使当妥布 霉素进入在其它情况下对其胞内效果有抵抗力的细胞时，仍存在胞内摄取和 损害的可能。

头孢洛林(Ceftaroline)

作为关于不能经口吸收并因此目前仅通过IV给药的头孢菌素抗生素的 具体实例，我们选择了抗MRSA头孢菌素抗生素头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)。

可商购的头孢洛林购自医院药房，且以本发明的方式制备头孢洛林胆固 醇体，如实施例1中所述，其中胆固醇酯选自实施例2中所优选公开的酯。 我们无法用FITC标记头孢洛林，因此对该批次测试其抗微生物性质，将其作 为确定制剂效力的主要方式。

使用两种胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的新型混合物 制备含有头孢洛林的胆固醇体的测试批次。根据实施例2的公开化合物进行 用于组合物的胆固醇酯的选择，尽管这并不旨在限制，并且如果存在其它适 用于头孢洛林或类似分子的制剂的胆固醇酯，它们也可用于该制剂中。

在含有头孢洛林的最佳胆固醇体制剂的具体制备中，可选择任何胆固醇 酯作为胆固醇体的成分，并且只要胆固醇体产品的最终Zeta电势保持为中性 电荷，其就在本发明的精神之内。

头孢洛林制剂性质

批次：

FITC标记级分：未进行

DLLS粒度：未进行且未挤出

透析制剂以除去游离头孢洛林：是的，但游离头孢洛林仍存留在制剂中。

产量百分比：脂质的起始量的13％

Zeta电势：未测量

使用透析的头孢洛林进行细菌测试：保留抗MRSA活性，其中MIC值 为母体头孢洛林的至多10分之一，表明MRSA由胆固醇体制剂中进行主动 摄取。

细胞：MCF-7；在融合的制剂中在24小时时有400,000个细胞。MCF-7 细胞大小为2000nm。

仅有胆固醇体：在24小时内对MCF-7细胞生长或活力无效果。

仅有FITC：在24小时内对MCF-7细胞生长或活力无效果。

仅有头孢洛林：在24小时内对MCF-7细胞生长或活力无效果。

仅有FITC头孢洛林：未制备，因此未进行。

FITC头孢洛林胆固醇体：在24小时内对MCF-7细胞的生长或活力无效 果，假定100x内部相对于外部。

乳糜微粒形成细胞：在Caco-2细胞中检测/未检测头孢洛林。

万古霉素

作为关于不能经口吸收并因此目前仅通过IV给药的糖肽抗生素的具体 实例，我们选择了抗MRSA糖肽类抗生素万古霉素。

可商购的万古霉素购自Sigmachemical，且以本发明的方式制备万古霉素 胆固醇体，如实施例1中所述，其中胆固醇酯选自实施例2中所优选公开的 酯。通过MCF-7细胞、Caco-2细胞对该批次进行完全测试，还测试了它们对 MRSA的抗微生物性质以作为确定该制剂的效力的第二个主要方式。

使用两种胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的新型混合物 制备含有FITC-万古霉素的胆固醇体的测试批次。根据实施例2的公开化合 物进行用于组合物的胆固醇酯的选择，尽管这并不旨在限制，并且如果存在 其它适用于万古霉素或类似糖肽类抗生素分子的制剂的胆固醇酯，它们也可 用于该制剂中。

在含有万古霉素的最佳胆固醇体制剂的具体制备中，可选择任何胆固醇 酯作为胆固醇体的成分，并且只要胆固醇体产品的最终Zeta电势保持为中性 电荷，其就在本发明的精神之内。

万古霉素制剂性质

批次：756，制于10-23-13

DLLS粒度：1016nm未挤出

DLLS粒度:800nm挤出

透析制剂以除去游离万古霉素。

产量百分比：<脂质起始量的1.0％

Zeta电势：-13

体积对体积计算：

脂质浓度：10ml中1.0mg。万古霉素浓度：5000mcg/ml

重量对重量计算：

脂质浓度：<1.0mg/ml。在该制剂中存在游离万古霉素。

用透析过的该制剂进行细菌测试，其中该制剂在杀灭MRSA方面非常有 效，相对于单独使用，在胆固醇体中的万古霉素活性大约为前者的10倍。

细胞：MCF-7；在融合的制剂中在24小时时有400,000个细胞。MCF-7 细胞大小为2000nm。

仅有胆固醇体：24小时内无效果

仅有FITC：24小时内无效果

仅有万古霉素：无效；至多666mcg/ml，所测试的最高值

仅有FITC万古霉素：666mcg/ml至41mcg/ml：24小时内无效果

FITC万古霉素胆固醇体：24小时时无效果。当来自胆固醇体的万古霉素 浓度为0.83mcg/ml时，FITC标记研究显示在MCF-7细胞内的非常高的内部 万古霉素浓度，其相当于666mcg/ml的图像标记，参见图24。根据这些数据， 可以观察到由于胆固醇体负载的效果，FITC-万古霉素浓度1000x内部相对于 外部。

对四种不同MRSA菌株的抗微生物活性：胆固醇体万古霉素的MIC值 等于万古霉素，或在一些情况下为仅使用万古霉素时的至多10分之一。

图24FITC万古霉素胆固醇体

如图24所示，万古霉素在细胞内部具有一些有效的性质。该图显示万古 霉素在24小时时进入MCF-7细胞。在该系列实验中，万古霉素的原起始浓 度为41至666mcg/ml。在各栏中，上图为荧光，下图为暗视野。在这组FITC- 万古霉素中，在B列中显示的是83mcg/ml的FITC万古霉素。在A列中， 0.83mcg/ml的FITC-万古霉素-胆固醇体产生更大的摄取量，其值是B列中 FITC-万古霉素中万古霉素浓度的百分之一。A列中的荧光图片比B列中的图 片显示出更多的负载量，这表明FITC-万古霉素-胆固醇体的MCF-7细胞负载 比大于100倍。当在列C中，FITC-万古霉素的细胞外浓度增加至666mcg/ml 时，这些细胞的负载量仍然不与列A中一样高。因此，当使用胆固醇体时， FITC万古霉素负载的荧光数据达到1000倍。应注意高含量的FITC万古霉素 胆固醇体对这些MCF-7细胞没有影响。这三组图中的图像确认了我们所观察 到的FITC万古霉素胆固醇体在细胞内部的渗透。不仅在该图像中细胞膜上 FITC万古霉素的浓度更大，这些细胞的细胞质中也负载有FITC万古霉素。 这仅仅是在24小时暴露后，证实了胆固醇体使细胞内负载更多的万古霉素。

乳糜微粒形成细胞：未在Caco-2细胞中测试万古霉素

结论：仅使用万古霉素、FITC万古霉素、FITC-万古霉素胆固醇体(全部 都在最高浓度下)并不伤害MCF-7细胞。当被包裹在胆固醇体中时，万古霉 素对MRSA有机体保留其抗微生物活性。

实施例4.胰岛素胆固醇体

在制备胆固醇体中的胰岛素时的具体步骤。

通过具体实施例的方式，如实施例1所述，以本发明的方式制备普通胰 岛素(人体单组份胰岛素(Humulin),Lilly)胆固醇体，其中胆固醇酯选自实施 例2中所优选公开的酯。使用两种胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆 固醇酯的新型混合物制备含有胰岛素的胆固醇体的测试批次。根据实施例2 的公开化合物进行用于组合物的胆固醇酯的选择，尽管这并不旨在限制，并 且如果存在其它适用于胰岛素或类似分子的制剂的胆固醇酯，它们也可用于 该制剂中。

在含有胰岛素的最佳胆固醇体制剂的具体制备中，可选择任何胆固醇酯 作为胆固醇体的成分，并且只要胆固醇体产品的最终Zeta电势保持为中性电 荷，其就在本发明的精神之内。使用实施例2所公开的原则选择用于胰岛素 的两种酯为肉豆蔻酸酯和月桂酸酯，其在酯链长度上仅有两个CH₂单位的不 同，并且当如所公开的那样结合时，为以该方式所制备的胆固醇体囊泡提供 了较大的内部亲水性中心。

优化具体胆固醇酯的量完全落入本发明的范围内，其用于提供该含有胰 岛素的胆固醇体的最佳负载和释放谱的目的，以用于体内用途。

原起始条件是基于1:1摩尔比的肉豆蔻酸酯/月桂酸酯，而各种胰岛素分 子的制剂中的最终比例不限于此。将需要对每种胰岛素分子检查其自身结构 以及与假定的胆固醇酯的分子相互作用，从而作为最终选择用于最佳负载的 胆固醇酯的方式。在该情况中，最佳的最终制剂要求更多的疏水面积，然后 使用更长链的脂肪酸酯，因为疏水性空间的整个比例将根据烷基链的长度而 改变。如果我们需要更多的集中亲水结构以用于某些胰岛素分子，则打算使 用氧固醇中的一种(如7-酮基胆固醇)，将其与脂肪酸形成酯。

被包裹的分子为胰岛素，包括但不限于普通胰岛素、NPN胰岛素、甘精 胰岛素、德谷胰岛素(insulindegludec)或任何被制备并在对胰岛素效果的测试 中显示生物活性的胰岛素制剂。制备胆固醇体制剂的步骤包括以下：

准备适当温度(35-45℃)的水浴；将PBS中的水性胰岛素制剂(1mg/ml)置 于水浴中以平衡温度；称取等摩尔量的月桂酸胆固醇酯和肉豆蔻酸胆固醇酯 (每种75mg)并置于圆底烧瓶中；加入有机溶剂(乙醚)以溶解酯；手摇以使其 溶解；将圆底烧瓶置于旋蒸仪上并旋转5分钟；将连接到旋蒸仪上的烧瓶置 于水浴中；打开真空并旋转10分钟；关掉旋蒸仪和真空并向圆底烧瓶中加水； 加入吐温；在水浴中旋转旋蒸仪(无真空)20分钟；超声处理10至30分钟直 到形成混浊制剂并在烧瓶中发现最少量的固体；从超声仪上移除并使用真空 过滤进行过滤；留下混浊滤液；对滤液进行挤出；在使用前将制剂储存在冰 箱中。

图17在Transwell中的Caco-2研究；形成乳糜微粒

使用12孔模式的CorningTranswell透过性支持物，其孔径为0.4μm。当 Caco2细胞在75cm²烧瓶中实现80-90％融合后开始每个Transwell实验。按 常规对细胞进行胰蛋白酶处理，并使用血细胞计数器计数。用培养基将细胞 浓度调整至2x10⁵个细胞/mL。用0.5mL的细胞稀释液对Transwell板的孔进 行接种。将1.5ml体积的培养基加入底侧。如上对细胞进行培养，并每隔一 天更换培养基，如此进行19至20天。此时Caco2细胞分化，并可以进行处 理。除去Transwell板中的上室和下室中的所有培养基，并用含有1mg/mL 葡萄糖的PBS(PBSG)对所有室清洗3次。向板的上室和下室中加入PBSG并 培养1小时。在所有室中除去所有PBSG，并向下室中加入具有添加的葡萄 糖的1.5mL的磷酸盐缓冲盐水(PBSG)。

上室接受0.5mL的适当处理(仅PBSG，PBSG中的FITC胆固醇体，或 PBSG中的FITC-胰岛素胆固醇体)。所有孔具有最终浓度1.0mg/mL的葡萄 糖。然后将板培养2小时。除去所有溶液，并在Zeiss共焦LSM510显微镜 上进行观察。

图18是暴露于FITC标记的胰岛素(即并非在胆固醇体中)后1小时的 Transwell孔的顶侧图像。

在图19中，在共焦显微镜上对底侧流体成像。在该情况中，顶侧仅具有 PBS缓冲液和培养基(无FITC，无胰岛素，无胆固醇体)。不存在可见的荧光， 并且该图像代表图像背景，用于随后的底侧图像。

在图20中，该图像为随后向顶侧施加2小时的FITC胆固醇体，其在底 侧流体中显示含有FITC的小乳糜微粒。重要的是，该流体是在收集底侧流体 后成像的，并在整个制备过程中并未在显微镜中反射。因此，这些乳糜微粒 显然是由Caco2细胞形成的。

在图21中，该图像为随后向顶侧施加2小时的FITC胰岛素胆固醇体， 其中在底侧流体中显示总体更大的含有FITC-胰岛素的乳糜微粒。重要的是， 该流体是在收集底侧流体后成像的，并在整个制备过程中并未在显微镜中反 射。因此，这些含有FITC胰岛素的乳糜微粒显然是由Caco2细胞形成的。

胆固醇体胰岛素制剂的性质总结

批次:733和汇集批次

DLLS粒度：1700nm未挤出

DLLS粒度:149-274nm挤出后

产率百分比：脂质起始量的13.0％

Zeta电势：-24.7

负载比：普通胰岛素的重量比重量负载为13％胰岛素比87％的肉豆蔻酸 胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的总和。

细胞：MCF-7；在融合的制剂中在24小时时n＝400,000个细胞。大小 为2000nm。

仅有胆固醇体：在24小时内对生长或活力无效果。

仅有FITC：在24小时内对生长或活力无效果。

仅有胰岛素：3mcg/ml，1.5ml体积；(4.5mcg)在24小时内无效果。

仅有FITC胰岛素：466mcg/ml在24小时内对生长或活力无效果(参见 图22)。

FITC胰岛素胆固醇体：0.46mcg/ml；在24小时内对生长或活力无效果。

在2小时时开始胰岛素摄取(参见图22)。

FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒：在2小时时开始大量摄取，所有细胞膜 均参与，细胞质中存在游离胰岛素。MCF-7细胞内浓度为细胞外浓度的至少 1000倍。

细胞：Caco-2

顶侧浓度：之前：在顶侧上有350μl的0.46mcg/ml胆固醇体溶液。

仅有FITC胆固醇体：在24小时内对Caco-2细胞无效果；如图20所示 形成乳糜微粒。

仅有FITC胰岛素：在24小时内对Caco-2细胞无效果；如图18所示在 底侧未形成乳糜微粒。

仅有FITC：在24小时内对Caco-2细胞无效果；在底侧上没有乳糜微粒 (图19)。

胰岛素胆固醇体：0.46mcg/ml，具有游离胰岛素–所有胆固醇体都作为 乳糜微粒转移至基底侧(图21)。

由FITC胰岛素胆固醇体形成的乳糜微粒：0.46mcg/ml或更低的胰岛素 浓度(图22)。

图22：FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒

图22.用于MCF-7细胞中的FITC-胰岛素暴露的原起始浓度为466 mcg/ml，在行A中没有在MCF-7细胞内部产生可测量含量的FITC胰岛素。 对于下面两张图(行B和C)，FITC胰岛素胆固醇体的浓度为0.46mcg/ml，这 与前两张图中所总结的实验一致。0.46mcg/ml的FITC胰岛素胆固醇体(行 B)所产生的胞内荧光与466mcg/ml的不含胆固醇体的FITC胰岛素(行A)基本 相同。与466mcg/ml的不含胆固醇体的FITC胰岛素(行A)相比，通过Caco-2 细胞将FITC胰岛素胆固醇体进一步加工成乳糜微粒，这使得源自FITC胰岛 素胆固醇体-乳糜微粒的细胞内胰岛素的含量大幅增加(行C)，比仅有FITC- 胰岛素时的含量的1000倍还大得多，且比未经Caco-2细胞加工的0.46mcg/ml 胰岛素的效果大得多。假设穿过Caco2细胞的量是被加入顶侧的胰岛素的全 部，则行C的FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒中胰岛素的浓度与中间行B中 胰岛素的浓度相同。该具体制剂残留有游离的胰岛素，且如果穿过Caco-2细 胞的量低于100％，则该胞内负载比会更高。显然，FITC胰岛素胆固醇体乳 糜微粒在细胞内部实现更高的负载量，这与此前通过单独FITC胆固醇体所示 的一样，再一次证明仅仅胆固醇体就能够允许肽穿过细胞膜进入细胞。底下 的行C中的图像反映了在细胞内部观察到的FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒 的渗透。在该图片中，不仅细胞膜上具有浓度更大的FITC胰岛素，这些细胞 的细胞质中也负载有FITC胰岛素。这是在仅仅2小时的暴露后，证实了乳糜 微粒的负载量不仅更大，而且其相对于胆固醇体本身还负载得更快。

图25负载有FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒的MCF-7细胞

如此处公开，使用商购的FITC标记的普通胰岛素制备含有被包裹的 FITC-胰岛素的胆固醇体。使用Caco-2细胞来确保胆固醇体使完整胰岛素(即 胰岛素保留在胆固醇体中)穿过肠上皮细胞并进入乳糜微粒，随后在Caco-2 膜的底侧检测到乳糜微粒。使用ELISA表明酸保护的胰岛素并未穿过顶侧 Caco-2屏障(<5％)，且所有在底侧的胰岛素都在乳糜微粒中。在顶侧使用FITC- 胰岛素来证实仅有胰岛素并不穿过肠上皮细胞屏障，但胆固醇体中的FITC胰 岛素穿过Caco2肠上皮细胞屏障。通过这些实验，吸收效率被确定为底侧和 顶侧胰岛素量之差。进一步的实验比较了被胆固醇体包裹的胰岛素上改变的 pH和胆盐的效果。此外，对含有被负载到胆固醇体中的胰岛素的乳糜微粒的 稳定性进行定量，并研究了在体内从负载的胆固醇体中释放胰岛素所必需的 条件。

在图25中，将负载有FITC胰岛素胆固醇体的乳糜微粒置于MCF-7细胞 旁边，以表明向细胞内的摄取。这些细胞易于吸收胆固醇体，并且显示在细 胞内分布均匀。

在该实验中，相对于我们此前用FITC胰岛素胆固醇体进行的实验， MCF-7细胞的FITC-胰岛素胆固醇体乳糜微粒负载量得到改善，并且这里 FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒的负载量为1000倍。在所有情况中，通过 Caco-2细胞将FITC胰岛素胆固醇体加工成乳糜微粒，产生细胞内来自FITC 胰岛素胆固醇体-乳糜微粒的胰岛素量的大幅增加(行B)。在该图像中，不仅 细胞膜引人注意地具有更浓的FITC胰岛素，这些细胞的细胞质也负载了FITC 胰岛素。这是在仅仅暴露2小时后，证实了乳糜微粒不仅更加大量地负载， 相对于胆固醇体自身，乳糜微粒还负载更快。

该具体制剂被给药至4只小鼠。

图26FITC胰岛素胆固醇体给药至4只小鼠。

在完成Caco-2细胞和MCF-7细胞的体外研究后，可向小鼠给药胆固醇 体胰岛素制剂；使用ELISA确定来自乳糜微粒的胰岛素吸收和释放，并作为 确定在胆固醇体中循环的胰岛素在体内的生物停留的手段。

在小鼠中测量血糖以确定在给药该制剂后胰岛素在小鼠模型中的效果。

图26显示了四只小鼠的血糖值，每只都被口服给药FITC-胰岛素-胆固醇 体，30分钟后使用血糖测计仪进行葡萄糖测量。所有小鼠都对较好地忍受该 过程。在4只动物中的3只中，在口服给药30至45分钟后血糖下降。在第 4只动物中，在2小时后血糖开始下降，但具有类似的下降和恢复时间。在 所有情况中，葡萄糖很快回到基线。

总的来说，这些数据显示了经口胰岛素吸收和对血糖的全身性效果，表 明了胆固醇体制剂在鼠类模型中构思的证据。

实施例5.包裹抗癌剂的胆固醇体

小分子和大分子在治疗癌症中的用途通常受到需要穿越以达到细胞内靶 点的屏障的限制。发明人和专家很久以来都在寻找一种递送小分子和大分子 以穿越细胞膜屏障的方式来作为治疗所有类型癌症的方式。

因此对促进抗癌剂的经口吸收并使其能分配至分子与细胞过程相互作用 的细胞内途径的胆固醇体的使用具有极大兴趣，因为以下所列的多数分子都 具有细胞内递送问题、经口吸收问题或两者兼有。

此处所述为使用内源性形成的乳糜微粒对抗癌分子进行经口递送和细胞 内负载的优选实施方案。对于大多数部分，该实施例中公开的所列出的抗癌 剂并非蛋白质、遗传物质等。这些被认为是小分子，并且选择一组具有抗癌 活性的小分子不应被认为是限制，因为小分子一般来讲将遵循此处所述的包 裹和经口吸收以及细胞内摄取的原则。在所有情况下，与本发明相关的本领 域技术人员将理解存在等价的替代性实施方案，本发明的重要特征为完整形 式的分子的可靠的经口吸收和细胞内递送。在所有这些代表性情况中，将使 用实施例1和实施例2中所公开的方法包裹分子，使用实施例3中对于抗生 素所限定的类似模型和过程开发并测试这些分子。这些方法并非限制性的， 且在该实施例中的一些代表性分子的物理性质可限定在迄今的实施例界限之 外的途径。因此，这些仍保留在本发明的精神范围之内。

优选的用于胆固醇体包裹的抗癌剂

代表性的抗癌分子可包括5-氮胞苷；阿利维A酸；六甲密胺；硫唑嘌呤； 阿米斯丁；安吖啶；阿那格雷；天冬酰胺酶；N-(膦酰基)L-天冬氨酸；贝沙罗 汀(Targretin)；博来霉素；苔藓抑素；白消安；卡培他滨；喜树碱；碳铂；卡 氮芥；卡前列素(卡前列素氨丁三醇)；卡谷氨酸；嘧福禄；苯丁酸氮芥；克拉 屈滨；氯苯吩嗪；氯苯吩嗪；秋水仙碱；姜黄素；二氟姜黄素(CDF)；环磷 酰胺；阿糖胞苷；胞嘧啶阿拉伯糖苷；D-氨基乙酰丙酸；氮烯咪胺；柔红霉 素/道诺霉素；地拉罗斯(Deferasirox)；地尼白介素-毒素连接物(Ontak)；多西 他奇/泰索帝；去氧氟尿苷；多柔比星/亚德里亚霉素；依洛尼塞；表柔比星； 苦地胆苦素；磷雌氮芥；磷酸依托泊甙；氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟乳清酸； 福替目丁；吉西他滨；胍立莫司；羟基脲；羟脲；去甲氧正定霉素/4-脱甲氧 基柔红霉素；异磷酰胺；伊卡膦酸盐；依立替康；Peg-依立替康；拉帕替尼/ 二甲苯磺酸拉帕替尼；环己亚硝脲；马丙考；美法仓Hcl；巯嘌呤；甲氨喋呤 (氨甲蝶呤)；氨基酮戊酸甲酯；丝裂霉素C；米托坦；盐酸米托蒽醌；盐酸嘧 啶亚硝脲；十八烷基磷酸胆碱；奥马铂；奥沙利铂；紫杉醇；Peg-天冬酰胺 酶；培美曲塞；喷司他丁/脱氧柯福霉素；卟吩姆钠；甲基苄肼；蛋白激酶C 抑制剂；雷替曲塞；苯丁酸钠；十字孢碱；链唑霉素；Tafluposide；替莫唑胺； 鬼臼噻吩甙；硫鸟嘌呤；塞替派；胸腺生成素；硫鸟嘌呤；拓优得；托泊替 康；维甲酸；盐酸托吡西隆；尿嘧啶氮芥(尿嘧啶芥)；戊柔比星；维替泊芬； 长春碱；长春新碱；长春花碱酰胺；长春瑞滨；伏立诺他(Vorinostat)；

二氟姜黄素(CDF)实施例

此处所公开的分子的代表性的优选实施方式为姜黄素的一种衍生物，二 氟姜黄素，也被称为CDF。在本领域中已详细描述了CDF有益的抗癌性质(16, 85-92)。CDF的活性之一为针对组蛋白甲基转移酶EZH2，其为细胞存活、 增殖和肿瘤干细胞(CSC)功能的重要表观遗传调节剂。EZH2的表达在多种人 类癌症中增加，包括高度侵略性的胰腺癌，但还不能完全理解其生物效果背 后的机制。作者使用二氟姜黄素(CDF)，一种具有抗氧化性质的姜黄香料成分 姜黄素的新型类似物来探测胰腺癌中的EZH2功能。CDF降低了胰腺癌细胞 的存活、集落生成、胰腺球状物(pancreatosphere)的形成、侵袭性细胞的迁移 和人类胰腺癌细胞中的CSC功能。这些效果与EZH2降低的表达和一组抑肿 瘤微RNA(miRNA)的增加的表达有关，所述miRNA包括let-7a、b、c、d、 miR-26a、miR-101、miR-146a、和miR-200b、c，其通常在胰腺癌中缺失。 机制的研究揭示，miR-101的再表达有效限制了EZH2和促侵袭性(proinvasive) 细胞表面附着分子EpCAM的表达。在人类胰腺癌的原位异种移植模型中， 给药CDF抑制了肿瘤生长，其方式与EZH2、Notch-1、CD44、EpCAM和 Nanog降低的表达以及与let-7、miR-26a和miR-101增加的表达相关。一并 考虑，该结果表明，CDF通过靶向表观遗传控制基因表达的EZH2-miRNA调 节回路而抑制了胰腺癌肿瘤的生长和侵占性(89)。

可根据实施例1的过程制备胆固醇体包裹的CDF以用于测试。使用FITC 标记的CDF评估生物分布，并且当暴露于CDF胆固醇体时在穿过caco2细 胞之前和之后研究了前述表观遗传途径，此时所收集的乳糜微粒被用于细胞 信号途径实验。

根据体外和细胞分布实验的结论，可将CDF胆固醇体用于小鼠模型来评 估细胞内暴露和活性，从而定义浓度和相对于生物活性的计量，其中将未包 裹的CDF用作对照。进行了口服给药和IV给药两者以确定生物利用度以及 细胞摄取和定位。第二个优选的实施方案为多柔比星，其本身为经常被加入 脂质体药物递送系统的分子，并广泛用于癌症的治疗中。

实施例6作为代表性单克隆抗体的贝伐单抗

此处所述为大分子的经口递送的优选实施方案，所述大分子包括肽、蛋 白质(包括单克隆抗体)或遗传物质等。这些被认为是大生物分子，其分子量超 过6kd，并且多数经常超过100kd，并且选择一组具有对疾病活性的大生物 分子不应被认为是将本发明的用途限制为具体的疾病或治疗上，因为生物分 子一般来讲将遵循此处所述的包裹和经口吸收以及细胞内吸收的原理。在所 有情况下，与本发明相关的本领域技术人员将理解存在等价的替代性实施方 案，本发明的重要特征为完整形式的生物分子的可靠的经口吸收和细胞内递 送，以用于治疗在蛋白质治疗领域中的人类患者的疾病。单克隆抗体贝伐单 抗和曲妥单抗已是包裹的主要对象，但这些不应被理解为限制性的，并且事 实上相似长度、电荷和分子量的多数单克隆抗体在此处所述的胆固醇体包裹 方面行为相似。

胆固醇体中的贝伐单抗

此处所述的分子的代表性的优选实施方案为贝伐单抗，其选自根据实施 例1中所列举的原则用于被胆固醇体包裹的贝伐单抗的制备和测试的该列表 中。设计具体的制剂以用于口服使用和细胞内递送，以及相应的IV使用，以 靶向细胞表面受体靶点。

通过具体实施例的方式，如实施例1中所述，可以本发明的方式制备平 均直径为250至10,000nm的贝伐单抗胆固醇体，其中胆固醇酯选自实施例2 中优选公开的酯。使用两种胆固醇酯的新型混合物制备含有贝伐单抗的胆固 醇体。

可如Woitiski(6)所公开的制备作为纳米颗粒的贝伐单抗的另一种制剂。这 些纳米颗粒将被白蛋白涂覆以用于Caco-2实验，以实现预期的最大吸收能力， 因为涂覆改善了在该具体纳米颗粒制剂中胰岛素的吸收。

贝伐单抗胆固醇体的负载和细胞摄取

在加入胆固醇体之前，以实施例1中所述的方式用FITC标记制剂蛋白贝 伐单抗。

基于重量比重量，胆固醇体的贝伐单抗负载量在颗粒中约为20％，该颗 粒大小在250至10,000nm的范围内。

将使用本发明人对胰岛素所公开的共焦显微镜、扫描电子显微镜(SEM) 和Transwell实验检查所有制剂。

用于测试贝伐单抗胆固醇体的Caco-2细胞

在37℃下，在5％CO²/95％O²和90％的相对湿度的气氛下，在添加了100 IU/mL青霉素和100mcg/mL链霉素、2mM1-谷酰胺、1％非必需氨基酸和10％ 加热失活的胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养用于 Transwell实验的Caco-2细胞。Caco-2在培养21天后形成吸收性的极化单层， 并发展出顶部刷状缘，且分泌酶。

除了通过显微镜检测，使用上皮伏特欧姆计对生长在Transwell扩散池的 1cm²的聚碳酸酯过滤器上的细胞测量跨上皮电阻，以评估紧密连接。

如此处所述，使用商购的FITC标记的贝伐单抗制备含有被包裹的FITC- 贝伐单抗的胆固醇体。使用Caco-2细胞以确保胆固醇体使完整的贝伐单抗(即 贝伐单抗保留在胆固醇体中)穿过肠上皮细胞病进入乳糜颗粒，随后在Caco2 膜的底侧检测到乳糜微粒。使用FITC-贝伐单抗制剂的荧光读数来表明游离 的贝伐单抗不穿过顶侧的Caco-2屏障(<5％)，且很多被置于顶侧的被包裹在 胆固醇体中的FITC-贝伐单抗事实上作为含有FITC-贝伐单抗-胆固醇体的乳 糜微粒被转移到底侧。

根据荧光读数，75％的被加入Caco-2肠上皮细胞屏障顶侧的FITC-贝伐 单抗-胆固醇体穿过了Caco2肠上皮细胞屏障。根据这些实验，吸收效率被确 定为FITC-贝伐单抗-胆固醇体在底侧和顶侧的量之差。在实验的末尾，在24 小时处，所有荧光读数总计达到FITC-贝伐单抗-胆固醇体的荧光起始量，从 而实现了实验自身内的质量平衡。

贝伐单抗胆固醇体和贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒的MCF-7细胞实验

如图5、22和23中所有用于各自构造体的对照实验中所示，MCF-7细胞 易于摄取胆固醇体。其它并未在此处显示。由于这是荧光图像，在该图像中 仅有的胆固醇体量都来自被包裹在胆固醇体中的FITC。注意被胆固醇体负载 的细胞膜外形，以及在后面的图像中FITC标记在细胞中的均匀分布，其甚至 包括了该细胞的核。

当进行体外测试时，MCF-7细胞对贝伐单抗相对存在抗性，其具有约1.0 mcg/ml的IC50值。事实上药物间接作用为细胞生长抑制剂，这是阻断VEGF 并减少对生长的肿瘤的血管供应的净效应。

根据前述体外抗性，完全在意料之中地，MCF-7细胞在173mcg/ml的外 部浓度(相比于当在治疗癌症时向人类给药100mg的剂量的典型峰值的约10 倍浓度)下没有显示出对FITC-贝伐单抗的摄取。这些数据为图27的一部分。

然后将这些相同的MCF-7细胞暴露于FITC-贝伐单抗胆固醇体，其使用 肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯根据实施例1中的方法制备。这些胆固 醇体的大小约为5000至10,000nm，而MCF-7细胞的大小约为15,000nm。 在24小时内拍摄这些MCF-7细胞的暗视野和荧光图像，显示于图28中。这 些细胞并不以可检测的程度摄取贝伐单抗胆固醇体，并且其显示FITC-贝伐 单抗在细胞内的分布均匀。在该实验中，MCF-7细胞在24小时内保持存活， 表明FITC贝伐单抗-胆固醇体并不增加贝伐单抗对这些细胞的作用。

然后使Caco-2细胞暴露于相同的贝伐单抗-FITC-胆固醇体制剂，在24 小时暴露后，从Transwell的底侧收集所得含有乳糜微粒的FITC-贝伐单抗- 胆固醇体。在该实验中，75％的贝伐单抗-FITC-胆固醇体穿过了Caco-2屏障， 并进入所得乳糜微粒。

由于75％的胆固醇体位于乳糜微粒的内部，MCF-7细胞被暴露于与此前 所显示的胆固醇体制剂中的贝伐单抗浓度相似的贝伐单抗浓度下。有意思的 是，相比于当递送仅来自于胆固醇体时或事实上来自于仅将MCF-7细胞暴露 于游离贝伐单抗时的情况，当将乳糜微粒用于FITC-贝伐单抗-胆固醇体的细 胞内递送时，向MCF-7细胞内的摄取大幅提高。

此外，被暴露于乳糜微粒递送的FITC贝伐单抗的MCF-7细胞仅在暴露 后4小时就不再存活。这是非常值得注意的，因为对于贝伐单抗的活性机制， 不存在已知的细胞毒性成分。迄今为止，该单克隆抗体具有细胞生长抑制机 制，其间接作用于VEGF和血管生长。此外，由于贝伐单抗无法进入细胞， 由细胞内递送所意想不到发现的快速细胞性毒素途径为该旧蛋白创造了一种 新产品和新途径。

贝伐单抗制剂性质

制造日期：2013年8月3日

DLLS粒度：10,510nm；未挤出

产率百分比：脂质起始量的20％

Zeta电势：未对贝伐单抗进行测量。曲妥单抗：6.4

细胞：MCF-7；在融合的制剂中在24小时时有400,000个细胞。大小为 2000nm。

仅具有胆固醇体的MCF-7细胞：在24小时内对生长无效果。

仅有FITC：在24小时内对生长无效果。

仅有贝伐单抗：未测试

仅有FITC贝伐单抗；高达173mcg/ml：在24小时内对生长无效果(图 27)。

FITC贝伐单抗胆固醇体：～20mcg/ml；细胞具有良好耐受性；从2小时 起可见的细胞内摄取。

来自Caco-2细胞的FITC贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒：15mcg/ml对 MCF-7细胞保持4小时，完全杀灭所有视野内的细胞(图28)。

图27FITC贝伐单抗对MCF-7细胞的作用

图27显示在向MCF-7细胞加入173mcg/ml目标浓度的FITC贝伐单抗 后2小时、4小时和24小时的暗视野(上行)和荧光图像。这些浓度是在用贝 伐单抗治疗的患者中所通常观察到的5至10倍。没有证据表明FITC贝伐单 抗与这些MCF-7细胞的细胞膜整合。没有证据表明MCF-7细胞在任何时间 点产生对FITC贝伐单抗的任何荧光摄取，并且没有证据表明FITC-贝伐单抗 对这些MCF-7细胞的效果。

图28FITC贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒杀灭MCF-7细胞

图28在该实验中，制备FITC贝伐单抗胆固醇体，并用MCF-7细胞对 其进行测试。在2小时处无效果，并且细胞并未显示对FITC贝伐单抗胆固醇 体的摄取。然后将相同的这些FITC贝伐单抗胆固醇体置于Caco-2细胞的顶 侧，并在MCF-7细胞上测试所得FITC贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒。底行的 第一张图显示对FITC贝伐单抗胆固醇体乳糜微粒的大量摄取，且另一个强烈 观察到的效果是对MCF-7细胞的快速细胞杀灭，因为在实验4小时时这些细 胞全部被杀灭。

代表性的单克隆抗体和大蛋白

用于通过使用本发明转变为口服使用或用于改善细胞内活性的代表性大 分子可包括这里所列的任一种或组合，并包括在公开此处所列的化合物之后 发现的具有相似大小和电荷的分子：阿达木单抗(Humira)；阿昔单抗；阿仑 单抗；贝伐单抗(阿瓦斯汀)；巴匹珠单抗(Bapineuzumab)；西妥昔单抗；依那 西普(Enbrel)；埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)；吉姆单抗；奥英妥珠单抗 (Inotuzumab)；Isis-Genzyme的Kynamro^TM米泊美生(mipomersen)；美罗华/ 利妥昔单抗；那他珠单抗，Elan/Biogen的Tysabri；EliLilly的Necitumumab； 帕利珠单抗(Synagis)；帕尼单抗；RN316(Pfizer的抗-PCSK9)，用于降低LDL 胆固醇的REGN727(regeneron的抗-PCSK9)；Solanezumab；曲妥单抗 (Herceptin)；托西莫单抗；T-DM1，Roche/Genentech的一种抗体药物缀合物， 其由曲妥单抗(Herceptin)、DM1(emtansine)和将DM1连接至曲妥单抗的连接 基组成；T-DM1被设计为靶向并抑制HER信号传导并将DM1直接递送至 HER2阳性癌细胞内；用于BRAFV600突变阳性转移性黑素瘤的阿托木单抗；贝利单抗(Belimumab)；Brodalumab；卡鲁单抗(Carlumab)； Dupilumab；Fresolimumab；高利单抗(Golimumab)；乐地单抗；Lirilumab； vrilimumab；美替木单抗(Metelimumab)；莫罗木单抗；Namilumab；Oxelumab； Placulumab；Sarilumab；西法木单抗(Sifalimumab)；Tabalumab；易普利姆玛 (Ipilimumab)；替西木单抗(Tremelimumab)；纳武单抗(Nivolumab)；Urelumab； 柏替木单抗(Bertilimumab)；Zanolimumab；阿非莫单抗；艾西莫单抗 (Elsilimomab)；法拉莫单抗；Gavilimomab；伊诺莫单抗；马司莫单抗；奈瑞 莫单抗；奥度莫单抗；Telimomab；维帕莫单抗；阿佐莫单抗；巴利昔单抗； 克立昔单抗；Galiximab；Gomiliximab；英夫利昔单抗(Janssen的瑞米凯德)； 凯利昔单抗；鲁昔单抗(Lumiliximab)；普立昔单抗；替奈昔单抗(Teneliximab)； 伐利昔单抗(Vapaliximab)；阿塞珠单抗(Aselizumab)；阿泊珠单抗 (Apolizumab)；Benralizumab；西利珠单抗；赛妥珠单抗(Certolizumabpegol)； 达克珠单抗；依库珠单抗(Eculizumab)；依法利珠单抗；依帕珠单抗；厄利珠 单抗(Erlizumab)；Etrolizumab；芳妥珠单抗(Fontolizumab)； Itolizumab(Itolizumab)；Lampalizumab；Ligelizumab；美泊利单抗； Mogamulizumab；那他珠单抗；Ocrelizumab；奥法木单抗；奥马珠单抗 (Omalizumab)；Ozoralizumab；帕考珠单抗(Pascolizumab)；Pateclizumab；培 克珠单抗(Pexelizumab)；Pidilizumab；瑞利珠单抗(Reslizumab)；Rontalizumab； 罗维珠单抗；鲁利单抗；Quilizumab；Samalizumab；希普利珠单抗(Siplizumab)； 他利珠单抗(Talizumab)；Teplizumab；托珠单抗(Tocilizumab)；托利珠单抗 (Toralizumab)；Tregalizumab；Vatelizumab；维多珠单抗(Vedolizumab)；维西 珠单抗(Visilizumab)；Ibalizumab；Otelixizumab；Briakinumab；卡那单抗 (Canakinumab)；Fezakinumab；苏金单抗(Secukinumab)；Sirukumab； Tralokinumab；Ustekinumab；Anrukinzumab；Clazakizumab；Enokizumab； Gevokizumab；Ixekizumab；Lebrikizumab；Olokizumab；Perakizumab； Tildrakizumab；贝索单抗(Besilesomab)；Fanolesomab；来马索单抗 (Lemalesomab)；硫索单抗；

实施例7口服的普遍脂质控制组合：PCSK-9的抗体与制动素(brake)和 他汀类

说明此处公开的分子的一个优选实施方案为阿利库单抗(Alirocumab)，也 被称为REGN727，一种抗PCSK-9的单克隆抗体。作为非限制性实例，对 PCSK-9的替代性单克隆抗体包括Evolocumab或Bococizumab。

根据实施例1中所列举的原则，阿利库单抗选自列表中以用于制备并测 试被胆固醇体包裹的PCSK-9抗体。根据常识和依据，即PCSK-9是该化合物 抗体的细胞内靶点，设计具体制剂以用于口服使用和细胞内递送。

通过具体实施例的方式，如实施例1中所述，可以本发明的方式制备具 有250至10,000nm平均直径的阿利库单抗胆固醇体，其中胆固醇酯选自实 施例2中优选公开的酯。使用两种胆固醇酯的新型混合物制备含有阿利库单 抗的胆固醇体。

在高脂血症的治疗中，需要控制胆固醇，这在临床指导中被定义为提高 HDL并降低LDL，此外还需要降低血浆甘油三酯。在该实施例中所公开的口 服组合产品是唯一可以对高脂血症的所有方面实现完全控制的方式，此外， 其将除去PCSK-9单克隆抗体治疗中所有组分的主要缺点，即需要两周一次 的皮下注射。口服给药PCSK-9单克隆抗体将显著改善患者对这些新型治疗 方式的接受程度。

组合产品的PCSK-9单克隆抗体成分

针对在实施例中所公开的具有治疗益处的蛋白，PSCK-9单克隆抗体的口 服制剂将以有效的方式控制升高的LDL，并且所选择的蛋白用于口服胆固醇 体包裹。

说明此处所公开的分子的优选实施方案为REGN727，其在本领域也已知 为阿利库单抗，根据实施例1中所列举的原则选自该列表中以用于制备并测 试胆固醇体包裹。设计具体制剂以用于口服使用，每月的治疗中暴露约100 mg。

作为具体实例，根据实施例1中所述，可以本发明的方式制备平均直径 为250至450nm的负载有REGN727的胆固醇体。将使用两种胆固醇酯的新 型混合物制备含有REGN727的胆固醇体。该构造体将用于降低LDL胆固醇。 该构造体将与他汀类药物组合给药，并且任选地与回肠制动激素释放物质组 合。

组合产品的他汀类成分

为了提高HDL胆固醇并降低总胆固醇，将口服REGN727与速释他汀类 药物一起配制。适合与口服PCSK-9治疗组合的他汀类列表包括以下：洛伐 它丁、阿伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、氟伐地汀、匹伐他汀、帕伐他丁。 作为实例，优选10mg剂量的阿伐他汀，但本发明的组合不仅限于阿伐他汀， 多数可用的他汀类分子都适合，因为所有都是速释的，仅需要膜包衣。

PCSK-9组合产品的制动素成分

为了降低甘油三酯，REGN727与他汀类的制剂将任选地与约10克的 US2011/0268795所公开的回肠制动激素释放物质组合，因此该公开的全部内 容和全部制剂通过引用合并于此。该制剂在受试者的回肠处释放活性回肠制 动激素释放物质内容物，并完全控制了升高的甘油三酯浓度。发明人进行的 研究结果显示，用直接递送至回肠中的AphoelineBrake^TM长期每天刺激回肠 激素趋于使身体内环境稳态稳定并保持下去，并且在禁食状态下降低了胰岛 素、葡萄糖、甘油三酯以及所有测量的肝酶的异常水平。此外，α-胎儿蛋白 的显著降低似乎表明降低了肝脏的炎症。将胰岛素抗性、甘油三酯和肝脏炎 症的降低与肝酶的降低相结合，表明显著改善了肝脏健康，并意味着这些激 素在肝细胞再生以及保持肝脏健康方面起到作用。将这些有利性质与他汀类 和PCSK9单克隆抗体结合，向患者提供了一种控制代谢综合征的新型综合方 法，而代谢综合征是高脂血症以及由此发生的动脉粥样硬化血管病的主要潜 在原因。

以每天一次的基础向患有高脂血症的患者给药由这些成分所得的组合产 品，其最终结果是完全控制高脂血症，同时副作用最小。

实施例8使用胆固醇体和乳糜微粒递送siRNA

遗传物质

在经典遗传学中，在有性繁殖生物(通常为真核)中，配子具有体细胞一半 数量的染色体，且基因组是全套染色体。通过在减数分裂时分离同源染色体 在配子中实现了遗传物质的减半。由完整染色体或单倍体染色体所衍生的任 何材料都是遗传物质。

术语基因组可专门被用于表示在完整的核DNA组(即“核基因组”)中储 存的物质，但也可被用于表示在含有其自身DNA的细胞器中储存的物质，如 同“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”。此外，基因组可包含非染色体遗传 成分，如病毒、质粒和转座因子。

用于改变RNA功能的RNA和短链RNA干扰子或插入子也可被认为是 遗传物质，用于被包裹到胆固醇体中并用于将遗传物质递送到靶细胞内的位 点中的目的。

作为实例，我们公开了治疗丙型肝炎病毒(一种黄病毒(Flaviviridae)属的 RNA病毒)的组合方法。该种属的成员具有单组分线性单链RNA基因组，其 具有正极性，长度为9.6至12.3千碱基。虫媒病毒的5’末端携带甲基化的核 苷酸帽，而该家族的其它成员并未帽化，并编码内核糖体进入位点。病毒颗 粒是被包裹的，并且是球形的，直径约40至60nm。尽管在该种属中超过60 种病毒已知造成疾病，但我们希望将注意力集中于肝炎病毒属(丙型肝炎病毒 的物种类型)上。

丙型肝炎病毒是胆固醇体治疗的一个尤其感兴趣的靶点，因为该病毒隐 藏在观察正常的脂质颗粒中，并且如果希望干扰其生命周期、侵入力或个体 之间的传播，似乎需要跟随病毒进入这些隐藏位点。

这些后续目标将使得我们的具体构造体制剂有效用于治疗丙型肝炎病毒 感染。

说明此处公开的分子的优选实施方案为miR-122，本领域已知为 Miravirsen。通过非限制性实施例的方式，可将针对丙型肝炎病毒以及其它病 毒的替代性遗传构造体用作针对相应病毒的治疗，只要存在对获得细胞内位 点以及其它已知也保护丙型肝炎病毒的循环脂质颗粒(如乳糜微粒残留物)的 通路的新方式的需要。

根据实施例1中所列举的原则，选择miR-122来制备并测试靶向丙型肝 炎的胆固醇体包裹的遗传物质。根据常识以及依据，即丙型肝炎感染的细胞 是针对该病毒的遗传修饰策略的一个必要细胞内靶点，设计了具体制剂用于 口服使用和细胞内递送。即使未达到最佳递送，仍存在临床证据表明丙型肝 炎病毒感染对向患者肠胃外给药miR-122构造体的治疗产生有效响应。在后 面示出这些结果。

作为具体实例，如实施例1所述，可以本发明的方式制备平均直径为250 至10,000nm的miR-122胆固醇体，其中胆固醇酯选自实施例2中优选公开 的酯。使用两种胆固醇酯的新型混合物制备含有miR-122的胆固醇体。

胆固醇体中的针对HepC的miR-122

丙型肝炎病毒(HCV)的稳定性和传播取决于HCV基因组与肝表达的微 RNA-122(miR-122)之间的功能性相互作用。微RNA为小的非编码RNA，其 由转录和后转录修饰基因表达的人类基因组编码。微RNA-122(miR-122)形成 肝脏中主要的微RNA，并在肝细胞中被排他性地表达。其涉及多种不同过程， 包括脂质代谢、细胞分化、铁代谢和肝昼夜调控。HCV的50个未翻译区域 (UTR)在基因型中是高度保守的，并含有两个miR-122结合位点，对其的破 坏阻断了HCV的复制。

Miravirsen是一种锁核酸修饰的DNA硫代磷酸酯反义寡核苷酸，其在高 度稳定的异源双链中隔离成熟的miR-122，从而抑制其功能。作为与miR-122 互补的15个核苷酸长度的寡核苷酸，miravirsen可与miR-122形成稳定的异 源双链。仍在积极调查miravirsen是主要通过隔离可用的miR-122、间接通过 破坏对病毒生命周期来说至关重要的脂质途径还是通过其它机制来发挥其抗 病毒效果。

在对黑猩猩(唯一的天然HCV动物模型)的研究中首次显示了其对慢性 HCV感染的效果。通过每周一次的输液接受5mg/kg的最高剂量的黑猩猩在 血浆和肝脏HCVRNA方面具有显著的降低，这导致了miravirsen的临床测 试。Janssen及同事报道了他们在治疗慢性感染HCV基因型1的首次进行实 验的未硬变患者的2a期研究中的发现。他们招收了36名患者，这些患者被 随机分配，对其进行三种不同剂量的miravirsen(3、5或7mg/kg)或安慰剂的 皮下注射，每周一次，共5次。他们发现HCVRNA显示出剂量依赖性减退， 其中1位(11％)5mg/kg的患者和4位(44％)7mg/kg组中的患者达到不可检测 的HCVRNA水平，所有都是在第五次剂量的miravirsen之后。值得注意的 是，作者显示的个体响应曲线变化很大，即使是在最高剂量下。HCVRNA 变得不可检测的患者中的三位在4至5周后复发，并且一位患者继续用 PegIFN/RBV治疗。并未报道其它在研究第14周达到不可检测的HCVRNA 并直至第18周仍保持不可检测的患者的长期结果。不良事件一般来说较轻， 仅出现注射位点的反应，这有可能与miravirsen给药相关。

对HCV患者对miravirsen相对较弱且可变得响应的最有可能的解释是 miravirsen的细胞摄取不规则。这并不令人惊讶，因为无法达到细胞靶点使得 多数使反义治疗商业化的尝试复杂化。较差的细胞内渗透可能是miR-122制 剂的剂量为何是7mg/kg的原因。使用胆固醇体的构建体的有效细胞内递送 可将有效剂量降低至十分之一至百分之一的数值。此外，相对于目前对于肠 胃外使用所用的剂量，总体更低剂量的口服使用将存在优点。

将制备胆固醇体制剂以用于目前的miravirsen构造体，并且成功制剂的 可能的结果将由于有效的胞内递送而造成对HCV病毒负载的大幅改善的活 性。此外，将口服使用胆固醇体制剂，这相对于皮下注射是较大的改善。胆 固醇体-miR-122的口服摄取的独特特征将被胆固醇体-miR-122的细胞内递送 弥补，这将使得该产品在更低的剂量下有效。这些纳米颗粒将通过乳糜微粒 负载进入细胞，并且一旦进入，就会使丙型肝炎病毒沉默。

为了成功地将miR-122反义技术商业化，需要完成很多开发工作。尽管 用胆固醇体包裹的miR-122的口服治疗将产生该构造体的一种大幅改善的版 本，但很可能该口服制剂将与抗HCV药物，如索氟布韦(Sovaldi)一起给药， 并且要求保护这些组合以用于治疗HCV感染。

此外，还有可能通过伴随使用制动素制剂来处理并发的代谢综合征表现， 并且原则上使这些患者的肝脏修复并再生，从而改善抗HCV药物治疗，如关 于高脂血症的实施例7中进一步详细描述的那样。

关于制动素在对丙型肝炎的组合疗法中的使用，在2013年5月2日公开 的WO2013/063527、2012年9月7日公开的WO/2012-118712A2和US2012 026561中可发现这些制剂和策略的详细内容,，其内容通过引用合并于此。

因此，所公开的用于在所有类型的患者中处理HCV的理想组合为口服胆 固醇体-miR-122与口服索氟布韦组合，并与口服制动素组合。

在实施例9中提供了一种针对HCV的口服疫苗的实例，并且可将该疫苗 给药至本实施例中相同的HCV患者。

在HIV病毒血症治疗中的基因剪辑

自从认识到基因为遗传的基本单位后，在人类基因组中制造位点特异性 的修饰(或“剪辑”)的能力已成为药物的目标。基因组剪辑的挑战是在DNA 分子中的具体位点产生单个双链断裂的能力。已经测试了多种试剂，包括大 范围核酸酶、形成DNA三倍体的寡核苷酸和肽核酸，并显示它们受到无效力 的限制。另一组试剂，锌指核酸酶(ZFN)，已被证明在基因组剪辑上具有多种 功能，并且现在已在一些模型有机体和人类细胞中较好地建立了ZFN的使用。

ZFN非常适合基因组工程，因为它们将锌指蛋白(ZFP)的DNA识别特异 性与限制性内切酶FokI(一种核酸酶)的稳定但受限的酶活性结合。提供了 DNA结合特异性的ZFP包含Cys₂His₂锌指的串联阵列，每个识别约3个DNA 碱基对。作为比较，细菌IIS型限制性内切酶FokI不具有序列特异性，并且 必须被二聚化以剪切DNA。在ZFN介导的双链剪切后，可通过同源重组或 非同源末端连接来修复DNA。同源重组修复断裂点，但保留原DNA序列。 然而，这些细胞容易被ZFN再剪切。相反，非同源末端连接可导致在断裂位 点随机插入或删除核苷酸，造成对原DNA序列的永久性破坏。因此，非同源 末端连接可被用来使具体基因突变，造成其功能的敲除(knockout)。

此前报道过由结合到人趋化因子(C-C基序)受体5基因(CCR5)内的靶点 的两个4指蛋白组成的ZFN对的设计。在临床前测试中，在对分裂素的响应 中正常扩展并起作用的CCR5修饰的CD4T细胞被保护，从而免于被人免疫 缺陷病毒(HIV)感染，并在HIV感染的人化小鼠模型(包括异种移植)中降低了 HIVRNA水平。

Tebas和同事基于几条理由选择了编码HIV进入的复合受体的CCR5。首 先，其破坏似乎有可能增加了CD4T细胞的存活率，CCR5中对32bp缺失 (delta32/delta32)纯合的个体对HIV感染具有抵抗力。在体外，来自该个体的 CD4T细胞对使用CCR5的HIV菌株(其是体内的主要菌株)感染具有高度抵 抗力。此外，对CCR5delta32杂合并感染了HIV的个体向获得性免疫缺陷综 合征，即艾滋病的进展缓慢。此外，已在人类中显示了通过使用小分子抑制 剂阻断或抑制CCR5的效果。最后，经受了用CCR5-delta32缺失的纯合子祖 细胞的同种移植的个体在超过4年的时间中都保持不需要抗病毒治疗，其在 血液、骨髓和直肠黏膜中具有不可检测的HIVRNA和原病毒DNA。尽管仍 需要建立造成与该过程有关的表观治愈的机制，但获得性CCR5缺失是一个 可能性。Tebas现在报道了在靶标基因破坏(即自体CD4T细胞的融合，该T 细胞被ZFN在CCR5处修饰)后，部分诱导了对HIV感染的获得性遗传抵抗 力。

在该情况中将ZFN与腺病毒载体一起给药，并在转染前将细胞从身体移 除。在发明人的该工作中，可通过胆固醇体制剂实现ZFN在细胞内的功能性 浓度，从而克服这些不足。

作为具体实例，如实施例1所述，可以本发明的方式制备在平均直径为 250至10,000nm的胆固醇体中的ZFN构造体，该构造体针对CCR5具有活 性，其中胆固醇酯选自实施例2中优选公开的酯。使用两种胆固醇酯的新型 混合物制备含有ZFN的胆固醇体，选择该胆固醇酯以实现中性或具有些微负 电荷的颗粒，其将被肠上皮细胞摄取并存于乳糜微粒中。

通过胆固醇体制剂中的遗传物质多核苷酸的实例的方式提供了该列表， 该遗传物质多核苷酸跨越了用于疾病修饰和治疗的分子大小范围，该列表不 以任何方式限制胆固醇体在包裹所有大小的分子中以及当用于治疗已知或新 的疾病时的应用。

实施例9胆固醇体和由此产生的乳糜微粒在隐藏在细胞内的病毒感染的 口服接种疫苗中的用途

丙型肝炎病毒的传播生命周期

丙型肝炎病毒(HCV)与载脂蛋白B(apoB)和E(apoE)相互作用以形成传染 性的脂肪病毒颗粒。干扰素刺激的基因(ISG)和IL28B基因型影响了对peg- 干扰素的响应。LDL胆固醇(LDL-C)也预测了干扰素响应。

在丙型肝炎病毒(隐藏在脂质颗粒中的病毒)的情况中，肝炎疫苗可包括佐 剂和miRNA或siRNA。实施例8中的一种合适的反义治疗实例为miR-122。 值得注意的是miR-122并不引起免疫系统的响应，并且事实上值得注意的是 丙型肝炎也不引起免疫系统的响应。这就是为何其很难被除去。

有效的丙型肝炎疫苗

有效的丙型肝炎疫苗需要跟随病毒通过脂质途径，并产生对其在细胞内 的存在以及可能的在脂质颗粒自身内的存在的免疫识别。因此，使用将疫苗 构造体置于乳糜微粒中以用于递送的经口吸收的胆固醇体制剂是一种接种新 方法。

没有疫苗跟随病毒进入所有的体细胞，因此将丙型肝炎病毒构造体加入 胆固醇体-乳糜微粒递送中将是首次直接使用针对有机体的慢性感染病毒的 生命周期。伴随佐剂的使用也将是口服胆固醇体丙型肝炎疫苗构造体的任选 但需要的成分。该疫苗将在十二指肠处经口吸收。

具有或不具有佐剂的胆固醇体中的口服疫苗

可对其它慢性病毒感染使用具有佐剂的口服胆固醇体包裹的疫苗的相同 方法，其中该病毒隐藏在体细胞内，包括隐藏在T淋巴细胞内的HIV、隐藏 在神经组织中的带状疱疹和其它与肝炎病毒具有相似性质的黄病毒构造体。

也有第二种优选实施方案来将具有佐剂的丙型肝炎疫苗经口递送至回肠 的派伊尔结树突细胞中，并且对此将使用我们的回肠疫苗释放技术，如 PCT/US2013/031483中完全公开的那样，其在2013年3月10日作为 WO2013/148258公开。注意在所公开的疫苗中没有胆固醇体制剂，并且事实 上我们并没有期望被递送至回肠的丙型肝炎疫苗构造体将被经口吸收，这也 没有被认为是效力的必需条件。

因此在该公开的实施例中存在一种新型组合产品的可能性，一种基于胆 固醇体的疫苗成分渗透至身体的脂质途径中并修饰病毒复制步骤(并且当与 药物组合时直接杀灭丙型肝炎病毒)，而第二种靶向回肠的治疗性疫苗在派伊 尔结中的树突状T淋巴细胞中引发响应，其中T淋巴细胞作用为树突细胞。

当患者有修复脂肪肝疾病和早期肝硬化的需要时，可选择将这些丙型肝 炎疫苗与制动素联合使用，其为患有丙型肝炎感染的病人提供了最大的益处。 在实施例7中公开了制动素疗法，并与被胆固醇体递送的丙型肝炎疫苗结合 在此掺入，并被递送至回肠从而作用于树突细胞上。这些产品还可与抗病毒 化合物(如索氟布韦)联合使用以降低病毒负载。

实施例10胆固醇体在用于伤口愈合、感染和炎症的蛋白质的局部递送 以及在美容剂的局部递送中的用途

在本发明中，通过IV注射用来治疗传染性疾病的分子一般适于被包裹到 胆固醇体中，并作为油膏或乳剂局部使用。

多数实施例3中公开的抗生素需要由静脉内(IV)注射，因为该分子通常 亲水，且不被经口吸收。因此在胆固醇体中使用使得它们能够被吸收到外表 皮中。很多其它小分子和大分子可根据本发明在胆固醇体中使用并被局部给 药，包括抗真菌剂、抗病毒剂、抗癌剂和用作生长因子的蛋白质和肽分子。

通过用胆固醇体包裹分子使得很多用于治疗疾病的局部施用成为可能。 一些非限制性实例包括用局部血小板衍生的生长因子(包括与本领域其它已 知对伤口愈合有益的生长因子组合)来使伤口愈合。

其它的实例为抗TNF抗体的局部使用，如阿达木单抗(Humira)或英夫利 昔单抗(瑞米凯德)或很多其它局部用于银屑病和其它皮肤炎症疾病的类似分 子，其中这些产品目前通过皮下注射给药。在2013年，近四百一十万人被诊 断为一些类型的中度至严重的银屑病。预期该数值在2020年轻度攀升至四百 四十万，其中该人口中的一百五十万用全身性试剂治疗。银屑病的全球患病 率的提高以及由改善的诊断方法造成的诊断率的增加将增加可注射单克隆抗 体的需求，但也证明很多这些产品应用于局部胆固醇体中。随着银屑病被越 来越多地认为是一种与生活质量的损害和残疾相关的严重的全身性疾病，而 非简单的皮肤病，健康护理专业人员会认为胆固醇体包裹的蛋白质和肽相对 于以前的次优治疗更为优选。胆固醇体制剂也将使目前被注射的疫苗被局部 给药，并且发明人在实施例9以及此前的现有技术中提供的实例作为非限制 性实例被包括于此。

这些分子在其天然状态下都不被经口吸收，并且在每种情况中相对于目 前需要将其在肠胃外注射，经口吸收都将带来主要优势。它们也可用于治疗 局部区域的疾病，从而完全避免由于通过注射进行全身性给药而带来的药物 副作用。

用于治疗皮肤感染的妥布霉素

说明此处所公开的分子的优选实施方案为妥布霉素，其根据实施例1中 所列举的原则选自该列表中以用于制备并测试胆固醇体包裹的妥布霉素。具 体制剂被设计为用于口服使用，并用于增加抗生素妥布霉素针对目标革兰氏 阴性细菌(如铜绿假单胞菌)的总体活性。局部妥布霉素制剂可有效控制假单胞 菌疾病恶性外耳炎或被吸入以有效控制患有囊性纤维化患者中的假单胞菌。

作为具体实例，如实施例1所述，以本发明的方式制备平均直径为250 至1,000nm的妥布霉素胆固醇体，其中胆固醇酯选自实施例2中优选公开的 酯。使用两种胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的新型混合物 制备含有妥布霉素的胆固醇体。

胆固醇酯促进皮肤递送

胆固醇体包裹的分子在美容应用中发挥作用的能力是本领域中预期的发 现。

主要的脂质为神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸。这些角质层脂质基质的 成分在哺乳动物皮肤屏障功能中起到重要作用。

Kravchenko及同事在大鼠和小鼠中研究了胆固醇酯在体内和体外渗透角 质层的效果，以及通过荧光计方法研究了胆固醇酯在脂质体的卵磷脂流动性 上的效果。

该研究表明，向该经皮递送系统(TDS)中加入胆固醇酯增加了芬纳西泮 (phenazepam)对角质层的渗透性。他们在月桂酸胆固醇酯、壬酸胆固醇酯、十 一酸胆固醇酯和己酸胆固醇酯(cholesterylcapronate)存在下的脂质环境中观察 到最大的流化作用。因而，发现胆固醇酯是经皮递送的有效增强剂，并导致 此处所公开的现用途。

用于治疗黑色素瘤的姜黄素的局部用途

实施例5中所公开的二氟姜黄素(CDF)的胆固醇体制剂也可局部用于治 疗皮肤癌。

此前Chen在2012年对脂质体和姜黄素进行的研究通过使用脂质体作为 经皮药物递送系统，调查了姜黄素在体外的皮肤渗透以及体内的抗瘤效果。 选择大豆磷脂(SPC)、蛋黄磷脂(EPC)和氢化大豆磷脂(HSPC)用于制备不同种 类的磷脂，其由负载有姜黄素的脂质体构成：C-SPC-L(负载姜黄素的SPC脂 质体)、C-EPC-L(负载姜黄素的EPC脂质体)和C-HSPC-L(负载姜黄素的 HSPC脂质体)。如下调查不同脂质体的物理性质：光子相关光谱揭示了三种 类型的负载姜黄素的脂质体的平均粒度分别为82.37±2.19nm(C-SPC-L)、 83.13±4.89nm(C-EPC-L)和92.42±4.56nm(C-HSPC-L)。发现包裹效率值分 别为82.32±3.91％、81.59±2.38％和80.77±4.12％。体外皮肤渗透研究表明 C-SPC-L最显著地促进了药物渗透和沉积，其次是C-EPC-L、C-HSPC-L和姜 黄素溶液。此外，C-SPC-L在所有负载的脂质体中显示了抑制B16BL6黑色 素瘤细胞生长的最大能力。因此，选择C-SPC-L用于进一步的药效评估。与 姜黄素溶液的体内治疗相比，对C-SPC-L观察到对抗黑色素瘤活性的显著效 果。这些结果表明，在癌症治疗中，C-SPC-L将是一种有希望的姜黄素经皮 载体。

该使用二氟姜黄素CDF的胆固醇体制剂局部治疗癌症的实施例不应被理 解为限制性的，并且实施例5种公开的任何抗癌化合物都应能够合适地通过 被包裹在胆固醇体中而用于局部用途。

实施例11胆固醇体在局部递送到肺中的用途

在本发明中，一般来说，通过IV注射而用来治疗传染性疾病的分子都适 于被包裹在胆固醇体中并用于吸入，其中期望通过胆固醇体的递送增加被包 裹的化合物向肺泡和支气管衬里的细胞中的渗透。这相对于现有技术中对脂 质体的使用来说是新颖的，其中脂质体不会渗透细胞，仅仅是在较长的时间 段内将脂质体中的化合物保持在位点处，而不会增加细胞渗透。

因而，通过雾化胆固醇体包裹的纳米颗粒的该递送途径是合理的，并可 大幅增加对肺部疾病(如哮喘、COPD、肺癌、囊性纤维化，甚至罕见的状况， 如α-1抗胰蛋白酶缺乏)的效果。

实施例3中所公开的多数抗生素需要进行静脉内(IV)注射，因为这些分 子通常是亲水性的，并且不会被经口吸收。因而通过吸入而在胆固醇体中的 使用可以通过此处所公开的其增强的细胞渗透机制使它们能够直接被吸收到 肺中。根据本发明，可用于胆固醇体中并通过吸入给药的多种其它小分子和 较大分子包括抗真菌剂、抗病毒剂、抗癌剂和用作生长因子的蛋白质和肽分 子。

通过胆固醇体包裹分子，很多肺部疾病应用可用来治疗疾病。一些非限 制性实例包括用血小板衍生的生长因子修复肺泡的病毒或化学灼伤损伤，包 括与其它本领域已知对伤口愈合有利的生长因子的组合。

注意会需要非常小的纳米颗粒以将胆固醇体包裹的分子包含在吸入器 中，对于本应用而言可能小于100nm。

提供了在脂质体中使用的化合物的一些非限制性实例以证明通过胆固醇 体包裹来改善肺中的细胞内递送构思和途径(roadmap)：

伊洛前列素实例：

Kleemann等人，PharmRes2007：肺动脉高压(PAH)是一种严重且是进行 性的疾病。前列腺环素类似物伊洛前列素针对PAH有效，但需要每天吸入6 到9次。从技术角度评估了脂质体用来提供持续释放制剂以减少吸入频率的 可行性。

制备了由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇(CH)和聚乙二醇-二棕榈酰 磷酯酰乙醇胺(DPPE-PEG)的脂质体制剂。使用动态光散射、原子力显微镜和 差示扫描量热法调查了它们的物理化学性质。使用三种不同的喷雾器(空气喷 射、超声和振动网)调查了在雾化期间相对于药物负载和脂质体大小、雾化前 和雾化后的脂质体的稳定性。

磷脂组合物仅在200至400nm的范围内使脂质体直径轻微变化。在 DPPC/CH(70:30摩尔比)脂质体中观察到了最高的伊洛前列素负载量(12 mcg/ml)和足够的脂质体稳定性(雾化后70％的药物包裹)。通过相对较高的相 转化温度(53摄氏度)和不变的粒度确认了制剂的稳定性。在脂质体中加入 DPPE-PEG(DPPC/CH/DPPE-PEG，50:45:5摩尔比)使稳定性降低(雾化后 20-50％的药物包裹)和35摄氏度的相转化温度。相对于其它喷雾器，振动网 喷雾器在所有调查的脂质体中提供了一些显著优点，包括产生较小的气雾剂 液滴、高输出以及对身体的最低有害影响。

含有DPPC和CH成分的负载有伊洛前列素的脂质体产生了非常适合通 过振动网喷雾器雾化的制剂。

使用200至400nm大小的脂质体对成功的商业开发来说可能过大。

沙丁胺醇

ElhissiAM等人，JPharmPharmacol.2006；58:887-94。通过加入等渗的 氯化钠或蔗糖溶液，由乙醇基大豆磷脂酰胆碱前体脂质体制剂制备多层和寡 层(oligolamellar)脂质体。所得脂质体包裹了高达62％可用的硫酸沙丁胺醇酯， 相对地，常规制备的脂质体仅包裹1.23％。使用空气喷射喷雾器(PariLCPlus) 或振动网喷雾器(AeronebPro小网、AeronebPro大网或OmronNEU22)使制 剂雾化。所有振动网喷雾器产生的气雾剂液滴相对于空气喷射喷雾器具有更 大的体积中值直径(VMD)和更窄的大小分布。脂质体分散介质的选择对Pari 喷雾器的性能具有很小的影响。然而，对于AeronebPro小网和OmronNE U22，蔗糖溶液的使用趋于增加液滴VMD并降低气雾剂质量和来自喷雾器的 磷脂输出。对于AeronebPro大网，蔗糖溶液增加了雾化液滴的VMD，增加 了磷脂输出，并对气雾剂质量输出不产生效果。无论制剂为何，OmronNEU22 喷雾器都产生最高的质量输出(约100％)，且与蔗糖分散的制剂相比，NaCl 分散的脂质体的递送效率要高的多。雾化使得大量被包裹的药物从脂质体中 损失掉，且这伴随着囊泡大小的降低。有这种倾向，振动网喷雾器的药物损 失小于喷射喷雾器。大孔径网(8mum)AeronebPro喷雾器增加了被递送到双 碰撞器(twinimpinger)靠后阶段的包裹药物比例。该研究表明可使用空气喷射 或振动网喷雾器将产生自前体脂质体制剂的脂质体雾化成小液滴。与喷射喷 雾器相反，振动网喷雾器的性能极大地取决于制剂。所使用的喷雾器提供的 高磷脂输出表明，空气喷射和振动网雾化都可提供将被脂质体包裹或溶解的 疏水性药物递送至气道的潜力。

用于吸入的胆固醇体制剂

被包裹在100nm以下的胆固醇体中并通过气雾剂递送来使用的目标化合 物包括用于囊性纤维化感染的妥布霉素、用于肺癌的二氟姜黄素、用于肺癌 的siRNA、用于由MRSA造成的肺炎的万古霉素、用于由MRSA造成的肺炎 的头孢洛林、用于革兰氏阴性肺炎的磷霉素。

用于嗜酸细胞性哮喘的美泊利单抗

一种近来开发的还处于临床开发阶段的单克隆抗体是单克隆抗体的吸入 性胆固醇体制剂的另一实例。美泊利单抗，一种调查研究的完全人化的IgG1 IL-5特异性单克隆抗体，在患有严重的嗜酸细胞性哮喘的患者的两项三期研 究中都实现了其主要目的，其中高剂量的吸入性皮质类固醇和添加的控制药 物并未使所述患者降低其恶化程度。在双盲、平行组、多中心、安慰剂对照 的随机化MEA115588研究中，在32周的总时间段内每4周一次，对576名 12岁以上的患者给药75mg的静脉注射美泊利单抗或100mg的皮下注射(SC) 美泊利单抗。在75-mgIV治疗组中47％的患者和在100-mgSC治疗分支中的 53％的患者实现了研究的主要目的，即降低恶化程度。在第二项双盲、平行 组、多中心、安慰剂对照的随机化研究(称作MEA115575)中，在24周的总时 间段内每4周一次，对135名12岁以上的患者给药100mg的SC美泊利单 抗。该研究在20-24周期间实现了其主要目的，即减少口服皮质类固醇的使 用，同时保持控制哮喘。公司计划申请对美泊利单抗的监管批准，这将继续 美泊利单抗在COPD和伴随多脉管炎的嗜酸性肉芽肿中的调查开发。

显然，美泊利单抗的吸入性胆固醇体制剂将会是该产品的皮下注射的一 种可行的替代方式，且细胞内渗透可使得剂量要求相对于目前每月100mg的 要求降低至其10分之一至100分之一。因此，这是开发用于吸入用途的约5 mg的该单克隆抗体的胆固醇体制剂的一个优选实施方案。除了降低剂量要 求，通过吸入而局部使用该产品将在有此需要的患者中立刻产生响应，并将 在此后有利地降低对针对嗜酸性免疫响应的有效抑制剂的全身性暴露，保护 寄生侵入物宿主。

以在常用于疾病治疗的分子大小范围内的已知分子的吸入性胆固醇体制 剂的实例的方式提供了该列表，并且不以任何形式限制胆固醇体在包裹所有 大小的分子方面以及当用于肺病的吸入性治疗时的用途。

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