TNFα抑制剂多肽、编码多肽的多核苷酸、表达多肽的细胞和生成多肽的方法

摘要

提供了一种植物生成的TNFα多肽抑制剂。还提供了生成和使用所述抑制剂的方法。

说明书

技术领域和背景技术

本发明，在其一些实施方案中，涉及TNFα抑制剂多肽、编码多肽的多核苷酸、表达多肽的细胞和生成多肽的方法。

肿瘤坏死因子α(TNFα)是介导对不同炎症、感染和免疫相关过程和疾病的调节的重要促炎性细胞因子，TNFα被视为是造成炎症性病理最重要的介质。

TNF-α为17kD分子量蛋白质，最初作为呈稳定三聚体排列的跨膜蛋白合成，然后受金属蛋白酶-TNFα转化酶(TACE)裂解形成与其泛表达的同源受体(TNFRI、p55和TNFRII、p75)接合的同型三聚体可溶性TNF(sTNF)。泛在TNF受体为多种多样的TNF-α介导的细胞反应提供了基础。

TNF-α诱导了多种多样的细胞反应，其中许多导致有害后果，例如恶病质(脂肪损失及全身蛋白质损耗，导致厌食症，这在癌症和AIDS患者中常见)和败血性休克。TNF-α的分泌提高已经涉及到多种人类疾病包括糖尿病、同种异体移植物排斥、脓毒症、炎症性肠病、骨质疏松症，许多自身免疫性疾病例如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、超敏反应、免疫复合物疾病，并且甚至涉及到疟疾、癌症和肺部纤维化。

TNFα的生物学效应受两种不同受体介导。TNF-α受体，从单核细胞中流出时，通过“擦洗”并用作天然抑制剂降低TNF-α水平。通过特异性抗体和诱捕受体中和TNFα已经成为调节TNFα介导的毒性的常见策略。

迄今为止，USFDA已经批准了5种蛋白基TNFα拮抗剂供临床使用：Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumabpegol))，TNFmAbFab片段-PEG偶联物；Remicade(英利昔单抗(Infliximab))，TNFrmAB；Humira(阿达木单抗(Adalimumab))，TNFrmAB；Simponi^TM(戈利木单抗(Golimumab))，抗TNF和依那西普(etanercept)，与人IgG的Fc片段融合的可溶性75kDaTNFα受体的融合蛋白(登记为Enbrel^TM)。

依那西普适用于类风湿性关节炎(RA)和其它关节炎适应症例如幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病和强直性脊柱炎(AS)。类风湿性关节炎(RA)是影响全世界约五百万人的一种慢性疾病。全世界有适应症的近500,000名患者用Enbrel治疗。2010年Enbrel销售额为78亿美元并且抗TNF市场总额达240.4亿美元。当前或完成的Enbrel疗法的临床试验包括诸如成人呼吸窘迫综合征、天疱疮、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)、白塞氏综合征(Behcet’ssyndrome)、HIV、心肌梗塞、膝关节滑膜炎、狼疮性肾炎、扁平苔癣、全身性淀粉样变性病、坐骨神经痛、白癫风、慢性疲劳综合征、厌食、TMJ、哮喘、支气管炎、糖尿病、骨髓增生异常疾病等不同适应症。

当前在哺乳动物细胞中生成Enbrel。由于新兴病原体，最为显著的是HIV、HCV、库贾氏症(Cruezfeld-Jacob’sDisease)、西尼罗病毒(WestNileVirus)和SARS在世界多个地区的爆发，加强了在生物药品的生产中通过使用人或动物源性原材料，例如血源性产品(血清、浆细胞基质组分等)传播病原体的风险，最近生物药品的安全性对于患者和医疗服务人员而言已成为热门话题。例如，在病毒鉴定和筛选变得普遍之前约一半(！)的血友病人群感染了HIV。

筛选和试验最近有所改善，减少了病原体传播的威胁，但是在重组生产过程中仍有风险来自于血浆源性添加剂。具体而言，来自于未知病原体的风险显著，因为这些试剂将来可能出现在血液供给中并且可对基于哺乳动物细胞的生物药品的安全性有显著影响。特别关注的是需要重复、定期施用，特别是经由注射施用的生物药品，为患者增加了累积风险。

然而，从培养基中除去动物源性组分可显著改变培养性能以及翻译后蛋白质修饰。抗体分子的糖基化模式可以影响其结构完整性，从而影响其生物学功能、物理化学性质和药代动力学，改变功效和安全性，特别是免疫原性。虽然近几年内尚未发生大规模爆发，但是减少生物药品生产中对血液和血浆组分的依赖仍至关重要。相反，在哺乳动物细胞培养中重组蛋白生成由于异源污染而不安全。2009年Genzyme由于病毒污染而被迫临时关闭其主要工厂。2011年前其未恢复全部药物供应。在美国由于唯一批准用于法布里病(Fabry)患者的药物的缺乏，一些患法布里病的人遭受了心脏或肾脏问题并且一个或多个患者甚至可能由于所述缺乏而死亡。

非哺乳动物细胞，例如植物细胞培养物是项有希望的研发。

生物药品，包括经修饰的人类蛋白，可在转基因植物中生成以便解决安全性、病毒感染、免疫反应、生产产量和成本的问题。美国专利第6,391,638号和PCTWO2008/135991讲授了用于由植物细胞培养商业规模生产重组多肽的生物反应器装置。美国专利第7,951,557号、美国专利申请第10/554,387和11/790,991号讲授了用于在植物细胞中重组表达人类蛋白的核酸载体的构建和表达。PCTWO2007/010533讲授了供肠内施用的重组人多肽在植物细胞中的表达。

另外的背景技术包括：Finck等的美国专利第7,915,225号，Finck等的美国专利申请第13/021,545和10/853,479号，Li等的美国专利申请第11/906,600号，Warren等的美国专利申请第10/115,625号和Gombotz等的美国专利申请第11/784,538号。

发明内容

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种植物生成的TNFα多肽抑制剂。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂为抗TNFα抗体。

根据本发明的一些实施方案，所述抗TNFα抗体选自英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗和戈利木单抗。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂为特异性结合TNFα的可溶性TNFR片段。

根据本发明的一些实施方案，所述可溶性TNFR片段为嵌合多肽的一部分。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂，其中所述嵌合多肽包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域，和

(ii)包含免疫球蛋白的Fc结构域的第二结构域；其中所述第一结构域和所述第二结构域N端与C端分别依次翻译性融合并且其中所述嵌合多肽特异性结合TNFα。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽还包含含内质网滞留信号的第三结构域，其中所述第一结构域、第二结构域和第三结构域N端与C端分别依次翻译性融合。

根据本发明的一些实施方案，TNFα多肽抑制剂包含编码内质网信号肽，N端与所述第一结构域翻译性融合的附加结构域。

根据本发明的一些实施方案，所述信号肽为植物信号肽。

根据本发明的一些实施方案，所述植物信号肽如SEQIDNO:4中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域为200-250个氨基酸长。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域包含氨基酸序列LCAP(SEQIDNO:11)和VFCT(SEQIDNO:12)。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域还包含氨基酸序列LPAQVAFXPYAPEPGSTC(SEQIDNO:13)。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域如SEQIDNO:2中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述免疫球蛋白为IgG₁。

根据本发明的一些实施方案，所述第二结构域如SEQIDNO:9中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽如SEQIDNO:6中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽如SEQIDNO:7、204或205或214中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽能够抑制TNFα诱导的凋亡。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂包含植物特有的聚糖。

根据本发明的一些实施方案，所述植物特有的聚糖选自核木糖和核α-(1,3)岩藻糖。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽经纯化达至少98％同质性。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂能够抑制TNFα诱导的凋亡。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种分离多核苷酸，其包含编码TNFα多肽抑制剂的核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，为烟草(Nicotiniatabaccum)优化所述核酸序列的密码子使用。

根据本发明的一些实施方案，所述分离多核苷酸如SEQIDNO:5中所示。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种核酸表达构建体，其包含编码所述多核苷酸的核酸序列和在植物细胞中有活性的顺式作用调控元件。

根据本发明的一些实施方案，所述顺式作用调控元件为启动子。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种植物细胞，其包含所述核酸构建体。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞为烟草植物细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述红花烟草植物细胞(NicotianatabacumL.cv)为亮黄色(BY-2)细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞经冻干。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种植物细胞悬浮培养物，其包含所述植物细胞。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的所述多肽和药学上可接受的载体。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的所述植物细胞和药学上可接受的载体。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗TNFα相关医疗状况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述多肽，从而在所述受试者中治疗所述TNFα相关医疗状况。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗TNFα相关医疗状况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述植物细胞，从而在所述受试者中治疗所述TNFα相关医疗状况。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽用于在受试者中治疗TNFα相关医疗状况。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞用于在受试者中治疗TNFα相关医疗状况。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了所述多肽在受试者中治疗TNFα相关医疗状况的用途。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了所述植物细胞在受试者中治疗TNFα相关医疗状况的用途。

根据本发明的一些实施方案，所述医疗状况为炎症性疾病。

根据本发明的一些实施方案，所述医疗状况为自身免疫性疾病。

根据本发明的一些实施方案，所述医疗状况选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、斑块状银屑病和幼年特发性关节炎。

根据本发明的一些实施方案，所述医疗状况为炎症性肠病。

根据本发明的一些实施方案，所述炎症性肠病选自结肠炎或克罗恩氏病(Crohn'sdisease)。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽经配制供肠胃外施用。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽经配制供口服施用。

根据本发明的一些实施方案，所述医疗状况选自类风湿性关节炎、炎症性肠病、脓毒症、内毒素休克、AIDS、子宫内膜异位、银屑病、心血管疾病、癌症、白癫风、关节炎、类风湿性多发性关节炎、银屑病性风湿病、强直性脊柱炎、斑块状银屑病、幼年特发性关节炎、多关节幼年特发性关节炎、银屑病性关节炎、韦格纳氏病(Wegener'sdisease)(肉芽肿)、克罗恩氏病、短肠综合征、溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、丙型肝炎、哮喘、恶病质、特应性皮炎、阿尔茨海默氏病、肝性脑病、ADHD、慢性疲劳综合征、疱疹样皮炎(杜林病(Duhring'sdisease))、接触性皮炎、荨麻疹(包括慢性特发性荨麻疹)、自身免疫性疱病(包括寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮)、重症肌无力、结节病(包括肺结节病、硬皮病、反应性关节炎、高IgE综合征、多发性硬化和特发性嗜酸粒细胞增多综合征)及变态反应。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽经配制供肠胃外施用。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞经配制供肠内施用并且其中所述医疗状况并非肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种生成所述多肽的方法，其包括：

提供如所述的细胞；并且

培养所述细胞以便生成所述多肽。

根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括从所述细胞中分离所述多肽。

根据本发明的一些实施方案，所述细胞是在植物细胞培养基中培养的分离细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述培养在一次性生物反应器中进行。

除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等效的方法和材料可用于本发明实施方案的实践或试验中，但是下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性而非旨在为必要性限制。

附图说明

本文仅以举例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参考附图，应强调所示细节为举例而言并且是为了说明性讨论本发明实施方案的目的。在这一点上，随图所做的描述使得对于本领域的技术人员而言可以如何实践本发明的实施方案显而易见。

图中：

图1为植物重组人(prh)TNFR2:Fc的氨基酸序列(本文也称为PRX-106，SEQIDNO:6)的示意图。用于在BY2细胞内表达的prhTNFR2:FccDNA装配有信号肽以将由TNF受体的TNF结合部分和FC蛋白组成的融合多肽靶向分泌途径。所述氨基酸序列的色码：信号肽着黄色；TNF受体部分着黑色(绿色)；IgG1的Fc部分呈蓝色；ER滞留信号呈红色。

图2A-B示出了通过蛋白质印迹对PRHTNFR2:FC和商用Enbrel的比较。在还原条件(图A)和非还原条件(图B)下分别通过12％和8％Tris-GlycineSDS-PAGE分析prhTNFR2:Fc(泳道1)和商用Enbrel(泳道2)。膜沾上抗FC抗体(上图)和抗TNFR2抗体(下图)。在右侧泳道中示出了分子量。泳道1：PRHTNFR2:FC；泳道2：商用Enbrel。

图3为示出通过对prhTNFR2:Fc结合活性和分子完整性的定量非放射性测定测得的TNFα受prhTNFR2:Fc和商用Enbrel的结合的图。用TNFα培育预涂有TNFα抗体的ELISA板，接着暴露于商用Enbrel和来自于表达prhTNFR2:Fc的BY2细胞的上清液。X轴上示出了两种试验品的连续稀释度。用山羊抗人IgGFcHRP检测到分子的Fc部分。

图4为示出通过蛋白质印迹分析筛选用于表达prhTNFR2:Fc的单细胞系的图像。

图5A-F为示出在prhTNFR2:Fc或商用Enbrel的存在下通过MTT活力测定测得的A375细胞中的TNFα细胞毒性的图像。图5A-未经处理培养的A375细胞；图5B-经TNFα处理；图5C-经prhTNFR2:Fc(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图5D-经商用Enbrel(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图5E-经prhTNFR2:Fc(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图5F-经商用Enbrel(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞。

图5G为示出在prhTNFR2:Fc或商用Enbrel的存在下通过MTT活力测定测得的A375细胞中的TNFα细胞毒性的柱状图。

图6A-F为示出在prhTNFR2:Fc或商用Enbrel的存在下通过MTT活力测定测得的L929细胞中的TNFα细胞毒性的图像。图6A-未经处理培养的L929细胞；图6B-经TNFα处理；图6C-经prhTNFR2:Fc(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图6D-经商用Enbrel(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图6E-经prhTNFR2:Fc(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图6F-经商用Enbrel(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞。

图6G为示出显示在prhTNFR2:Fc或商用Enbrel的存在下通过MTT活力测定测得的L929细胞中的TNFα细胞毒性的图像的柱状图。

图7A-B为示出在TNBS激发后的体重变化的图。小鼠在TNBS诱导6小时后口服施用prhTNFR2:Fc。连续4天每天测定体重(平均值±SE)。图7A-用TNBS处理后第4天的平均减重，表示为从原重的减少％。柱1-盐水对照(n＝15)；柱2-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝15)；柱3-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量I)(n＝15)；柱4-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量II)(n＝7)；柱5-经地塞米松(Dexametason)处理的小鼠(n＝10)；柱6-对照小鼠(n＝5)。图7B-用TNBS处理后4天期间的平均减重，表示为从原重的减少％。注意用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞口服治疗减弱了体重下降。

图8为显示口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞抑制TNBS诱导的结肠缩短的柱状图。有结肠炎的小鼠在TNBS诱导后连续4天口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞并且在第4天测定结肠长度(平均值±SE)。从左到右：柱1-对照小鼠(n＝5)；柱2-盐水对照(n＝15)；柱3-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝15)；柱4-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量I)(n＝15)；柱5-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量II)(n＝7)；柱6-经地塞米松处理的小鼠(n＝10)。

图9为显示口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞改善了TNBS诱导的结肠炎的宏观未来的柱状图。在实验终点时对照和经处理大鼠中的总体宏观炎症评分(华莱士评分(Wallacescore))(平均值±SE)。柱1-对照小鼠(n＝5)；柱2-盐水对照(n＝15)；柱3-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝15)；柱4-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量I)(n＝15)；柱5-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量II)(n＝7)；柱6-经地塞米松处理的小鼠(n＝10)。

图10A-C为示出了用细胞因子抗体芯片测量的通过口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞处理的小鼠体内的血清细胞因子含量的柱状图。从经模拟宿主植物对照细胞(BY2-)(n＝15)和表达重组TNFR2:Fc蛋白剂量I(n＝15)和剂量II(n＝7)的植物细胞处理的组收集血清并进行细胞因子磁性Luminex测定。TNBS-盐水对照(n＝15)；模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝15)；表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量I)(n＝15)；表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量II)(n＝7)；经地塞米松处理的小鼠(n＝10)；对照小鼠(n＝5)。

图11A-B示出了用细胞因子抗体芯片测量的血清细胞因子含量。图11A-汇合、收集来自于经模拟宿主植物对照细胞(BY2-)(n＝15)和表达重组TNFR2:Fc蛋白剂量I(n＝15)和剂量II(n＝7)的植物细胞处理的组的血清并进行细胞因子抗体芯片分析。图11B-细胞因子芯片量化。结果表明用PRX-106处理降低了炎症介质如粒细胞集落刺激因子G-CSF、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的水平，潜在表明通过从血液中降低骨髓源性细胞的全身性募集减轻了全身炎症。

图12为示出经表达重组TNFR2:Fc的植物细胞处理的动物中脾脏Treg群体扩张的柱状图。分析在TNBS诱导的结肠炎期间用PRX-106处理的Balb/c小鼠的脾脏的CD4+CD25+Foxp3+百分比，线条示出了SE。柱1-盐水对照(n＝15)；柱2-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝15)；柱3-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量I)(n＝15)；柱4-表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞(剂量II)(n＝7)；柱5-经地塞米松处理的小鼠(n＝10)；柱6-对照小鼠(n＝5)。

图13A-B为示出DSS激发后的体重变化的图。有结肠炎的小鼠在DSS诱导24小时后连续7天口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞并且测定小鼠的体重(平均值±SE)。图13A-用DSS处理后第10天的平均减重，表示为从原重的减少％。柱1-盐水对照(n＝10)；柱2-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝10)；柱3-口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞(n＝10)；柱4-对照小鼠(n＝5)。图13B-用DSS处理后10天期间的平均减重，表示为从原重的减少％。注意用表达重组TNFR2:Fc的PRX-106-植物细胞口服治疗减弱了体重下降。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图14A-B显示口服施用TNFR2:Fc抑制DSS诱导的结肠缩短。有结肠炎的小鼠在DSS诱导后连续7天口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞并且在第10天测定结肠长度(平均值±SE)。图14A-柱1-盐水对照(n＝10)；柱2-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝10)；柱3-表达重组TNFR2:Fc的植物细胞(剂量I)(n＝10)；柱4-对照小鼠(n＝5)。图14B-DSS诱导结肠炎10天后结肠的代表性照片。

图15A-C为从经处理小鼠获得的结肠中细胞因子谱的图示。通过体外培养钻取活组织检查从柱1-接受盐水对照的DSS处理小鼠(n＝10)；柱2-接受模拟宿主植物对照细胞的DSS处理小鼠(BY2-；n＝10)；柱3-接受表达30μg重组TNFR2:Fc的植物细胞的DSS处理小鼠(n＝10)；柱4-未经处理的对照小鼠(n＝5)的结肠收获的细胞因子分泌。

图16A-C为用细胞因子抗体芯片测定的血清细胞因子含量的图示。从经模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝15)和表达重组TNFR2:Fc蛋白的植物细胞(n＝10)处理的小鼠收集血清并进行细胞因子磁性Luminex测定。柱1-盐水对照(n＝10)；柱2-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝10)；柱3-口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞(n＝10)；柱4-对照小鼠(n＝5)。*P<0.05。

图17A-B显示经口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的治疗性治疗降低了DSS诱导的结肠炎的严重程度。图17A-在H&E染色后以x40和x100放大倍数用显微镜检查代表性组织切片。图像代表每组至少7只小鼠。图17B-测定口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的效果。白色方块-表达重组TNFR2:Fc的植物细胞(n＝7)，灰色方块-模拟宿主植物对照细胞(BY2-；n＝10)，黑色方块-盐水对照(n＝8)。**P<0.01，***P<0.001。

图18为示出大鼠血清中TNFR2:Fc的药代动力学的柱状图。通过自由采食开始表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的口服施用。大鼠(n＝6)接受表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。阴性对照接受接受相同体积的宿主BY2(-)植物。

图19为示出在通过强饲法口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞后大鼠血清中TNFR2:Fc的药代动力学的柱状图。大鼠(n＝6)接受表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。阴性对照接受接受相同体积的宿主BY2(-)植物。

图20示出了通过质谱法阐明的PRX-106序列(SEQIDNO:6)(绿色显示84.8％覆盖率)。

具体实施方式

本发明，在其一些实施方案中，涉及嵌合多肽、编码嵌合多肽的多核苷酸、表达嵌合多肽的细胞和生成嵌合多肽的方法。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用方面不一定限于以下说明中提出的细节或通过实施例举例说明。本发明能够有其它实施方案或能够以不同方式实践或实施。

TNFα促进炎症反应，这样又引起与炎症、癌症和自身免疫性病症例如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、短肠综合征、银屑病、化脓性汗腺炎和难治性哮喘相关的许多临床问题。这些病症有时通过使用TNF抑制剂治疗。在过去十年间，FDA已经批准了许多重组蛋白作为TNFα抑制剂用于治疗主要适应症，其中为依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗和戈利木单抗。

哺乳动物细胞系统中重组蛋白的生成受细胞脆性和细胞复杂的营养需求及病毒或朊病毒对最终产物的可能污染所妨碍。

依那西普为适用于许多炎症性病状例如类风湿性关节炎、多关节幼年特发性关节炎、斑块状银屑病、银屑病关节炎和强直性脊柱炎的肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂。依那西普是通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢哺乳动物细胞表达系统中生成。

在简化本发明以实践的同时，本发明人已经构建了用于在植物细胞中重组表达依那西普(下文称为prhTNFR2:Fc)的表达载体，用所述载体转化烟草细胞，并且已经从细胞培养物中分离出了有催化活性的蛋白质。表达的重组蛋白保持其TNFα结合活性并且通过其凋亡调控活性所证明，已经显示出有利的催化活性。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种植物生成的TNFα多肽抑制剂。

如本文中所用的“TNFα多肽抑制剂”指结合TNFα并且正如在TNFα与包括以下任一种在内的TNFα受体(TNFR)的结合中所反映，抑制和/或阻碍TNFα活性的多肽：(a)TNFR，优选内源(即个体或宿主天然的)细胞膜结合型TNFR；(b)TNFR的胞外结构域；和/或(c)TNFR的TNFα结合结构域(其可为胞外结构域的一部分)。根据本发明的一个特定实施方案，抑制TNFα与受体的结合至少50％，例如50-100％、50-95％、60-90％或甚至70-90％。

TNFα抑制剂包括但不限于特异性结合TNFα和抗TNFα抗体的可溶性TNFR(即，非膜结合型)或其一部分(片段)。

如本文中所用，TNFα抑制剂的“生物活性”是与TNFα结合并抑制和/或阻碍TNFα与以下任一种结合：(a)TNFR，优选内源细胞膜结合型TNFR；(b)TNFR的胞外结构域；和/或(c)TNFR的TNFα结合结构域(其可为胞外结构域的一部分)。可使用本领域中已知测量TNFα活性及其抑制的测定法证实TNFα抑制剂表现出生物活性，本文提供了其中一个实例。

如本文中所用，术语“TNF受体多肽”和“TNFR”指源自TNFR(来自于任何物种，例如人)的能够结合TNFα的多肽。已经描述了两种不同的细胞表面TNFR：II型TNFR(或p75TNFR或TNFRII)和I型TNFR(或p55TNFR或TNFRI)。成熟全长人p75TNFR是分子量为约75-80千道尔顿(kD)的糖蛋白。成熟全长人p55TNFR是分子量为约55-60kD的糖蛋白。本发明的优选TNFR多肽源自I型TNFR和/或II型TNFR。下文提供了示例性登记号。根据一个特定实施方案，TNFR能够以特定方式结合TNFα，例如Kd低于10^-5M。

根据一个特定实施方案，可溶性TNFR片段为嵌合多肽的一部分。

“嵌合多肽”或“融合蛋白”是包含在与自然界中出现的不同位置的区域的多肽。所述区域通常可出现在单独的蛋白质中并且在嵌合或融合多肽中聚集在一起，或其通常可出现在相同蛋白质中但是在嵌合或融合多肽中呈新的排列放置。嵌合或融合多肽也可由TNFR多肽的聚合形式产生，无论是直链还是支链。

如本文中所用，TNFR的“胞外结构域”指在TNFR的氨基端和TNFR跨膜区域的氨基末端之间发现的TNFR的一部分。TNFR的胞外结构域结合TNFα。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换用于指任何长度的氨基酸的聚合物。术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化或与标记组分偶联。

TNFα多肽抑制剂的具体实例包括但不限于英夫利昔单抗(Remicade^TM)和阿达木单抗(Humira^TM)，其分别由嵌合人-小鼠抗TNFα单克隆抗体和全人抗TNF-α单克隆抗体组成。可根据本发明教导使用的抗TNFα抗体的另一实例包括戈利木单抗(Simponi^TM)和聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Cimzia^TM)，后者为聚乙二醇化抗体并因而在重组多肽生成后需要修饰。

在这个定义下还包括嵌合多肽，在其范围内包括商用依那西普(下文有进一步描述)和来那西普(Lenercept)(由p55sTNF-RI-IgG1组成的嵌合多肽)。下文进一步描述了此类嵌合多肽。

因此，根据一个特定实施方案所述TNFα多肽抑制剂为一种嵌合多肽，其包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域和

(ii)包含免疫球蛋白的Fc结构域的第二结构域，其中所述第一结构域和所述第二结构域N端与C端分别依次翻译性融合并且其中所述嵌合多肽特异性结合TNFα。

如本文中所用术语“植物生成的”指与植物表达相关的化学特征，包括但不限于在包含嵌合多肽的制剂中的宿主细胞杂质及嵌合多肽本身的糖基化模式。

如本文中所用术语“TNFα”指肿瘤坏死因子-α(TNF、cachexin或恶病质素(cachectin)，其为涉及全身性炎症的细胞因子和刺激急性期反应的一类细胞因子的成员。TNFα虽然可由许多其它细胞类型如CD4+淋巴细胞、NK细胞和神经元生成，但主要由活化巨噬细胞(M1)生成。所述蛋白质由TNFA基因编码并且具有Ref_seq编号：NP_000585。已知所述蛋白质刺激炎症反应(促炎性细胞因子)。

因此第一结构域至少由TNF受体(TNFR)的TNF结合结构域组成。第一结构域为可溶性蛋白质。因此根据一个特定实施方案，第一结构域和甚至整个嵌合多肽为非膜锚定的可溶性蛋白质。

TNFR的可溶性形式可包括单体、融合蛋白(也称为“嵌合蛋白)、二聚体、三聚体或高级多聚体。在本发明的某些实施方案中，可溶性TNFR衍生物是体内模拟75kDaTNFR或55kDaTNFR并且与TNFα结合的TNFR。本发明的可溶性TNFR模拟物可源自其TNFRp55或p75片段。除p55和p75外的TNFR可用于得到用于治疗本文所述的各种医疗病症的可溶性TNFR，例如WO99/04001中所述的TNFR。用于构建TNFR模拟物的可溶性TNFR分子包括，例如具有至少20个氨基酸，缺乏天然TNFR的跨膜区并且能够结合TNFα的天然TNFR类似物或片段。TNFR的此类可溶性形式与细胞表面上的受体竞争TNFα，从而抑制TNFα与细胞结合，由此防止其表现其生物学活性。可使用ELISA或任何其它方便的测定法测定可溶性TNFR与TNFα的结合。

根据一个特定实施方案，第一结构域源自TNFR2。(例如，AAA36755)。

根据本发明的一个实施方案，第一结构域为200-250个氨基酸长。

根据一个特定实施方案，第一结构域包含氨基酸序列LCAP(SEQIDNO:11)和VFCT(SEQIDNO:12)。

根据一个特定实施方案，第一结构域包含氨基酸序列LPAQVAFXPYAPEPGSTC(SEQIDNO:13)或LPAQVAFTPYAPEPGSTC(SEQIDNO:17)。

根据一个特定实施方案，第一结构域如SEQIDNO:2中所示(由SEQIDNO:1编码)。

如本文中所用“免疫球蛋白的Fc结构域”指抗体重链的一个区域，通常包含重链的至少2个恒定区(例如，CH2和CH3结构域，因为本领域中定义了这些术语)。可通过用木瓜蛋白酶消化抗体，获得(例如)呈二聚体形式的Fc结构域。通过二硫键连接的Fc结构域多肽的二聚体形成抗体的“尾”区。正如本领域中所知，一些类别的抗体的Fc结构域可呈多聚体形式。因此，Fc结构域任选地为单体，任选地为二聚体和任选地为多聚体。任选地，本文所述的多肽呈二聚体形式，包含Fc二聚体的多肽，或呈多聚体形式，包含Fc多聚体的多肽。

Fc结构域可涵盖天然Fc结构域(即，抗体中自然发生的结构域)的修饰形式，例如与天然Fc结构域具有至少90％同源性，任选地至少95％同源性和任选地至少98％同源性的多肽。例如，在国际专利申请WO97/34631和WO96/32478中描述了经修饰的Fc结构域。

任选地，修饰天然Fc以便去除提供本发明的实施方案不需要的结构特征或生物活性的位点。此类位点的实例包括影响或涉及二硫键形成、与所选宿主细胞的不相容性、在所选宿主细胞中表达后N端不均一性、糖基化、与补体的相互作用、与Fc受体(除新生儿Fc受体外)的结合和/或抗体依赖性细胞毒性的残基。

根据本发明实施方案所述的多肽也可包含Fc结构域的片段。任选地，所述片段包含如上文所定义的Fc结构域的至少20％，任选地至少50％和任选地至少80％。

Fc结构域或其片段任选地包括新生儿Fc受体(FcRn)的结合位点。这在经由肠内途径施用嵌合多肽时具有特殊意义。

根据一个实施方案，Fc结构域或其片段与第一结构域的连接产生在体内具有比第一结构域本身更长的半衰期的多肽。这可能是由于Fc结构域的血清半衰期长(可能是由于经由与FcRn结合解救了Fc)和/或由于和第一结构域本身相比多肽的尺寸更大，降低了通过肾小球过滤从血流中的清除率。根据另一实施方案，所得多肽与第一结构域本身相比免疫原性降低。

根据任选实施方案，Fc结构域或其片段为人Fc结构域(例如，源自人抗体)或其片段。

根据示例性实施方案，Fc结构域(或其片段)为IgG(例如，IgG1)Fc结构域(或其片段)。

根据一个特定实施方案，第二结构域如SEQIDNO:9中所示(由SEQIDNO:8编码)。

因此，嵌合多肽的第二结构域包含免疫球蛋白恒定结构域，例如免疫球蛋白重链恒定结构域或免疫球蛋白轻链恒定结构域的至少一部分。优选地，第二结构域包含免疫球蛋白重链恒定结构域的至少一部分。免疫球蛋白重链恒定结构域优选为包含CH2和CH3结构域和，任选地，铰链区的至少一部分的Fc片段。免疫球蛋白结构域可为IgG、IgM、IgD或IgE免疫球蛋白结构域或由其得到的经修饰免疫球蛋白结构域。优选地，第二结构域包含IgG免疫球蛋白恒定结构域的至少一部分。IgG免疫球蛋白结构域可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4结构域或选自例如美国专利第5,925,734号中描述的修饰结构域。免疫球蛋白结构域可表现出效应功能。然而，在一些实施方案中，可使用效应功能经修饰，例如至少部分缺失的经修饰免疫球蛋白结构域。因此例如，所述受体。

根据本发明的一个实施方案，第一结构域和第二结构域的嵌合融合形成具有SEQIDNO:10的依那西普(Immunex)。

应了解根据受治受试者选择第一结构域和第二结构域的物种起源。因此，根据一个特定实施方案，第一结构域和第二结构域起源于人类或经修饰以致其在施用给人类受试者时不产生免疫原性反应。

如本文中所用“依那西普”和“Enbrel^TM”可交换用于指市场上可买到的ImmunexCorporation的TNFR2:Fc。依那西普是由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgG1的Fc部分连接组成的二聚融合多肽。依那西普的Fc组分含义重链2(CH2)恒定结构域、重链3(CH3)恒定结构域和铰链区，但不含人IgG1的重链1(CH1)恒定结构域。

根据本发明的另一个实施方案，提供了一种嵌合多肽，其包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域；

(ii)包含免疫球蛋白的Fc结构域的第二结构域；和

(iii)包含内质网滞留信号的第三结构域；

其中所述第一结构域、第二结构域和第三结构域N端与C端分别依次翻译性融合并且其中所述嵌合多肽特异性结合TNFα。

因此，根据本发明的这个方面，表达嵌合蛋白以致其留在内质网中。

如本文中所用，术语“内质网滞留信号肽”指存在于多肽的N或C端时，使多肽从高尔基体(Golgiapparatus)恢复并且留在内质网中的肽序列(参见Rayon等JournalofExperimentalBotany，第49卷，第326号，第1463–1472页，1998；和Neumann等AnnalsofBotany,2003；92:167-180)。在一个实施方案中，内质网滞留信号肽为HDEL(SEQIDNO:14)、KDEL(SEQIDNO:15)或SEKDEL(SEQIDNO:16)。

正如所提到的，第一结构域和第二结构域(和第三结构域，当存在时)N端与C端分别依次翻译性融合，这意味着第一结构域位于第二结构域N端(第一结构域的羧基端与第二结构域的N端翻译性融合)，并且第二结构域位于第三结构域N端(第二结构域的羧基端与第三结构域的N端翻译性融合)。因此，第二结构域实际上被N端的第一结构域和C端的第三结构域夹在中间。示意图如下：第一结构域>第二结构域(>第三结构域)从N端到C端有序定向(参见图1)。结构域之间的连接可直接或间接通过使用接头例如肽接头。

分子还可包含编码内质网信号序列，在第一结构域上游定向(N端)并与之翻译性融合的附加结构域。

如本文中所用“内质网(ER)信号肽”指信号序列、前导序列或前导肽，前导肽是存在于大多数新合成的注定朝向分泌途径的蛋白质N端的短(例如，5-30个氨基酸长)肽。

根据一个特定实施方案，ER信号肽源自(取自)植物蛋白。

根据一个特定实施方案，内质网信号肽来自于皱叶烟草(N.plumbaginifolia)钙网蛋白(Calreticulin)。

根据本发明的另一个特定实施方案，来自于皱叶烟草钙网蛋白的信号肽如SEQIDNO:4中所示并且由SEQIDNO:3的核酸序列编码。

如本文中所用术语“在N端翻译性融合”或“在C端翻译性融合”指通常由于重组表达所示肽经由肽键与各结构域的N端或C端氨基酸共价连接。

根据一个特定实施方案，嵌合多肽如SEQIDNO:6中所示。

根据一个特定实施方案，嵌合多肽如SEQIDNO:7、204或205或214中所示。

正如所提到的，本发明的重组嵌合蛋白在植物细胞内生成。

为了表达抑制性多肽，将包含编码如本文所述的嵌合多肽的核酸序列的分离多核苷酸连接到“植物核酸表达构建体”中。

如本文中所用术语“植物核酸表达构建体”指包括本发明的一些实施方案的核酸和指导核酸在植物宿主细胞中转录的至少一个启动子的核酸构建体。下文提供了适合转化方法的更多详情。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种核酸表达构建体，其包含本发明的核酸序列和指导核酸序列在植物宿主细胞中转录的启动子。

如本文中所用术语“核酸序列”指经分离并且呈RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式提供的单链或双链核酸序列。

如本文中所用短语“互补多核苷酸序列”指使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶由信使RNA的逆转录产生的序列。随后可使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增此类序列。

如本文中所用短语“基因组多核苷酸序列”指源自(分离自)染色体的序列并且因此其代表染色体的一个连续部分。

如本文中所用短语“复合多核苷酸序列”指至少部分互补并且至少部分为基因组的序列。复合序列可包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及之间插入的一些内含子序列。内含子序列可为任何来源，包括其它基因来源，并且通常将包括保守性剪接信号序列。此类内含子序列还可包括顺式作用表达调控元件。

根据本发明的一些实施方案，编码本发明多肽的核酸序列经优化以在植物中表达。此类序列修饰的实例包括但不限于改变G/C含量以更接近通常在目标植物种中发现的G/C含量，和通常称为密码子优化的去除在植物种中不常存在的密码子。在一个实施方案中，为烟草或本氏烟(Nicotianabenthamiana)优化编码多肽例如嵌合多肽的核酸序列的密码子使用。

短语“密码子优化”指选择适当DNA核苷酸供在接近目标植物内的密码子使用的结构基因或其片段中使用。因此，优化基因或核酸序列指其中为了在植物中利用统计上优选或统计上有利的密码子已经修饰了天然或自然存在的基因的核苷酸序列的基因。通常在DNA水平上检查核苷酸序列并且使用任何适合程序，例如Sardana等(1996,PlantCellReports15:677-681)所述，测定植物种中为表达优化的编码区。在这种方法中，可通过先找出相对于高表达植物基因，天然基因每个密码子使用的平方比例偏差，接着计算平均平方偏差计算密码子使用的标准偏差，这是密码子使用偏好的量度。所用公式为：1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn指在高表达植物基因中密码子n的使用频率，其中Yn指在目标基因中密码子n的使用频率并且N指目标基因中密码子的总数。已经使用Murray等(1989,NucAcidsRes.17:477-498)的数据编纂了来自于双子叶植物高表达基因的密码子使用表。

依照优选密码子使用为特定植物细胞类型优化核酸序列的一种方法是基于直接使用，无需进行例如通过日本(HypertextTransferProtocol://WorldWideWeb(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/)NIAS(国立农业生物科学研究所(NationalInstituteofAgrobiologicalSciences))DNA库在密码子使用数据库在线提供的密码子优化表的任何额外统计计算。密码子使用数据库含有许多不同种的密码子使用表，每个密码子使用表已经基于基因库中存在的数据在统计上确定。

通过使用此类密码子优化表确定特定种(例如，水稻)中每个氨基酸最优选或最有利的密码子，编码目标蛋白的自然存在核苷酸序列可对于该特定植物种经密码子优化。这通过用对于氨基酸在统计上更有利的相应密码子置换特定种中可能具有低统计发生率的密码子实现。然而，可选择一个或多个不大有利的密码子以除去现有限制性位点，以在可能有用的接点处产生新位点(5'和3'末端以添加信号肽或终止盒，可用于切割片段并剪接在一起以生成正确的全长序列的内部位点)，或消除可对mRNA稳定性或表达产生负面影响的核苷酸序列。

所需编码核苷酸序列可能在任何修饰之前，已经含有许多与特定植物种中在统计上有利的密码子相对应的密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可包括确定所需核苷酸序列中哪些密码子对于特定植物在统计上不利，并且依照特定植物的密码子使用表修饰这些密码子以生成密码子优化衍生物。经修饰的核苷酸序列可完全或部分优化供植物密码子使用，条件是经修饰的核苷酸序列编码的蛋白质以高于相应自然发生的或天然基因编码的蛋白质的水平生成。通过改变密码子使用构建合成基因在例如PCT专利申请93/07278中有描述。

因此根据一个特定实施方案，提供了一种如SEQIDNO:5中所示的烟草优化序列。

根据本发明的一些实施方案，编码多肽例如嵌合多肽的核酸序列与植物细胞中有活性的顺式作用调控元件，例如植物启动子序列可操作地连接。

如果调控序列能够对与之连接的编码序列发挥调控作用(例如对编码序列表达的作用)，则编码核酸序列与调控序列(例如，启动子)“可操作地连接”。

任何适合的启动子序列均可由本发明的核酸构建体使用。优选地启动子为组成型启动子、组织特异性或诱导型启动子。

如本文中所用短语“植物可表达”指启动子序列，包括其中添加或其中所含的任何附加调控元件，至少能够诱导、赋予、活化或增强在植物细胞、组织或器官，优选地单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官中的表达。此类启动子可为组成型，即能够指导在多种组织中的高水平基因表达，组织特异性，即能够指导在特定组织中的基因表达，诱导型，即能够指导在刺激下的基因表达，或嵌合型，即由至少两种不同启动子的一部分形成。

表I、II、III和IV中呈现了用于本发明一些实施方案的方法的优选启动子的实例。

表I

用于进行本发明一些实施方案的示例性组成型启动子

表II

用于进行本发明一些实施方案的示例性种子优选型启动子

表III

用于进行本发明的示例性花特异性启动子

表IV

用于进行本发明的替代性水稻启动子

本发明一些实施方案的核酸构建体还可包括适当的选择标记和/或复制起点。根据本发明的一些实施方案，利用的核酸构建体为穿梭载体，其可在大肠杆菌(E.coli)中繁殖(其中所述构建体包含适当的选择标记和复制起点)并且与在细胞中的繁殖相容。根据本发明所述的构建体可为，例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

本发明一些实施方案的核酸构建体可用于稳定地或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，核酸整合到植物基因组中并且像这样其表现稳定的遗传性状。在瞬时转化中，外源多核苷酸由转化细胞表达，但是未整合到基因组中并且像这样其表现瞬时性状。

因此，根据本发明的一些方面，提供了一种包含本发明的核酸构建体的离体细胞。

如本文中所用，术语“分离细胞”指至少部分从自然环境，例如植物中分离的细胞。在一些实施方案中，离体细胞为全植物的植物细胞。在一些实施方案中，离体细胞为植物细胞，例如培养中的植物细胞。

如本文中所用术语“植物”涵盖全株植物、植物的祖先和后代及植物部分，包括种子、枝条、茎干、根(包括块茎)，和植物细胞、组织和器官。植物可呈任何形式，包括悬浮培养物、胚芽、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于绿色植物(Viridiplantae)总科的所有植物，尤其是单子叶和双子叶植物，包括草料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，选自包括以下的列表：相思树属(Acaciaspp.)、槭树属(Acerspp.)、猕猴桃属(Actinidiaspp.)、七叶树属(Aesculusspp.)、澳大利亚贝壳杉(Agathisaustralis)、苦合欢(Albiziaamara)、三色桫椤(Alsophilatricolor)、须芒草(Andropogonspp.)、落花生属(Arachisspp)、槟榔(Arecacatechu)、香桂(Asteliafragrans)、鹰嘴紫云英(Astragaluscicer)、多小叶红苏木(Baikiaeaplurijuga)、桦木属(Betulaspp.)、芸苔属(Brassicaspp.)、木榄(Bruguieragymnorrhiza)、伯克苏木(Burkeaafricana)、紫铆花(Buteafrondosa)、粉质胚乳白花菜(Cadabafarinosa)、朱缨花属(Calliandraspp)、野茶树(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属(Capsicumspp.)、决明属(Cassiaspp.)、距豌豆(Centroemapubescens)、木瓜属(Chacoomelesspp.)、肉桂(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、可乐豆木(Colophospermummopane)、变异小冠花(Coronilliavaria)、枸子(Cotoneasterserotina)、山楂属(Crataegusspp.)、黄瓜属(Cucumisspp.)、柏木属(Cupressusspp.)、银蕨(Cyatheadealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属(Cymbopogonspp.)、银蕨(Cyntheadealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、货贝黄檀(Dalbergiamonetaria)、大叶骨碎补(Davalliadivaricata)、金钱草属(Desmodiumspp.)、新西兰树蕨(Dicksoniasquarosa)、Dibeteropogonamplectens、迪奥豆属(Diocleaspp)、扁豆属(Dolichosspp.)、Dorycniumrectum、金字塔稗(Echinochloapyramidalis)、Ehraffiaspp.、穇子(Eleusinecoracana)、幽眉草属(Eragrestisspp.)、刺桐属(Erythrinaspp.)、桉属(Eucalypfusspp.)、假乌木(Eucleaschimperi)、绒毛状金茅(Eulaliavi/losa)、荞麦属(Pagopyrumspp.)、费约果(Feijoasellowlana)、草莓属(Fragariaspp.)、千斤拔属(Flemingiaspp)、河岸藤露览树(Freycinetiabanksli)、东亚老鹤草(Geraniumthunbergii)、银杏(GinAgobiloba)、野黄豆(Glycinejavanica)、墨西哥丁香属(Gliricidiaspp)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、银禅属(Grevilleaspp.)、鞘杆古夷布提木(Guibourtiacoleosperma)、岩黄蓍属(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemaffhiaaltissima)、黄茅(Heteropogoncontoffus)、大麦(Hordeumvulgare)、红荀茅(Hyparrheniarufa)、小连翅(Hypericumerectum)、Hypeffheliadissolute、异花木蓝(Indigoincamata)、鸢尾属(Irisspp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子属(Lespedizaspp.)、萬苣属(Lettucaspp.)、银合欢(Leucaenaleucocephala)、单罗得草(Loudetiasimplex)、Lotonusbainesli、百脉根属(Lotusspp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、苹果属(Malusspp.)、木薯(Manihotesculenta)、紫苜蓿(Medicagosaliva)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、香蕉(Musasapientum)、烟草属(Nicotianumspp.)、驴食豆属(Onobrychisspp.)、鸟足豆属(Ornithopusspp.)、稻属(Oryzaspp.)、非洲双翼豆(Peltophorumafricanum)、狼尾草属(Pennisetumspp.)、酪梨(Perseagratissima)、碧冬煎属(Petuniaspp.)、菜豆属(Phaseolusspp.)、模榔竹(Phoenixcanariensis)、新西兰剑麻(Phormiumcookianum)、石楠属(Photiniaspp.)、白云杉(Piceaglauca)、松属(Pinusspp.)、豌豆(Pisumsativam)、新西兰罗汉松(Podocarpustotara)、Pogonarthriafleckii、Pogonaffhriasquarrosa、杨属(Populusspp.)、瓜叶牧豆(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、星状老虎剌(Pterolobiumstellatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属(Quercusspp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsisumbellata)、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、纳塔尔漆树(Rhusnatalensis)、欧洲醋栗(Ribesgrossularia)、荼薦子属(Ribesspp.)、剌槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属(Rosaspp.)、悬钩子属(Rubusspp.)、柳属(Salixspp.)、红裂稃草(Schyzachyriumsanguineum)、金松(Sciadopitysvefficillata)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、两色高梁(Sorghumbicolor)、菠菜属(Spinaciaspp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolusfimbriatus)、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthoshumilis)、葫芦茶属(Tadehagispp)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、三叶草属(Trifoliumspp.)、小麦属(Triticumspp.)、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、越桔属(Vacciniumspp.)、蚕豆属(Viciaspp.)、葡萄(Vitisvinifera)、锥穗沃森花(Watsoniapyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zeamays)、苋菜(amaranth)、洋蓟、芦笋、球花甘蓝、抱子甘蓝(Brusselssprouts)、卷心菜、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿叶羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、油籽油菜(oilseedrape)、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜茶(squashtea)、玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、花生、豌豆、小扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜籽、油菜、胡椒、向日葵、马铃薯、茄子、桉树、树、观赏性植物、多年生牧草和饲料作物。可选地藻类和其它非绿色植物可用于本发明的方法。

根据本发明的一些实施方案，植物或植物细胞为浮萍植物、细胞或根瘤。可通过许多方法中的任一种，包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移、基因枪轰击或电穿孔用含有目标核苷酸序列的表达盒有效地转化浮萍(单子叶植物浮萍科(Lemnaceae)或青萍属(Lemna))植物或浮萍根瘤培养物。浮萍细胞的分子工程方法和用于多肽商用生产的浮萍表达系统的详细描述在本领域中已知(参见，例如，Stomp等的美国专利第6,040,498和6,815,184号，和Dickey等的第8,022,270号，全部专利通过引用完全并入本文)。

根据本发明的一些实施方案，本发明方法使用的植物或植物细胞为农作物或农作物细胞，例如水稻、玉米、小麦、大麦、花生、马铃薯、芝麻、橄榄树、棕榈油、香蕉、大豆、向日葵、油菜、甘蔗、紫花苜蓿、粟、豆科植物(菜豆和豌豆)、亚麻、羽扇豆、油菜籽、烟草、白杨和棉花。

根据另外的实施方案，植物细胞包括烟草细胞、发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转化根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。在一个实施方案中烟草细胞来自于烟草细胞系，例如但不限于红花烟草亮黄色(BY-2)细胞。可根据任何类型的适合培养方法培育植物细胞，包括但不限于在固体表面(例如塑料培养皿或板)上或悬浮液中培养。将注意到一些细胞，例如BY-2和胡萝卜细胞可在悬浮液中培养和生长。在悬浮液中培养植物细胞的适合装置和方法在本领域中已知，例如，如国际专利申请PCTIL2008/000614中所述。再一个实施方案中，细胞为全烟草植物或植物组织的细胞，包括但不限于本氏烟。

存在将外来基因引入单子叶和双子叶植物中的各种方法(Potrykus,I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225；Shimamoto等，Nature(1989)338:274-276)。

使外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的原理方法包括两种主要方法：

(i)土壤杆菌介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486；Klee和Rogers在CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants中，第6卷，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，Schell,J.和Vasil,L.K.编，AcademicPublishers,SanDiego,Calif.(1989)第2-25页；Gatenby，在PlantBiotechnology中，Kung,S.和Arntzen,C.J.编，ButterworthPublishers,Boston,Mass.(1989)第93-112页。

(ii)直接摄入DNA：Paszkowski等，在CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants中，第6卷，MolecularBiologyofPlantNuclearGenesSchell,J.和Vasil,L.K.编，AcademicPublishers,SanDiego,Calif.(1989)第52-68页；包括向原生质体中直接摄入DNA的方法，Toriyama,K.等(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通过植物细胞短暂的电击诱导DNA摄入：Zhang等PlantCellRep.(1988)7:379-384。Fromm等Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击将DNA注入植物细胞或组织中，Klein等Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe等Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量移液管系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79:213-217；玻璃纤维或碳化硅晶须转化细胞培养物、胚芽或愈伤组织，美国专利第5,464,765号或通过用萌发花粉直接孵化DNA，DeWet等在ExperimentalManipulationofOvuleTissue中，Chapman,G.P.和Mantell,S.H.和Daniels,W.Longman编辑，London,(1985)第197-209页；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。

土壤杆菌系统包括使用整合到植物基因组DNA中的规定DNA片段的质粒载体。植物组织的接种方法根据植物种和土壤杆菌递送系统改变。广泛使用的方法是可用为开始全植物分化提供了良好来源的任何组织外植体进行的叶盘法(leafdiscprocedure)。参见，例如，Horsch等在PlantMolecularBiologyManualA5中，KluwerAcademicPublishers，Dordrecht(1988)第1-9页。补充方法采用与真空渗入相结合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统在转基因双子叶植物的创造中尤其可行。

存在向植物细胞中直接转移DNA的各种方法。在电穿孔中，将原生质体短暂地暴露于强电场。在显微注射中，使用极小的微量移液管将DNA直接机械注入细胞中。在微粒攻击中，将DNA吸附在微弹例如硫酸镁晶体或钨粒上，微弹物理加速进入细胞或植物组织。

在稳定转化后进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖再生的不足之处在于，因为种子由植物根据受孟德尔定律(Mendelianrule)控制的遗传差异产生，所以由于杂合性在作物中缺乏均一性。基本上，每颗种子在基因上都不同并且每一颗将以其自身的特定性状生长。因此，优选生产转化植物，以致再生植物具有亲本转基因植物的相同性状和特征。因此，优选通过提供转化植物的快速、一致生殖的微繁殖再生转化植物。

微繁殖是由已经从所选亲本植物或栽培品种切除的一片组织生长出新一代植物的工艺。这个过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量生殖。产生的新一代植物在基因上与原植物相同，并且具有原植物的所有特征。微繁殖允许在短时间内大量生产优质植物材料并且在原转基因或转化植物特征的保持中提供了所选栽培品种的快速增殖。克隆植物的优点是植物增殖的速度及所产植物的质量和均一性。

微繁殖是需要在阶段期间改变培养基或生长条件的多阶段工序。因此，微繁殖工艺涉及4个基本阶段：第1阶段，初始组织培养；第2阶段，组织培养增殖；第3阶段，分化和植株形成；和第4阶段，温室培养和硬化。在第1阶段，初始组织培养期间，建立组织培养并保证无污染物。在第2阶段期间，初始组织培养物增殖直至生成足够量的组织样品以满足生产目标。在第3阶段期间，将第2阶段中生长的组织样品分开并生长成单独的幼苗。在第4阶段，将转化幼苗转移到温室中硬化，在温室中植物对光的耐受性逐渐增强，以致其可以在自然环境中生长。

根据本发明的一些实施方案，通过叶细胞、分生组织细胞或全植物的瞬时转化生成转基因植物。

瞬时转化可通过以上所述任何直接DNA转移法或使用经修饰的植物病毒通过病毒感染实现。

已经证实对植物宿主转化有用的病毒包括CaMV、烟草花叶病毒(TMV)、雀麦草花叶病毒(BMV)和菜豆普通花叶病毒(BV或BCMV)。在美国专利第4,855,237号(菜豆金黄花叶病毒；BGV)、EP-A67,553(TMV)、日本公布申请第63-14693号(TMV)、EPA194,809(BV)、EPA278,667(BV)和Gluzman等，CommunicationsinMolecularBiology:ViralVectors，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork，第172-189页(1988)中描述了使用植物病毒转化植物。在WO87/06261中描述了用于在许多宿主，包括植物中表达外来DNA的假病毒颗粒。

根据本发明的一些实施方案，用于瞬时转化的病毒无毒力并且因此不能造成严重症状例如生长速率降低、嵌合体、环斑、卷叶、变黄、斑纹、痘形成、肿瘤形成和蚀损斑。适合的无毒病毒可为自然存在的无毒病毒或人为减毒病毒。病毒减毒可通过使用本领域中公知的方法实现，包括但不限于亚致死性加热、化学处理或通过定点诱变技术，如由Kurihara和Watanabe(MolecularPlantPathology4:259-269，003)，Gal-on等(1992)，Atreya等(1992)和Huet等(1994)所述。

适合的病毒菌株可从可用来源，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)获得或通过从感染植物分离获得。从感染植物组织分离病毒科通过本领域中公知的技术实现，例如Foster和Tatlor编“PlantVirologyProtocols:FromVirusIsolationtoTransgenicResistance(MethodsinMolecularBiology(HumanaPr)，第81卷)”,HumanaPress,1998所述。简言之，将认为含有高浓度的适合病毒的感染植物的组织，优选幼叶和花瓣于缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)中研磨以生成可用于后续接种的病毒感染汁液。

用于在植物中引入和表达非病毒核酸序列的植物RNA病毒的构建由以上参考文献以及Dawson,W.O.等，Virology(1989)172:285-292；Takamatsu等EMBOJ.(1987)6:307-311；French等Science(1986)231:1294-1297；Takamatsu等FEBSLetters(1990)269:73-76；和美国专利第5,316,931号论证。

当病毒为DNA病毒时，可对病毒本身进行适当修饰。可选地，可先将病毒克隆到细菌质粒中以易于构建具有外来DNA的所需病毒载体。然后将病毒从质粒上切除。如果病毒为DNA病毒，则细菌复制起点可与病毒DNA连接，然后由细菌复制。这种DNA的转录和翻译将生成外壳蛋白，外壳蛋白将壳体化DNA病毒。如果病毒为RNA病毒，则病毒通常作为cDNA克隆并插入质粒中。然后用质粒进行所有构建。然后通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以生成壳体化病毒RNA的外壳蛋白生成RNA病毒。

在一个实施方案中，提供了一种植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白编码序列已经从病毒多核苷酸缺失，已经插入了非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选能够在植物宿主中表达，包装重组植物病毒多核苷酸，并确保宿主受重组植物病毒多核苷酸系统性感染的非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子。可选地，可通过在其中插入非天然多核苷酸序列灭活外壳蛋白基因，以致生成蛋白质。重组植物病毒多核苷酸可含有一种或多种附加非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子均能够在植物宿主中转录或表达相邻基因或多核苷酸序列并且不能相互地和与天然亚基因组启动子重组。非天然(外来)多核苷酸序列可插入天然植物病毒亚基因组启动子附近或者如果包括一个以上多核苷酸序列，则插入天然和非天然植物病毒亚基因组启动子附近。非天然多核苷酸序列在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下转录或表达以生成所需产物。

在第二实施方案中，提供了一种重组植物病毒多核苷酸，除天然外壳蛋白编码序列置于非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一而不是非天然外壳蛋白编码序列的附近外，与第一实施方案一样。

在第三实施方案中，提供了一种重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因在其亚基因组启动子的附近并且已经向病毒多核苷酸中插入了一个或多个非天然亚基因组启动子。插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻基因并且不能相互地和与天然亚基因组启动子重组。非天然多核苷酸序列可插入非天然亚基因组植物病毒启动子附近，以便在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下转录或表达所述序列以生成所需产物。

在第四实施方案中，提供了一种重组植物病毒多核苷酸，除天然外壳蛋白编码序列由非天然外壳蛋白编码序列代替外，与第三实施方案一样。

病毒载体被重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白壳体化生成重组植物病毒。重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制，在宿主中系统性传播，并且在宿主中转录或表达外来基因(外源多核苷酸)以生成所需产物。

向植物接种病毒的技术可在Foster和Taylor编“PlantVirologyProtocols:FromVirusIsolationtoTransgenicResistance(MethodsinMolecularBiology(HumanaPr)，第81卷)”，HumanaPress，1998；Maramorosh和Koprowski编“MethodsinVirology”7卷，AcademicPress，NewYork1967-1984；Hill,S.A.“MethodsinPlantVirology”，Blackwell,Oxford,1984；Walkey,D.G.A.“AppliedPlantVirology”，Wiley,NewYork,1985；及Kado和Agrawa编“PrinciplesandTechniquesinPlantVirology”,VanNostrand-Reinhold,NewYork中找到。

除以上外，本发明的多核苷酸也可引入叶绿体基因组中，从而激活叶绿体表达。

将外源核酸序列引入叶绿体基因组的技术已知。这种技术涉及以下工序。首先，化学处理植物细胞以便将每个细胞的叶绿体数量减少为约1个。然后，经由粒子轰击将外源多核苷酸引入细胞中，其目的是将至少一个外源多核苷酸分子引入叶绿体中。选择外源多核苷酸，以致其可经由易于用叶绿体固有的酶实现的同源重组整合到叶绿体基因组中。为此，除目标基因外，核酸序列包括源自叶绿体基因组的至少一个多核苷酸段。另外，外源多核苷酸包括选择标记，其通过顺序选择过程用于确定全部或大体上全部的叶绿体基因组拷贝在此类选择后将包括外源多核苷酸。在美国专利第4,945,050和5,693,507中找到关于这种技术的更多详情，所述专利通过引用并入本文。因此多肽可由叶绿体的蛋白质表达系统生成并且变得整合到叶绿体的内膜中。

根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括使表达核酸的植物细胞生长。植物细胞可为所需任何植物细胞。植物细胞可为培养细胞，培养组织或培养器官中的细胞，或植物中的细胞。在一些实施方案中，植物细胞为培养细胞，或培养组织或培养器官中的细胞。在另外的实施方案中，植物细胞为用于基因转移的任何类型的植物。植物细胞可作为全植物的一部分生长，或可选地，在植物细胞培养中生长。

根据本发明的一些方面，植物细胞在植物细胞悬浮培养中生长。如本文中所用，术语“悬浮培养”指与生物体分离的细胞的生长。可经由使用液体培养基(“悬浮培养基”)促进悬浮培养。悬浮培养可指细胞在液体营养培养基中的生长。适合使本发明的植物细胞在植物细胞悬浮培养中生长的方法和装置在例如PCTWO2008/135991、美国专利第6,391,683号、美国专利申请第10/784,295号、国际专利公布PCT第WO2004/091475、WO2005/080544和WO2006/040761号中有详细描述，其全部特此通过引用并入，如同本文完全提出一样。

因此，本发明涵盖表达核酸序列的植物或植物培养物，以便生成本发明的重组多肽。一旦在植物细胞或整株植物内表达，由核酸序列编码的嵌合多肽水平就可以通过本领域公知的方法测定，例如活性测定、使用能够特异性结合嵌合多肽的抗体的蛋白质印迹(例如，对于根据本发明的一些实施方案所述的嵌合多肽而言，使用抗TNFR2和抗Fc，参见以下的实施例部分)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光等。

在植物中测定由核酸序列转录的RNA水平的方法在本领域中公知，包括例如，RNA印迹分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析(包括定量、半定量或实时RT-PCR)、和RNA-原位杂交。

根据本发明的一些实施方案，表达的本发明的重组嵌合多肽在植物细胞中糖基化，产生具有一个或两个或三个或更多个具有植物特有的聚糖残基的聚糖结构的嵌合多肽。因此，根据本发明的一些实施方案，表达本发明的表达载体的细胞生成具有不同量的呈一条、两条、三条或更多条天线排列的聚糖结构的嵌合多肽。所有结构可含有两个GlcNAc和一个甘露糖的核结构，并且除核α-(1，3)岩藻糖、β(1，2)木糖和/或GlcNAc残基外，还含有不同量的甘露糖变化。结构可为除核结构外具有至少一个，任选地至少两个，任选地三个或任选地至少四个或更多个甘露糖残基的高甘露糖类型，或每个聚糖上具有甘露糖和其它聚糖类型的复合类型，或具有高甘露糖和复合天线的混合类型。

在其它实施方案中，表达本发明的表达载体的细胞生成具有至少一个，任选地至少两个，任选地至少三个或任选地至少四个或更多个核木糖残基的多肽。还有其它实施方案中，表达本发明的表达载体的细胞生成具有至少一个，任选地至少两个，任选地至少三个或任选地至少四个或更多个核α-(1，3)岩藻糖残基的多肽。在一个实施方案中表达本发明的表达载体的细胞生成具有至少一个暴露的甘露糖残基、至少一个核木糖残基和至少一个α-(1，3)岩藻糖残基的多肽。还有另外的实施方案中，表达本发明的表达载体的细胞生成在外部甘露糖上具有至少一个、至少两个、至少3个或更多个末端N-乙酰葡糖胺取代的多肽。

根据一个特定实施方案所述多肽抑制剂例如嵌合多肽缺乏唾液酸残基。进一步根据一个特定实施方案，所述多肽包含至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多的复合聚糖。根据一个特定实施方案，所述多肽包含40-70％复合聚糖。

从细胞纯化分泌的植物细胞表达的抑制性多肽得到例如包含prhTNFR:Fc的高度纯化组合物。因此，在一些实施方案中所述多肽蛋白经纯化达至少98％同质性。因此纯化制剂的特征在于纯度为至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少91.5％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.1％、至少93.2％、至少93.3％,atleast93.4％、至少93.5％、至少93.6％、至少93.7％、至少93.8％、至少93.9％、至少94％、至少94.5％、至少95％、至少96％,atleast97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％，在至少95.0-99.8％范围内或100％纯度。在一些实施方案中，通过HPLC测量多肽的纯度。

在一些实施方案中植物表达的多肽制剂包含源自植物宿主细胞的杂质，例如但不限于核酸和多核苷酸、氨基酸、寡肽和多肽、聚糖和其它碳水化合物、脂质等。在一些实施方案中宿主细胞源性杂质包含生物活性分子，例如酶。在其它实施方案中，植物表达的多肽组合物包含植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶。当植物细胞为烟草细胞或烟草细胞系细胞时，植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶为烟草β-N-乙酰氨基己糖苷酶。

在另外的实施方案中植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶为灭活植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶。植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶的灭活可通过物理方式、化学方式或生物化学方式实现。物理灭活可通过加热、冷冻、干燥等进行。化学灭活可通过极端pH、化学变性、添加或去除侧链、聚糖、氨基酸等进行。生物化学灭活包括但不限于用可逆性或不可逆性抑制剂抑制。示例性β-N-乙酰氨基己糖苷酶抑制剂包括终产物抑制剂例如N-乙酰基-D-葡糖胺和β-甲基-N-乙酰基葡糖胺，和选择性抑制剂例如美国专利申请US2010016386、US20110237631、US20100087477和US20120046337中公开的化合物。应了解抑制和/或灭活植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶的优选方法是也有效保护植物表达的多肽的结构和功能完整性的方法。

在一些实施方案中通过加热包含所述多肽的复合物灭活植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶。植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶抑制和/或灭活的适合温度包括在37-60℃的范围内加热2-5、10、20、30、40、50、60分钟或更多分钟数。应了解植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶的有效抑制和/或灭活在较高温度下实现更快而在所述范围的较低温度下更慢。在一些实施方案中，在45-55℃的范围内加热植物表达的多肽组合物2-10分钟。在一些实施方案中，抑制/灭活导致植物β-N-乙酰氨基己糖苷酶20、30、40、50、60、70、80％或更多灭活。

本发明的多肽用于治疗TNFα相关医疗状况。

术语“治疗”指抑制、预防或阻止病理(疾病、病症或病状)的发展和/或引起病理的减少、减轻或消退。本领域中的技术人员将理解可使用不同方法论和测定法评估病理的发展，并且类似地，可使用不同方法论和测定法评估病理的减少、减轻或消退。

如本文中所用，术语“预防”指阻止疾病、病症或病状在可能有疾病风险，但尚未诊断为患病的受试者中发生。

如本文中所用，“TNFα相关医疗状况”指其中TNFα活性与受试者中医疗状况和/或相关症状的发作、进展相关的医疗状况。

因此，在有需要的细胞、组织、器官、动物或受试者中，TNFα相关医疗状况包括但不限于肥胖、免疫相关疾病、心血管疾病、传染病、恶性病或神经病中的至少一种(参见WO0212502)。

TNFα相关医疗状况的具体实例包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、韦格纳氏病(肉芽肿)、克罗恩氏病、炎症性肠病、短肠综合征、溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、丙型肝炎、子宫内膜异位、哮喘、恶病质、银屑病和特应性皮炎。可用本发明的抑制性多肽例如嵌合多肽治疗的另外的疾病或病症包括WO00/62790、WO01/62272和美国专利申请第2001/0021380号、美国专利第7,648,702号中描述的疾病或病症，其有关部分通过引用并入本文。

TNFα相关医疗状况另外的实例包括但不限于免疫相关疾病，例如类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发病型幼年类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、胃溃疡、血清阴性关节病、骨关节炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、短肠综合征、全身性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳氏肉芽肿(wegener'sgranulomatosis)、结节病、睾丸炎/输精管切除术、变应性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、变应性接触性皮炎、变应性结膜炎、过敏性肺炎、移植物、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养阴性脓毒症、真菌性脓毒症、嗜中性白血球低下发烧、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、外伤/出血、灼伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精引起的肝炎、慢性炎症性病理、结节病、克罗恩病、镰状细胞贫血、糖尿病、肾变病、特应性疾病、超敏反应、过敏性鼻炎、枯草热、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、荨麻疹、全身性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少、任何器官或组织的移植排斥、肾脏移植物排斥、心脏移植物排斥、肝脏移植物排斥、胰腺移植物排斥、肺部移植物排斥、骨髓移植物(BMT)排斥、皮肤同种异体移植物排斥、软骨移植物排斥、骨移植排斥、小肠移植物排斥、胎儿胸腺植入物排斥、甲状旁腺移植物排斥、任何器官或组织的异种移植物排斥、同种异体移植物排斥、抗受体超敏反应、格雷夫斯病(Gravesdisease)、雷诺氏病(Raynoud'sdisease)、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏反应、全身性红斑狼疮、POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆γ-球蛋白病和皮肤变化综合征)、多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆γ-球蛋白病、皮肤变化综合征、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、特发性艾迪生氏病(Addison'sdisease)、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、白癫风、脉管炎、MI心切开术后综合征、IV型超敏反应、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植物排斥、由于细胞内生物的肉芽肿、药物过敏性、代谢/特发性威尔逊氏病(Wilson'sdisease)、血色素沉着症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病性视网膜病、桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、原发性胆汁性肝硬变、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊肿性纤维化、新生儿慢性肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、皮肤病、银屑病、脱发症、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭、血液透析、尿毒症、中毒、子痫前期、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子治疗、化疗、放疗(例如，包括但不限于toasthenia、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸盐中毒等。参见，例如MerckManual，第12-17版，Merck&Company,Rahway,NJ(1972,1977,1982,1987,1992,1999),PharmacotherapyHandbook,Wells等编，第2版，AppletonandLange,Stamford,Conn.(1998,2000)，其各自通过引用整体并入。本发明还提供了一种治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种心血管疾病的方法，所述疾病包括但不限于以下疾病中的至少一种：心脏性晕厥综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病动脉硬化疾病、高血压、动脉性高血压、肾动脉性高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺心病、原发性肺高血压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房纤颤(持续或阵发性)、灌注后综合征、心肺旁路炎症反应、混乱性或多灶性房性心动过速、规律性窄QRS心动过速、特异性心律失常、心室纤颤、希氏束心律失常(Hisbundlearrythmias)、房室传导阻滞、束支阻滞、心肌缺血性紊乱、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜性心脏病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和外周动脉瘤、主动脉剥离、主动脉炎症、腹主动脉及其分支阻塞、外周血管病、阻塞性动脉疾病、外周动脉硬化性疾病、血栓性脉管炎、功能性外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉疾病、静脉血栓、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定性心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征、缺血再灌注损伤等。

TNFα相关医疗状况另外的实例包括但不限于传染病，例如急性或慢性细菌感染、急性和慢性寄生或感染过程，包括细菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌(e.coli)0157:h7、溶血性尿毒症综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、结核分枝杆菌病、胞内鸟型分枝杆菌病、间质性浆细胞肺炎、盆腔炎性疾病、睾丸炎/附睾炎、军团菌病、莱姆病(lymedisease)、甲型流感、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒病、生命相关的噬血细胞综合征、致命性脑炎/无菌性脑膜炎等。

TNFα相关医疗状况另外的实例包括但不限于恶性病，例如白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞、T细胞或FABALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓发育不良综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)、恶性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、多发性硬化、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、结直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多症、副癌综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌相关骨吸收、癌相关骨痛等。

TNFα相关医疗状况另外的实例包括但不限于神经病，例如神经退化性疾病、多发性硬化、偏头痛、AIDS痴呆合并症、脱髓鞘性疾病，例如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎；锥体束外和小脑病症例如皮质脊髓系统病变；基底节病症或小脑病症；运动机能亢进性运动失调例如亨廷顿氏舞蹈病(Huntington'sChorea)和老年性舞蹈病；药物诱导的运动失调，例如阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的运动失调；运动机能减退性运动失调，例如帕金森氏病(Parkinson'sdisease)；进行性核上性麻痹；小脑结构病变；脊髓小脑退化，例如脊髓性共济失调、弗里德赖希氏共济失调(Friedreich'sataxia)、小脑皮质退化、多系统退化(Mencel、Dejerihe-Thomas、ShiDrager和Machado-Joseph)；全身性病症(雷夫叙姆病(Refsum'sdisease)、β脂蛋白血症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多系统病症)；脱髓鞘核病症，例如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎；及运动单位病症，例如神经源性肌萎缩(前角细胞退化，例如肌萎缩性侧索硬化、婴儿脊髓性肌萎缩和幼年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默病；中年唐氏综合征(Down'sSyndrome)；弥散性路易体病；路易体型老年痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoffsyndrome)；慢性酒精中度；库贾氏症(Creutzfeldt-Jakobdisease)；亚急性硬化性全脑炎、Hallerrorden-Spatz病和拳击员痴呆(Dementiapugilistica)等。

如本文中所用，术语“受试者”包括任何年龄，遭受病理的哺乳动物，例如人。根据一个特定实施方案，该术语涵盖有发展病理的风险的个体。

已经证实表达生物活性人重组多肽的植物细胞，在提供给受试者供肠内施用时，可用作有效的全身性递送系统(参见WO2007/010533)。因此，在一些实施方案中，所述多肽(例如，嵌合多肽)可配制于供口服或肠内递送的包含表达所述多肽的转化植物细胞和药学上可接受的载体的药物组合物中。在一些实施方案中，药物组合物的转化植物细胞为冻干植物细胞。

如本文中所用短语“肠内施用”指通过胃肠道的任何部分施用，例如直肠施用、结肠施用、肠道施用(近侧或远侧)和胃部施用。在一些实施方案中，肠内施用指口服施用。

应了解本发明教导还涉及表达本发明多肽(例如，嵌合多肽)的植物细胞的粘膜施用。

所述细胞可配制成固体，配制成液体或配制成粉末。在一些实施方案中，所述细胞为再悬浮、冻干细胞。

因此，在一些实施方案中，多肽(例如，嵌合多肽)可配制于供口服或肠内递送的包含表达所述多肽的转化植物细胞和药学上可接受的载体的药物组合物中。在一些实施方案中，虽然本文也考虑到使用新鲜(非冻干细胞)，但是所述药物组合物的转化植物细胞为冻干植物细胞。

在冻干之前洗涤细胞以去除可存在于生长培养基中的任何细胞碎片。

在准备细胞进行冻干时，有时在维持培养基中培育细胞以降低细胞的代谢过程是可取的。

可在室温下或在通常培养植物细胞的温度下进行预处理(虽然不必要)。在易于处理的室温附近(20℃)并且当大多数植物细胞在室温下相当稳定时进行预处理。可向培养基中直接添加稳定剂并且在预处理过程中在必要时补充。

预处理还可涉及在一种或多种渗透剂的存在下培育细胞。有用渗透剂的实例包括糖类例如糖和糖衍生物，氨基酸或亚氨基酸例如脯氨酸和脯氨酸衍生物，或这些试剂的组合。一些更有用的糖类和糖类衍生物为果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。按准备细胞进行后续冻干的浓度利用渗透剂。

冻干旨在通过真空蒸发减少细胞的含水量。真空蒸发涉及将细胞置于气压降低的环境中。根据所需除水率，在介于约-30℃至-50℃之间的温度下工作的环境低压可为100托、1托、0.01托或更低。根据一个特定实施方案，通过冷冻至-40℃，然后施加真空至0.1毫巴的压力过夜冻干细胞。然后将细胞加热至-10℃，这样将全部含冰量将升华并蒸发。在低压条件下，水蒸发速率增加，以致可以去除细胞中高达60-95％的水。

根据一个特定实施方案，冻干从细胞中去除了60％、70％、80％以上或特别地90％、91％、92％、93％、94％、95％或98％以上的水。根据一个特定实施方案，最终含水量为约5-10％、5-8％或6-7％。

因此，口服剂型可在酒吧里作为口服营养形式(例如，只要蛋白质不暴露于包括37℃以上加热和压缩的变性条件)、作为全部膳食、作为可溶粉末(例如保健饮料)、作为溶液、作为现成饮料，任选低卡路里例如软饮料，包括果汁、奶昔、酸奶饮料、果昔(smoothie)或大豆饮料提供，或分散在任何种类的食物，例如焙烤产品、压块干粮、奶制品条、零食、早餐谷物食品、牛奶什锦早餐、糖果、药片、曲奇、饼干、梳打饼干(例如米饼)、巧克力和奶制品中。

值得注意的是表达嵌合多肽的植物细胞在治疗炎症性肠病中的用途。预计植物的细胞壁会在移动通过胃部和小肠时保护嵌合多肽。在消化多糖的结肠中，预计植物细胞会释放其内容物并且因此prhTNRF:Fc可用于结合其细胞因子配体。而且，prhTNRF2:Fc是携带人IgG1的Fc片段的嵌合蛋白。在为粘膜屏障加衬的单层上皮细胞中，FcRn受体通过与其Fc结合转胞吞IgG分子。因此，prhTNRF:Fc也可穿过上皮屏障以结合其在上皮细胞浆膜侧的细胞因子配体。

应了解本发明教导将表达所述多肽(例如，嵌合多肽)的植物细胞通过肠内施用用于治疗与肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症直接相关的医疗状况的用途排除在外。

代谢综合征是似乎直接促进动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)发展的代谢来源的相关风险因素-代谢危险因素的群集。有代谢综合征的患者发展2型糖尿病的风险增加。代谢综合征的多个组成部分。这些标准在具体要素上有所不同，但是一般而言包括潜在和代谢风险因子的组合。代谢风险因素中最广泛认可的是致动脉粥样硬化性血脂异常、血压升高和血糖升高。有这些特征的个体通常也表现出血栓前状态和前炎症状态。致动脉粥样硬化性血脂异常由脂蛋白异常的集合组成，包括血清甘油三酯和载脂蛋白B(apoB)升高，LDL小颗粒增多和HDL胆固醇(HDL-C)水平降低。可用数据表明真的是一种综合征，即一组ASCVD风险因素，但是可能有一种以上原因的综合征。

根据一个特定实施方案，肝脏疾病或病症选自肝炎、肝硬化、肝癌、肝中毒、慢性肝病、脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎。

根据一个特定实施方案，肝中毒由选自醋胺酚、NSAIDS、糖皮质激素、异烟肼、砷、化疗、四氯化碳和氯乙烯的化学试剂诱导。

根据一个特定实施方案，糖尿病选自I型糖尿病、II型糖尿病和LADA病。

可选地或另外，本发明一些实施方案的嵌合多肽可本身，或在其与适合载体或赋形剂混合的药物组合物中施用给生物体。

如本文中所用“药物组合物”指本文所述一种或多种活性成分与其它化学组分例如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是利于化合物向生物体的施用。

本文中术语“活性成分”指负责生物学效应的嵌合多肽或表达嵌合多肽的细胞。

下文，可交换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指不会给生物体带来显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。

本文中术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步利于活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和淀粉类、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物的配制和施用技术可在最新版“Remington’sPharmaceuticalSciences,”MackPublishingCo.,Easton,PA中找到，其通过引用并入本文。

适合的施用途径可包括，例如口服、直肠、经粘膜(尤其是经鼻)、肠道或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心脏内(例如进入右或左心室腔，进入常见冠状动脉)，静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

本发明的药物组合物对于肠胃外施用特别有用，即皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内和/或鞘内。肠胃外施用可通过团注或持续输注。用于注射的药物组合物可以，例如，在安瓿中或与添加的防腐剂一起在多剂量容器中呈单位剂型呈现。另外，已经研发了许多新近药物递送方法并且本发明的药物组合物适合使用这些新方法施用，例如Inject-ease^TM、Genject^TM、注射器笔如GenPen.TM.，和无针装置例如MediJector^TM和BioJector^TM。

所述药物组合物也可配制成长效制剂。此类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉注射施用。因此，例如，所述制剂可用适合的聚合或疏水性材料(例如于可接受的油中的乳液)或离子交换树脂改性，或作为微溶性衍生物，例如微溶性盐。

本发明一些实施方案的药物组合物可通过本领域中公知的过程生产，例如通过常规混合、溶解、粒化、制糖衣、磨粉、乳化、胶囊花、包埋或冻干过程。

因此可按常规方式使用包含利于将活性成分加工成在药学上可使用的制剂的赋形剂和助剂的一种或多种生理上可接受的载体配制供依照本发明的一些实施方案使用的药物组合物。适当的制剂取决于所选施用途径。

对于注射，药物组合物的活性成分可配制成水溶液，优选生理相容性缓冲液，例如汉克氏溶液(Hank’ssolution)、林格氏溶液(Ringer’ssolution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合透过屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中众所周知。

对于口服施用，通过合并活性化合物与本领域中公知的药学上可接受的载体易于配制药物组合物。此类载体使得能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等供患者口服摄入。供口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，若需要在添加适合助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核制成。适合的赋形剂为，尤其是填料例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

提供具有合适包衣的糖衣丸核。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物组合物包括由明胶制备的推入适配胶囊(push-fitcapsule)以及由明胶和增塑剂例如甘油和山梨糖醇制备的软密封胶囊。推入适配胶囊可含有与填料(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性成分溶解或悬浮在适合液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液态聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。供口服施用的所有制剂应呈适合所选施用途径的剂量。

对于口腔施用，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

对于经鼻吸入施用，供根据本发明的一些实施方案使用的活性成分可呈气雾剂喷雾的形式方便地递送，其通过使用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，从加压包装或喷雾器呈现。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀来递送计量的量以确定剂量单位。可配制在分配器中使用的例如明胶胶囊和药管,其含有化合物和适合粉基(例如乳糖或淀粉)的混合粉末。

可配制本文所述的药物组合物供肠胃外施用，例如，通过团注或持续输注。用于注射的制剂可以，例如，在安瓿中或任选地与添加的防腐剂一起在多剂量容器中呈单位剂型呈现。所述组合物可以是在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配方剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括呈水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的混悬剂可制备成适当的油性或水基注射混悬剂。适合的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬剂也可含有适合的稳定剂或增加活性成分的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。

可选地，活性成分可呈粉末形式以在使用前用适合的媒介物，例如，基于无菌无热原水的溶液复水。

本发明的一些实施方案的药物组合物也可使用例如常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯配制为直肠用组合物例如栓剂或保留灌肠剂。

适于在本发明的一些实施方案的情况下使用的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以达到预期目的的组合物。更具体地说，治疗有效量意指有效防止、减轻或缓解病症症状或延长接受治疗的受试者的存活期的活性成分(嵌合多肽)的量。

治疗有效量的测定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。

对于用于本发明方法中的任何制剂而言，治疗有效量或剂量可通过体外和细胞培养测定初步估计。例如，可在动物模型中配制一剂量以获得所需浓度或滴度。此信息可用于更准确地测定在人类中的有用剂量。

本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过在体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来测定。由体外和细胞培养物测定以及动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。剂量可根据所采用的剂型和所利用的施用途径而有所不同。确切的制剂、施用途径和剂量可由医生个人参照患者病状进行选择(参见例如，Fingl等，1975，在"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"，第1页第1章中)。

可单独地调节给药量和间隔以提供活性成分足以诱导或抑制生物效应的嵌合多肽(靶组织)水平(最低有效浓度，MEC)。对于每种制剂而言MEC将变化，但是可以由体外数据估计。达到MEC所必需的剂量将取决于个体特征以及施用途径。可以使用检测测定法来测定血浆浓度。

根据待治疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次或多次施用，疗程持续数日至数周或者直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。

当然，待施用的组合物的量将取决于受治疗的受试者、患病的严重程度、施用方式、处方医生的判断等。

在一个实施方案中，每个成人剂量的嵌合多肽有效量范围为约1-500mg/m²，或约1-200mg/m²，或约1-40mg/m²或约5-25mg/m²。可选地，可施用平剂量，其量的范围可为2-500mg/剂、2-100mg/剂或10-80mg/剂。

在一个实施方案中，每个成人剂量的嵌合多肽有效量为约1-500mg/m²，或约1-200mg/m²，或约1-40mg/m²或约5-25mg/m²。可选地，可施用平剂量，其量的范围可为约2-500mg/剂、2-100mg/剂或10-80mg/剂。

在另一个实施方案中，每个成人剂量范围的嵌合多肽有效量为约0.0002mg/kg至2mg/kg、约0.002-2mg/kg、约0.02-2mg/kg、约0.2-2mg/kg、约0.002-0.2mg/kg、约0.0002-1mg/kg、约0.002-0.1mg/kg、约0.002-0.02mg/kg、约0.002-0.01mg/kg、约0.002-0.008mg/kg、约0.02-0.1mg/kg、约0.001-0.05mg/kg、约0.001-0.01mg/kg、约0.01-1mg/kg、约0.01-15mg/kg、约0.005-1mg/kg、约0.01-5mg/kg、约0.005-0.01mg/kg或约0.05-0.1mg/kg。根据一个特定实施方案，这些剂量范围用于例如表达嵌合蛋白的植物细胞的口服施用。

根据一个特定实施方案，每个成人剂量的嵌合多肽有效量范围为约0.002-0.2mg/kg。根据一个特定实施方案，该剂量范围用于例如表达嵌合蛋白的植物细胞的口服施用。

可选地，可施用平剂量，其量的范围可为约2-500mg/剂、2-100mg/剂或10-80mg/剂。根据一个特定实施方案，该剂量范围用于例如表达嵌合蛋白的植物细胞的口服施用。

根据一个特定实施方案，施用0.01-100mg、0.1-100mg、0.1-50mg、0.1-20mg、0.1-10mg、0.1-5mg的平剂量。根据一个特定实施方案，该剂量范围用于例如表达嵌合蛋白的植物细胞的口服施用。

根据一个特定实施方案平剂量为约0.1-10mg。根据一个特定实施方案，该剂量范围用于例如表达嵌合蛋白的植物细胞的口服施用。

根据一个特定实施方案，口服剂量每天施用。所述剂量在当天分成多次施用(即每天2-4次)。所述剂量也可每两天、每周两次、每周三次、两周一次、按周剂量，或分几周施用(例如实施例2至8)。

根据一个特定实施方案，如果要每周施用所述剂量一次以上，则示例性剂量范围与前面描述的剂量范围相同或更低并且每周施用两次或更多次(例如，25-100mg/剂)。在另一个实施方案中，通过注射施用的可接受剂量含80-100mg/剂，或可选地，含80mg/剂。

对于儿童和婴儿可改变所述剂量。

所述可按两周、周剂量或分几周施用(例如实施例2至8)。根据一个特定实施方案，嵌合多肽通常通过一次性皮下(SC)注射施用25mg。

在许多情况下，虽然更长期治疗可能对于诱导所需程度的改善是必需的，但是用高达约100mg剂量的药物组合物在至少3周期间每周1至3次将获得患者病状的改善。对于不能治愈的慢性病状可无限期地持续所述方案。对于儿科患者(4-17岁)，适合的方案涉及通过注射每周施用一次或多次0.4mg/kg至5mg/kg剂量的本发明的嵌合多肽。

在另一个实施方案中，预计将本发明的药物制剂制备成散装制剂并且像这样，调整药物组合物的组分以致其比施用所需的更高并在施用之前适当地稀释。

若需要，本发明的一些实施方案的组合物可于包装或分配装置中提供，例如FDA批准的试剂盒，其可装有一种或多种含活性成分的单位剂型。包装可包括，例如金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可附有用于施用的使用说明书。也可通过呈监管药品生产、使用或销售的政府机构规定的形式，与容器相关的公告调整包装或分配装置，该公告反映了组合物或人类或兽医施用形式受所述机构批准。此类公告可为，例如，美国食品和药品监督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)批准其用于处方药的标签或已批准产品的说明书。也可制备包含配制于相容性药物载体中的本发明制剂的组合物，置于适当容器中，并标示用于治疗所指示的病状(如上文进一步详述)。水性药物组合物中所述多肽的浓度可在大范围内改变，但是通常在水性制剂约0.05至约20,000微克/毫升μ/ml)的范围内。

值得注意的是，包含所述植物细胞的剂型可包括添加剂例如钙、镁、铁、锌、磷、维生素D和维生素K中的一种或多种。适合的日量为0.1mg至3.6g钙，优选320至530mg。一般而言，本发明营养制剂或药剂中维生素和矿物质的日剂量按卫生当局推荐剂量的重量计为25-100％。膳食纤维也可为本发明组合物的组分。补充物另外的组分可包括已知尤其对提高身体活动能力具有健康效益的任何生物活性化合物或提取物。

通常单位剂型还可包含抗氧化剂(上文提供了示例性实施方案)。在另一个实施方案中，抗氧化剂为药学上可接受的抗氧化剂。在另一个实施方案中，抗氧化剂选自维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)、欧米伽-3和β-胡罗卜素。

在另一个实施方案中，单位剂型还包含生物活性蛋白或肽的增强剂。在另一个实施方案中，单位剂型还还包含生物活性蛋白或肽的辅因子。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含药物级表面活性剂。表面活性剂在本领域中公知，并且尤其在药用辅料手册(HandbookofPharmaceuticalExcipients)(RaymondCRowe、PaulJSheskey和SianCOwen编，PharmaceuticalPress版权，2005)中有描述。在另一个实施方案中，表面活性剂为本领域已知的任何其它表面活性剂。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含药物级乳化剂或乳化物质(软化剂)。乳化剂和乳化物质在本领域中公知，并且尤其在药用辅料手册(同上)中有描述。乳化剂和乳化物质的非限制性实例为乳露(eumulgin)，乳露B1PH、乳露B2PH、氢化蓖麻油十八醇十六醇混合物和鲸蜡醇。在另一个实施方案中，乳化剂或乳化物质为本领域已知的任何其它乳化剂或乳化物质。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含药物级稳定剂。稳定剂在本领域中公知，并且尤其在药用辅料手册(同上)中有描述。在另一个实施方案中，稳定剂为本领域已知的任何其它稳定剂。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的类似和变形形式分别包括在术语“精氨酸”、“赖氨酸”、“天冬氨酸”、“谷氨酸”和“组氨酸”中。在另一个实施方案中，氨基酸提供对核糖核酸酶或其它活性分子的附加保护。在另一个实施方案中，氨基酸促进生物活性蛋白或肽与靶细胞的相互作用。在另一个实施方案中，在单位剂型的油组分中含有氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含其中混入了基质载体单位剂型的一种或多种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，赋形剂包括一种或多种附加多糖。在另一个实施方案中，赋形剂包括一种或多种蜡。在另一个实施方案中，赋形剂为所述单位剂型提供所需味道。在另一个实施方案中，赋形剂影响药物一致性和最终剂型例如凝胶胶囊或硬明胶胶囊。

赋形剂的非限制性实例包括：消泡剂(二甲聚硅氧烷、二甲基硅油)；抗菌防腐剂(苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸丁酯、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯基乙醇、醋酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、去水醋酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞、百里酚)；螯合剂(依地酸二钠、乙二胺四乙酸和盐、依他酸)；包衣剂(羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、明胶、药用釉料、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米醇溶蛋白)；着色剂(焦糖、红色氧化铁、黄色氧化铁、黑色氧化铁或掺混物、)；络合剂(乙二胺四乙酸和盐(EDTA)、依他酸、龙胆酸乙醇胺、硫酸羟喹啉)；干燥剂(氯化钙、硫酸钙、二氧化硅)；乳化剂和/或增溶剂(阿拉伯树胶、胆固醇、二乙醇胺(佐剂)、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、甘油一酯、甘油二酯、单乙醇胺(佐剂)、油酸(佐剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚乙二醇35蓖麻油、聚乙二醇40氢化蓖麻油、聚乙二醇10油醚、聚乙二醇20十六烷基十八烷基醚、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡)；调味剂和香料(茴香脑、安息香醛、乙基香兰素、薄荷醇、水杨酸甲酯、谷氨酸一钠、橙花油、薄荷、薄荷油、薄荷醑、玫瑰油、浓玫瑰水、百里酚、妥卢香脂酊、香草、香草兰酊、香兰素)；湿润剂(甘油、己二醇、丙二醇、山梨糖醇)；聚合物(例如，醋酸纤维素、烷基纤维素、羟烷基纤维素、丙烯酸类聚合物和共聚物)；悬浮剂和/或增黏剂(阿拉伯树胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、精制膨润土、膨润土浆、卡波姆934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠12、角叉菜胶、微晶和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚环氧己烷、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶态二氧化硅、藻酸钠、黄蓍胶、黄原胶)；甜味剂(天冬甜素、葡萄糖结合剂、右旋糖、赋形剂右旋糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨糖醇、山梨糖醇溶液、蔗糖、可压缩糖、糖果剂的糖、糖浆)。该列表并非意为排它性，而仅仅是可用于本发明的口服剂量单位剂型中的赋形剂分类及特定赋形剂的代表。

在本发明的组合物中可包括常规添加剂，包括选自防腐剂、螯合剂、泡腾剂、天然或人工甜味剂、调味剂、着色剂、掩味剂、酸化剂、乳化剂、增稠剂、悬浮剂、分散剂或润湿剂、抗氧化剂等的任一种。可向本发明的组合物中添加调味剂以帮助顺应给药方案。典型调味剂包括但不限于菠萝、橘子、柠檬、薄荷、浆果、巧克力、香草和甜瓜的天然或合成香精、油和/或提取物。

如本文中所用术语“约”指±10％。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其变化形式意为“包括，但不限于”。

术语“由…组成”意为“包括且限于”。

术语“基本上由…组成”意为组合物、方法或结构可包括附加成份、步骤和/或部分，但是只有在附加成份、步骤和/或部分不实质性改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新特征的情况下。

如本文中所用，除非上下文另外明确指出，则单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括其复数指示物。例如，术语“所述化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物(包括其混合物)。

在整篇说明书中，本发明的各种实施方案可呈范围形式呈现。应理解，呈范围形式描述仅是为了方便和简洁而不应解释为对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应视为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围如1至6的描述应视为已经具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5、和6。不论范围宽度这都适用。

当在本文中指定数值范围时，这意味着包括指定范围内的任何引用数值(小数或整数)。短语“范围介于”第一指定数值和第二指定数值之间及“范围为”第一指定数值“至”第二指定数值在本文中可交换使用并且意为包括第一和第二指定数值以及之间的所有小数和整数数值。

如本文中所用术语“方法”指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于，化学、药物、生物、生物化学和医学领域的从业者已知的或者容易从已知的方式、方法、技术和程序开发的方式、方法、技术和程序。

应当理解，为了清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以以单个实施方案呈组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独或以任何适合的子组合提供或如其所应在描述的本发明的任何其它实施方案中提供。认为在各个实施方案的上下文中描述的某些特征并非那些实施方案的必要特征，除非在没有那些要素的情况下，该实施方案无效。

如上文所述以及如下面的权利要求部分所要求的本发明的各个实施方案和方面可以从以下实施例中得到实验性支持。

实施例

现参考以下实施例，与以上描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施方案。

通常，本文中所用的命名法和在本发明中利用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术已在文献中充分解释。参见，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"第I-III卷Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等，"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等(编)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries"，第1-4卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美国专利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中提出的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"，第I-III卷，Cellis,J.E.编(1994)；"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第3版；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III卷ColiganJ.E.编(1994)；Stites等(编)，"BasicandClinicalImmunology"(第38版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，参见，例如，美国专利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521号；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.编(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.编(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.和HigginsS.J.编(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.编(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；其全部内容通过引用并入，如同在本文完全阐述一样。在本文件中提供了其它一般参考文献。认为其中的程序在本领域中公知并且是为了方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文。

实施例1

材料和实验程序

表达构建体和表达

优化表达prhTNFR2:Fc的cDNA并用GENEARTAG(Regensburg,Germany)合成。密码子使用适于烟草基因的密码子偏好。由FcIgG1重链恒定区[智人]登记号AEV43323克隆IgG1部分。

在优化过程中避免以下顺式作用序列基序：内部TATA盒、χ-位点和核糖体进入位点、富AT或富GC序列段、RNA不稳定性元件(“杀伤基序”)、重复序列和RNA二级结构、剪接供体(隐含)和受体位点、分支点。另外，避免极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区域。所得DNA序列如SEQIDNO:1中所示。编码的多肽如SEQIDNO:2中所示。向天然cDNA序列，将来自于皱叶烟草钙网蛋白的信号肽(例如内质网靶信号肽)添加到所述基因的N’端，允许prhTNFR2:Fc有效靶向分泌途径，然后一旦蛋白质易位到内质网内就由信号肽酶从多肽上裂解掉(SEQIDNO:3、SEQIDNO:4，分别表示ER信号肽的DNA和肽序列)。另外，向所述基因的C’端添加ER滞留信号SEKDEL。该信号允许蛋白质从高尔基体恢复到ER，并且定位于ER中。整个编码序列(信号肽-prhTNFR2:Fc-SEKDEL)由SEQIDNO:5编码并且编码的多肽如SEQIDNO:6中所示。裂解后所得蛋白质如SEQIDNO:7、204或205或214(prhTNFR2:Fc-SEKDEL)中所示。

在烟草BY2细胞中的稳定表达

土壤杆菌介导的转化广泛地用于将外来基因引入植物细胞基因组中。使用这种方法，将由外来基因及其调控元件组成的T-DNA分子随机引入植物基因组中。因为整合位点以及基因插入的拷贝数不可控制，所以转化过程产生由具有不同转基因表达水平的细胞构成的高度异源性转基因‘库’。转基因‘库’随后用于克隆分离。转化过程导致许多单细胞系的建立，每个单细胞系代表从中选择出外来基因表达水平最高的克隆的独立转化事件。对于prhTNFR2:Fc而言，用携带prhTNFR2:Fc盒的质粒进行转化(图1SEQIDNO:7和8)。因此，重组蛋白靶向细胞的内质网(ER)。BY2细胞受prhTNFR2:FC-ER表达载体的转化通过根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefeciens)介导的植物转化程序进行，如下：BY2(亮黄色细胞2)悬浮培养物与携带隐匿prhTNFR2:FC基因和新霉素磷酸转移酶(NPTII)选择基因的载体的根瘤土壤杆菌菌株一起共培养48小时。随后，将细胞保持在补充了50mg/L卡那霉素(Kanamaycin)和250mg/L头孢噻肟(Cefotaxime)的培养基中。NPTII基因赋予了对卡那霉素的抗性，从而仅NPTII阳性BY2细胞在这种选择培养基中存活。使用头孢噻肟选择性地杀死土壤杆菌，植物抗这种抗生素。

筛选最佳表达克隆

为了选择独立细胞系，将高度稀释的细胞悬浮液等分试样涂在固体BY-2培养基上(ToshiyukiNagata和FumiKumagaiMethodsinCellScience21:123–127，1999)。然后使细胞生长直至小的愈伤组织发育。然后将每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中。然后为细胞取样并估计prhTNFR2:FC。在变性条件下通过蛋白质印迹法筛选出约500个细胞系(图4)。通过相同方法进一步分析具有高表达水平的系以选择生成prhTNFR2:FC的克隆中的最高表达克隆。

凝胶电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在电场上根据其大小分离蛋白质。蛋白质在洗涤剂SDS的存在下呈其分子量对数的线性函数迁移。将prhTNFR2:FC在SDS-PAGE上的迁移模式和标志与商用分子量标准蛋白(NewEnglandBioLabs；产品目录号P7708S)比较和市场上可买到的在CHO细胞中表达哺乳动物细胞源性Enbrel(Entanercept；Wyeth)比较。通过含有β-巯基乙醇的还原性样品缓冲液或通过天然提取缓冲液从细胞中提取prhTNFR2:FC。天然提取上清液在分析之前与非还原性样品缓冲液混合。使用Criterion^TM细胞垂直电泳装置(Bio-RadLab.)，用预先混合的电泳Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(Bio-RadLaboratories)进行电泳。电泳后，将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到蛋白质结合硝化纤维素膜(iBlot^TM)上。在室温下用5％含0.1％吐温20(Tween20)的乳剂缓冲液封闭1小时。为了鉴定分子的Fc部分，使用与HRP(产品目录号109-035-098，Jackson.)偶联的山羊抗人IgG。为了检测TNFR2，采用兔抗TNFRII(ID:ab109853,Abcam)，接着采用山羊抗兔HRP(产品目录号111-035-003,Jackson)。用ECL检测试剂盒(Pierce)进行检测。将prhTNFR2:FC的免疫反应性与商用Enbrel(Entanercept；Wyeth)比较。使用分子成像仪凝胶DocXR系统(Bio-RadLaboratories)检测条带。

通过质谱法为氨基酸测序

送prhTNFR2:FC到以色列理工学院(Technion-IsraelInstituteofTechnology)(Haifa,Israel)的Smoler蛋白质组学中心(SmolerProteomicsCenter)进行测序分析。从凝胶上提取蛋白质，用2.8mMDTT(60℃，30min)还原，用在100mM重碳酸铵中的8.8mM碘乙酰胺改性(在黑暗中、室温下，30分钟)并且在37℃下按1:50酶:底物比例于含改性胰蛋白酶(Promega)或含胰凝乳蛋白酶的10％ACN和10mM重碳酸铵中消化整夜。在装有Reprosil反相材料(DrMaischGmbH,Germany)的0.075X200-mm熔融石英毛细管(J&W)上通过反相色谱法溶解3％所得到的肽。用60分钟5至45％的线性梯度和15分钟95％乙腈与0.1％甲酸在水中以0.25μl/min的流量洗脱所述肽。用离子阱质谱仪(Orbitrap,Thermo)在正离子模式下重复使用全MS扫描，接着通过选自首次MS扫描的7个最具优势的离子的碰撞诱导解离(CID)进行在线质谱分析。

使用Sequest3.31软件(J.Eng和J.Yates，UniversityofWashingtonandFinnigan,SanJose)与特定序列分析质谱数据。

糖基化分析

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和植物细胞系统中生成的糖蛋白之间的主要差异是糖基化谱型和聚糖结构。已进行了初步分析以表征附于蛋白质上的各种N-联聚糖结构。将这些结果与在商用Enbrel中发现的N-糖基化谱型的结果比较。确定O-联聚糖和聚糖位点分析的存在。

prhTNFR2:FC和商用Enbrel的样品经还原、烷基化并且在SDS-PAGE上分离。取～75KDa的蛋白质条带(总共约200μg蛋白质)，使用胰蛋白酶消化，接着对于prhTNFR2:FC而言使用肽N-糖苷酶A(PNGaseA)或肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化(分别为总蛋白的～80％和～20％)并且对于商用Enbrel而言仅用肽N-糖苷酶F消化，进行聚糖分析。用胰蛋白酶，接着用肽N-糖苷酶A消化释放了全部N-联聚糖并且用肽N-糖苷酶F消化释放了除含有α1-3核岩藻糖外的所有聚糖(存在于植物中)。提取、清洁释放的聚糖，然后用荧光试剂邻氨基苯甲酰胺(2-氨基苯甲酰胺，2AB)标记，接着去除过量2AB。分析方法包括在带有与荧光检测器(激发波长330nm，发射波长420nm)耦合的正相酰胺基柱(TosohTSK酰胺-80柱)的WatersHPLC系统上分离聚糖。经标记的聚糖库的测序通过用各种外切糖苷酶依次消化，接着通过附加HPLC分析实现。使用用各种外切糖苷酶的依次消化提供了关于聚糖结构谱型及其相对量的额外信息。对从prhTNFR2:FC释放的聚糖进行的外切糖苷酶消化是用去除β1-2,3,4和6N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的JBH(洋刀豆β-N-乙酰氨基己糖苷酶)，用去除甘露糖α1-2,6>3甘露糖的JBM(洋刀豆甘露糖苷酶)和用去除α1-6和α1-3核岩藻糖的BKF(牛睾丸岩藻糖苷酶)。荧光标记使得对总消化聚糖库中各种聚糖结构的分布的半定量分析成为可能。然后根据独特聚糖键并且按照大小递增的顺序使用由甲酸铵和乙腈组成的梯度溶剂流分离聚糖。将独立聚糖的保留时间与部分水解的葡聚糖片段的标准混合物的保留时间比较，得到一系列葡萄糖单元(GU)。根据其GU值，基于标准和与外部数据库(http://glycobasedotnibrtdotie:8080/database/show_glycobasedotaction)的比较为聚糖分配峰值。由肽N-糖苷酶A消化的色谱图计算最终分配和相对峰面积。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

结合ELISA：TNF结合ELISA是商用TNF检测ELISA试剂盒(人TNF-α；HycultBiotechInc.#HK307)和商用抗人IgG抗体(山羊抗人IgGFC特异性HRP；Sigma)的组合。所述测定是对prhTNFR2:FC结合活性的定量非放射性测定。这种结合ELISA使得能够检测包含TNFR和IgG结构域的功能(能够结合TNF)分子。

预先涂有抗TNF的抗体的ELISA板在室温下用TNF(60ng/ml，Sigma)培养1小时。在每个ELISA步骤期间，用商用洗涤缓冲液洗涤所述板3次。商用Enbrel和来自于表达prhTNFR2:FC的BY2细胞的上清液(连续稀释液)在室温下在ELISA板上培育2小时。山羊抗人IgGFCHRP经1:10,000稀释并且在室温下在板上培育1小时。TMB用作HRP的底物。用10％HCL终止比色反应并且在450nm下测定吸光度。

A375细胞中TNFα诱导的凋亡的预防

使A375细胞(人黑素瘤细胞)在培养基(ATCC，#30-2002，补充了10％FBS)中悬浮生长。在96孔测定板中接种10⁴个细胞/孔并且在测定培养基(ATCC，#30-2002，补充了5％FBS)中培育过夜。在37℃下在不同浓度(1.562-100ng/ml)的prhTNFR2:FC或商用Enbrel(Entanercept；Wyeth)的存在下培育重组TNFα(2ng/ml，ProSpec,Rehovot,Israel)2小时。培育后，在放线菌素D(0.8μg/ml)的存在下将混合液添加到A375细胞中，在37℃、5％CO₂下加湿培育箱内再培育24小时并且通过MTT测定(Sigma产品目录号M5655)确定凋亡的定量。在570-650nm下读板并且计算对TNF-α诱导的细胞毒性的抑制(％)。

实施例2

蛋白质分析

在还原(图2A)和非还原条件(图2B中天然提取)下分析prhTNFR2:FC。使用抗Fc抗体(上图)和抗TNFR2抗体(下图)检测prhTNFR2:FC(泳道1)和商用Enbrel(泳道2)。两种蛋白质在迁移特征上展示出略微差异，大概是由于植物和哺乳动物细胞表达的酶之间在糖基化模式上的差异。

通过将表达prhTNFR2:Fc(PRX-106)的BY2细胞的溶解产物的连续稀释液与商用Enbrel比较检查TNF受商用Enbrel和prhTNFR2:FC的结合。prhTNFR2:FC连续稀释液展示出与商用蛋白质相似的剂量反应结合模式(参见图3)。根据蛋白质表达选择转基因细胞系通过蛋白质印迹法进行。因此，为了允许选择独立细胞系，将高度稀释的细胞悬浮液等分试样涂在固体BY-2培养基上。然后使细胞生长直至小的愈伤组织发育。然后将每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中。然后为细胞取样并通过在还原条件下提取，接着通过生成的靶蛋白的蛋白质印迹鉴定(抗FC抗体)估计prhTNFR2:FC表达水平(图4)。表达的蛋白质的功能性由其预防TNF诱导的凋亡的能力确立。具体而言，可通过其在转录抑制剂，放线菌素D的存在下诱导某些细胞系的细胞死亡的能力测量TNF活性。用TNFα的中和蛋白预培育防止与受体(TNF-R1和TNF-R2)的结合，从而抑制了细胞因子作用并预防了TNFα诱导的细胞死亡。通过MTT测定量化细胞活力为TNFα细胞毒性提供了细胞内活性测定。关于黑素瘤细胞的结果示于图5A-G中并且关于L929成纤维细胞的结果示于图6A-G中。

实施例3

prhTNFR2:FC抑制炎症性肠病(IBD)

炎症性肠病(IBD)是由遗传、免疫和环境因素介导的慢性肠道炎症。每年约0.2-0.3％的人群诊断出IBD。IBD特征在于胃肠道(GIT)内对慢性或复发性免疫激活和炎症的倾向。其具有两种表现：克罗恩氏病(CD)，可能涉及GIT从口腔到肛门的任何位置的一种慢性炎症，和溃疡性结肠炎(UC)，影响直肠并且在近侧蔓延以影响结肠的变动度的一种炎症性病症。CD更多受TH1免疫细胞反应调节，尤其过度生成细胞因子IL-12、IFN-γ和TNFα。另一方面，UC主要受TH2免疫细胞反应调节。

PRX106是在尤其涉及TH1免疫细胞反应的炎症中过度生成的细胞因子的可溶性受体。经证实PRX106在其它炎症模型(类风湿性关节炎)中IV注射时非常有效。PRX106在Protalix的ProCellEx^TM系统中，在BY2植物细胞中过表达。作为植物细胞，BY2具有在移动通过胃部和小肠的同时可以帮助保护PRX106的细胞壁。在结肠中，在消化多糖时，植物细胞释放其内容物并且因此PRX106自由地结合其细胞因子配体。而且，PRX106为携带人IgG1的Fc片段的嵌合蛋白。在为粘膜屏障加衬的单层上皮细胞中，FcRn受体通过与其Fc结合转胞吞IgG分子。因此，PRX106也可穿过上皮屏障以结合其在上皮细胞浆膜侧的细胞因子配体。

IBD模型分为5大类：化学诱导模型、细胞转运模型、自发模型、先天(自发性基因突变)模型和基因工程模型。在最广泛使用的化学诱导模型中，通过直肠内施用被认为会诱导对半抗原修饰的自体蛋白/管腔抗原的T细胞介导反应的共价反应性试剂TNBS/噁唑酮(oxazolone)诱导结肠炎。在DSS模型中，小鼠接受补充了似乎对基底隐窝的结肠上皮细胞有直接毒性的DSS(葡聚糖硫酸钠)的饮用水数天。通过为3种主要临床体征(减重、腹泻和直肠出血)评分评价疾病严重程度。使用小鼠模型TNBS(实施例3A)和DSS(实施例3B)测定表达嵌合多肽的植物细胞的治疗功效。

实施例3A

正如体内三硝基苯磺酸(TNBS)模型中所证明PRX106表达细胞在减轻IBD症状中有效

材料和方法

道德声明-所有程序均严格按照实验动物护理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)进行。

动物

在所有实验中均使用8-9周龄雄性Balb/c小鼠。每个实验组包括5至10只小鼠。小鼠购自HarlanLaboratories,Israel。在开始实验前几天将所有小鼠移到无SPF的室内(自然细菌区系)。

TNBS诱导

在小鼠中通过直肠置入TNBS诱导TNBS[M.F.Neurath,I.Fuss等：jexp.Med182’1281-1290(1995)]。通过在激发7天前向其腹部的剃毛皮肤涂抹100μL于乙醇中的1％TNBS使小鼠致敏。在激发当天，给予小鼠120μL经由导管缓慢注入结肠腔内的1％TNBS(SigmaAldrich)。在TNBS处理后，从第0天到第4天每天用相当于5μg蛋白质(剂量I)和30μg蛋白质(剂量II)的表达PRX-106的BY-2细胞；PRX-106表达细胞的相同口服施用体积的BY-2(-)对照细胞；和盐水经口(PO)处理小鼠。TNBS对照小鼠接受单独的PBS。每天监测一次动物的重量。通过从第0天的重量中减去日重量计算减重。在实验后，处死并解剖动物。在第5天，通过心脏穿刺收集血样，并任其凝结，然后离心得到血清以测定血清细胞因子水平。(Cury等CellImmunol.2013,282(1)；66-70。在三次独立实验中对每组5-15只小鼠进行实验；在所有实验中结果遵循相同模式。

重组植物细胞的口服施用

表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的口服施用在TNBS施用6小时后开始。小鼠接受悬浮于350-500μL的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。阴性对照接受相同口服施用体积的宿主模拟植物细胞，而不是表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。口服施用通过管饲法进行。另两种对照为未经处理的小鼠和接受盐水、经TNBS处理的小鼠。

细胞因子谱型分析

使用ELISA试剂盒按照生产商的说明测定细胞因子TNF-α和IL-10的血清水平(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。

抗体芯片

细胞因子含量的血清定量测量使用小鼠细胞因子抗体芯片(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)，根据生产商手册进行。

免疫组织化学

石蜡包埋的结肠组织切片(5μm)经脱蜡、再水合、洗涤并在3％H₂O₂中培育并且封闭(BarSela等2006)。用IkB-αpSer32/Ser36抗体(Abcam)培育载玻片。使用DAB底物试剂盒(ThermoScientific)或ZymedAEC底物试剂盒(ZymedLaboratories)显色，接着用梅氏苏木精(Mayer’shematoxylin)复染。未添加一次抗体的对照在所有情况下均显示出低的或未显示出背景染色。根据Bar-Sela等Histopathology.2006；49:188–193进行封闭。

流式细胞术

从小鼠收获脾脏于RPMI1640培养基中。通过用刀片把脾脏切成小块，接着经过40μM尼龙过滤器(BDFalcon)制备细胞悬浮液。用抗小鼠CD4(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)和抗小鼠CD25(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)培育脾细胞。然后固定细胞并且在4℃下透化20分钟，然后用稀释于透化缓冲液中的抗小鼠Foxp3(小鼠调节性T细胞3-色流试剂盒，R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)培育30分钟。通过FACS分析一万个CD4⁺细胞。

宏观性结肠损伤

使用华莱士宏观评分系统评估结肠的宏观性外观[W.Vermeulen、J.G.deMan、S.Nullens、P.A.Pelckmans、B.Y.deWinter和T.G.Moreels，“TheuseofcolonoscopytofollowtheinflammatorytimecourseofTNBScolitisinrats,”ActaGastro-EnterologicaBelgica，第74卷，2号，第304–311页，2011]。在这种评分系统中，基于溃疡形成、炎症和疾病程度按以下从0到10的范围评估炎症：0＝粘膜情况正常，1＝局部充血，无溃疡形成，2＝溃疡形成，3＝一个部位溃疡形成且肠壁增厚，4＝两个或更多个部位溃疡形成和肠壁增厚，5＝较多部位损伤沿结肠的长度延伸<2cm，并且6–10＝损伤延伸>2cm(每1厘米损伤组织，得分加1)。

结果

在TNBS施用开始4天后监测，口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞改善了TNBS诱导的体重减轻(图7A-B)。

测量结肠长度作为经TNBS处理的小鼠中结肠炎症的形态指标；结肠短指示炎症状态。如图8所示，经TNBS处理的小鼠的结肠长度与对照小鼠相比明显缩短。处理组(口服施用表达prTNFR2:Fc的细胞)的结肠长度比TNBS处理组明显更长。口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞改善了TNBS诱导的结肠炎的宏观性特征。结肠的宏观性检查显示与未处理的结肠相比，结肠损伤严重程度降低(图9)。

口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞减少了有TNBS诱导的结肠炎的小鼠体内促炎性细胞因子的表达(图10A-C)。评价处理对与TNBS结肠炎有关的促炎性细胞因子和炎性细胞因子的血清水平的影响。注意到在大多数TNFR2:Fc处理组中，促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平降低，并且抗炎性细胞因子IL-10的表达水平升高。

图11A-B显示经口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞处理降低了炎症介质如粒细胞菌落刺激因子G-CSF、巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)的水平，潜在地表明通过降低来自于血液的骨髓来源细胞的全身性募集减少了全身性炎症。

最近，已经证明生成IL-17的Th17细胞和CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg细胞的发育和功能的失调在自身免疫性疾病，包括IBD中起重要作用。Treg细胞，也称为CD4⁺CD25⁺、FOXP3⁺，牵涉于外周耐受性的维持和通过引发对活化免疫细胞的抑制作用控制免疫反应。当前分析显示口服施用表达TNFR2:Fc的植物细胞扩大了脾脏中的功能调节性T(Treg)细胞群体。

总之，以上结果证明表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的口服施用是改善TNBS诱导的结肠炎的抗炎剂。

实施例3B

正如体内葡聚糖硫酸钠诱导(DSS诱导)模型中所证明PRX106表达细胞在减轻IBD症状中有效

IBD的葡聚糖硫酸钠诱导(DSS诱导)小鼠模型用于在炎症性肠病中有功效的化合物。这是具有与在人UC中观察到的相似症状，例如腹泻、血便、体重减轻、粘膜溃疡形成和大肠缩短的实验急性溃疡性结肠炎模型。

道德声明

所有程序均严格按照实验动物护理和使用指南进行。

动物

在所有实验中均使用8-9周龄雄性C67/Bl小鼠。每个实验组包括10只小鼠。小鼠购自HarlanLaboratories,Israel。在开始实验前几天将所有小鼠移到无SPF的室内(自然细菌区系)。

在经DSS处理和随后口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的小鼠中对结肠炎的诱导和评价

通过于正常饮用水中施用1.5％(重量/体积)DSS(试剂级DSS盐；分子质量＝36–50kD；MPBiomedicals)5天，接着是5天正常耗水量，诱导结肠炎。在DSS诱导24小时后每天开始用口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；包含单独载体的模拟细胞处理或对照处理(盐水)7天。在DSS处理5天后通过钻取活组织检查和组织学评分评估结肠炎症。每天监测一次动物的重量，通过从第0天的重量中减去日重量计算减重。在实验后，处死并解剖动物；通过结肠长度测量与未处理结肠相比评估结肠缩短；通过心脏穿刺收集血样，并任其凝结，然后离心得到血清以测定血清细胞因子水平。

重组植物细胞的口服施用

表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的口服施用在DSS施用24小时后开始。小鼠接受悬浮于500μl盐水中的表达重组TNFR2:Fc(包含30μg蛋白质)的植物细胞。阴性对照接受与表达重组TNFR:Fc的植物细胞等体积的宿主模拟植物细胞。另两种对照为施用了盐水的DSS处理小鼠和未经处理的小鼠。口服施用通过管饲法进行。

结肠炎症分析

石蜡包埋的结肠组织切片经苏木精和伊红染色以进行光学显微镜检查评估结肠损伤和炎症。由不清楚处理条件的病理学家从病理上分析来自于整个结肠的样品。使用包括炎症程度、隐窝损伤、炎症所涉面积百分比和炎症深度的评分系统。

钻取活组织检查

用含有抗生素的PBS冲洗小鼠结肠3次并且沿纵轴打开。之后，获得4-mm²钻取活组织检查切片并且在补充了抗生素的RPMI-1640培养基中培育24小时。收集上清液并且保持在-20℃下直至评估细胞因子表达。用结肠外植体调节的培养基中细胞因子含量的定量测量使用Luminex磁性筛选测定(MagneticLuminexScreeningAssay)根据生产商的手册进行(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。

细胞因子谱型分析

使用Luminex磁性筛选测定根据生产商的说明测定细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的血清水平(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)。

结果

1.口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞改善了DSS诱导的体重减轻

在DSS施用之后每天监测体重(图13A-B)。正如可见，经口服用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞处理小鼠减弱了由DSS诱导的减重。

2.口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞抑制了小鼠中DSS诱导的结肠炎

测量结肠长度，因为已确定短结肠可用作经DSS处理的小鼠中结肠炎症的形态指标。如图14A-B所示，经DSS处理的小鼠的结肠长度与对照小鼠相比明显缩短。在口服施用表达重组TNFR2:Fc的细植物细胞的组中结肠的长度比TNBS处理组明显更长。

3.DSS结肠炎后口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对肠道炎性细胞因子的影响

图15显示在用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞口服治疗后肠道促炎性细胞因子在统计上显著减少。

4.口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞减少了有DSS诱导的结肠炎的小鼠中促炎性细胞因子的表达

评价口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对与DSS结肠炎有关的促炎性细胞因子的生成的影响。如图16所示，DSS诱导血清中促炎性细胞因子例如IL-6和TNF-α的蛋白质表达，而口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞抑制促炎性细胞因子的宿主蛋白分泌。这些结果指出口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞抑制DSS诱导结肠炎模型中促炎性细胞因子的生成。

5.作为结肠炎症指征的组织病理学检查

通过组织学检查进一步评价结肠炎的严重程度(图17)。在DSS施用后，结肠表现出穿壁性炎症和炎症细胞的剧烈浸润。这种细胞流入与整个结肠中溃疡形成、杯状细胞损失和隐窝内的明显破坏相关。值得注意的是，用表达TNFR2:Fc的植物细胞口服治疗明显改善了DSS诱导的肠炎的组织学特征。结肠的组织学检查显示与DSS和模拟处理结肠相比，在经口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞处理的小鼠的结肠中，结肠损伤严重程度降低。

总之，本研究支持口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞作为具有改善IBD能力的抗炎剂的作用。

实施例4

在饲喂表达重组TNFR2:Fc的植物细胞后的不同时间点评价重组TNFR2:Fc蛋白药代动力学性质

材料和方法

动物

大鼠(SD，雌性/9-10周/n＝6)经受20小时禁食，然后饲喂(自由饲喂)表达重组TNFR2:Fc(PRX-106)和宿主BY2(-)的细胞。饲喂2小时后，测量食物消耗量。幼小乳鼠(SD，雄性和雌性/16日/n＝6)禁食3小时并且饲喂(通过管饲法)表达重组TNFR2:Fc(PRX-106)的细胞和宿主BY2(-)细胞。

TNFR2谱型分析

在每个时间点(利润，0、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时)收集血样，任其凝结，然后离心以获得血清。使用ELISA试剂盒按照生产商的说明(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)测定人TNFRII的血清水平。

结果

图18中示出了血清中的TNFR2:Fc水平。结果证明在口服施用表达所述蛋白质的植物细胞后血浆中的TNFR2:Fc水平升高。在8小时时检测血清中的TNFR2:Fc水平，并且在24小时时仍可检测。饲喂宿主BY2(-)的大鼠血清中的TNFR2:Fc水平不可检测。

然后实验接着是分析在饲喂表达TNFR2:Fc的植物细胞后的不同时间点乳鼠血浆中的重组TNFR2:Fc蛋白质药代动力学性质。图19中示出了血清中的TNFR2:Fc水平。结果证明在口服施用TNFR2:Fc后血浆中的TNFR2:Fc水平升高。血浆中的TNFR2:Fc水平在4小时时达到最高。很可能，相对于成年大鼠，乳鼠血清中TNFR2:Fc水平增加是由于在乳鼠肠道内FcNR的表达。饲喂宿主BY2(-)的大鼠血清中的TNFR2:Fc水平不可检测。

实施例5

在小鼠中的毒理学研究

方法

动物

在研究开始前8周将雄性和雌性SD大鼠(HarlanLaboratories,Israel)关在标准实验室条件下。研究开始时平均重量对于雄性而言为约6.8g且对于雌性而言为6.3g。动物饲喂商用啮齿动物饮食(Teklad全球认证18％蛋白质饮食产品目录号：2018SC)并且自由接近经高压蒸汽处理和酸化的饮用水(pH介于2.5和3.5之间)。

研究设计

分配4个组，3个给药组，每组含12只大鼠(6只雄性和6只雌性)和1个对照，每组含6只大鼠(3只雄性和3只雌性)。每种性别中，对照组接受稀释缓冲液(0.2M甘露糖醇)并且3个处理组按0.1、0.5和1mgTNFR2:Fc/Kg体重的剂量水平接受表达TNFR2:Fc的细胞。根据要求的表达蛋白量等分细胞。每份等分试样与30克商用啮齿动物饮食粉末和稀释缓冲液混合，以制作球丸。用稀释缓冲液和单独的商用啮齿动物饮食粉末制备对照球丸。所有动物每天口服饲喂所述球丸14天。研究期间，进行死亡率和一般临床观察，每天监测体重。在研究结束时(第15天)，在经二氧化碳吸入浅麻醉后，从所有动物的眼球后总窦抽取3份血样，之后，处死动物，实施病理学检查并收获所选器官。

结果

在14天安全研究期间未记录到不良临床症状。所有血液参数均在正常范围内，无显著偏差。体重增加持续且正常，组间(经处理或对照)无显著差异。细胞表达被发现安全且耐受良好，无不良影响。未发现对生物化学参数或临床症状的影响。总的尸体剖检观察未揭示出病理学发现。未发现动物呈垂死状态或处于严重痛苦条件下。未观察到呈现严重疼痛或体质下降的动物。

实施例6

PRX-106的测序

通过埃德曼降解(Edmandegradation)N端测序

在Alphalyse(Denmark)uainf，一种ABIProcise494测序仪上进行分析。所述程序通过埃德曼降解化学方法确定蛋白质和肽的N端氨基酸序列。埃德曼降解是一个循环过程，其中一次裂解掉一个氨基酸残基并通过色谱法鉴定。在循环过程中有3个步骤。在步骤1中，PITC试剂在碱性条件下与N端氨基偶联。在步骤2中，在酸性介质中裂解N端残基。在步骤3中，将PITC偶联残基转移到烧瓶中，转化为PTH-残基并通过HPLC色谱法鉴定。然后开始下一个循环以鉴定下一个N端残基。

结果：

确定序列为LPAQV(SEQIDNO:18)。

通过与质谱检测仪耦合的反相HPLC验证氨基酸序列

在Smoler蛋白质组学中心(Technion-IsraelInstituteofTechnology,Haifa,Israel)进行测序。使用与质谱检测仪耦合的反相HPLC进行分析。

方法

蛋白水解

分析的样品重新悬浮在8M脲、100mM重碳酸铵(ABC)中，接着用2.8mMDTT还原(60℃，30分钟)并且在黑暗中在环境温度下用在100mMABC中的8.8mM碘乙酰胺再改性30分钟。在37℃下按1:50酶:底物比例于2M脲、25mMABC中消化蛋白质整夜。

质谱分析

使用载物台尖端(国产C18)为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶肽脱盐，蒸发残留缓冲液并使球丸重新悬浮在0.1％(v/v)甲酸中。通过反相液相色谱法在装有Reprosil反相材料(DrMaischGmbH,Germany)的0.075X200-mm熔融二氧化硅毛细管(J和W)上通过反相液相色谱法溶解20ng所得到的肽。用60分钟5至45％的线性梯度，接着是15分钟95％乙腈与0.1％甲酸在水中以0.25μL/min的流量洗脱肽。在离子阱质谱仪(Orbitrap,Thermo)上在正离子模式下重复使用全MS扫描，接着通过选自首次MS扫描的7个最具优势的离子的碰撞诱导解离(CID)进行在线质谱分析。使用Discoverer软件1.3版软件，使用特定蛋白质推导数据库分析质谱数据。

结果

将序列与依那西普序列的肽序列比较。在下面表面V中呈现了鉴定的序列。呈现参考序列84.8％的覆盖率(参见绿色部分，图20).

表V-用胰蛋白酶消化后鉴定的肽(SEQIDNO:19-203)

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尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但是显然许多替代、修改和变型对本领域技术人员而言将显而易见。因此，其意图在于包括属于所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类替代、修改和变型。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本说明书中，其程度如同特别地且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文一样。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。至于所使用的章节标题，不应将其解释为必要性限制。