铁皮石斛组培一步成苗批量化生产的方法

摘要

本发明公开了铁皮石斛组培一步成苗批量化生产的方法，包括以下步骤：(1)原球茎的繁殖：选择优良铁皮石斛植株的顶芽或腋芽为外植体，外植体消毒后在MS+6-BA0.1～3.0mg/L+KT0.2～1.0mg/L+IAA0.1～1.0mg/L+NAA0.2～2.0mg/L+矮壮素0.01～0.5mg/L琼脂固体培养基上，诱导原球茎的同时分化出健壮芽；(2)一步成苗批量化生产：将步骤(1)获得的带芽原球茎直接转入MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+NAA0.1～2.0mg/L+矮壮素0.5～2.0mg/L的琼脂固体培养基上进行增殖、分化、壮苗和生根；(3)试管苗移栽。本发明提供了一种繁殖周期短、成本低的铁皮石斛高效低耗量的组织培养方法；非常适合工业化生产，而且达到产业化水平。

说明书

技术领域

本发明属于铁皮石斛的组培技术领域，具体涉及一种铁皮石斛组培苗 一步成苗批量化生产的方法。

背景技术

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)为兰科石斛，属多 年生草本植物。铁皮石斛的药用与保健价值极高，“铁皮石斛”一词始出 自《神农本草经》，国际药用植物界称其为“药界大熊猫”；被民间称作 “救命仙草”。现代临床应用和药理研究证实，铁皮石斛具有滋阴润肺、 养胃生津、健脑明目、保肝宁心、清热降火、补五脏之虚劳、轻身延年的 神奇功效。对慢性疲劳综合症、肺病、冠心病、肾病、慢性肝病、高血压、 高血脂、高血糖、糖尿病、慢性胃病、干燥综合症、癌症等疾病都有确切 疗效和调理康复作用。可增强肌体免疫力、抗氧化、抗衰老，对烟酒过度、 劳累过度、夜生活过度、用眼用脑过度、声音嘶哑、口干舌燥等康复有特 殊疗效。

铁皮石斛的种子极小、无胚乳，每粒种子只有3‐4个细胞，自然条件下需与 某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培；而传统的分株、扦插等方式的繁 殖率极低，加上人为的过度采挖和生态环境的破坏，其资源已濒临灭绝。铁皮 石斛组织培养快速繁殖技术是解决铁皮石斛大面积栽培用苗的一个最有效的途 径。

近年来，科研工作者对铁皮石斛组织培养快速繁殖进行了大量产业化技 术研究，但是大部分采用外植体—原球茎诱导—分化—壮苗--生根—移栽 的途径进行工厂化生产，培养程序特别繁琐；另外，培养基需添加特殊成 份，才能获得优质健壮的种苗。如最新的铁皮石斛中国专利 201310681992.4、201310699964.5、201410113720.9等，除基本培养基和 激素外，还需添加香蕉汁、或马铃薯汁、或脯氨酸、或水解酪蛋白、或茶 多酚、或活性炭等其它成份，才能获得健壮的试管苗，以至于市场上铁皮 石斛组培苗价格高，至少要15元/瓶。种植户买不起优质种苗，从而制约了 铁皮石斛优质种苗产业化推广。因此，本发明致力于开发一种高效、低成 本的培养体系。

发明内容

针对铁皮石斛的组织培养培养程序繁琐、成本高的问题，本发明目的 是提供一种繁殖周期短、成本低的铁皮石斛高效低耗量的组织培养方法。 本发明方法非常适合工业化生产，而且达到产业化水平。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

铁皮石斛组培一步成苗批量化生产的方法，包括以下步骤：

(1)原球茎的繁殖：选择优良铁皮石斛植株的顶芽或腋芽为外植体，外植 体消毒后在MS+6-BA0.1～3.0mg/L+KT0.2～1.0mg/L+IAA0.1～1.0 mg/L+NAA0.2～2.0mg/L+矮壮素0.01～0.5mg/L琼脂固体培养基上，诱 导原球茎的同时分化出健壮芽；

(2)一步成苗批量化生产：将步骤(1)获得的带芽原球茎直接转入 MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+NAA0.1～2.0mg/L+矮壮素 0.5～2.0mg/L的琼脂固体培养基上进行增殖、分化、壮苗和生根；

(3)试管苗移栽。

步骤(1)中将外植体剪成0.5-1cm长含有1节1芽(即至少含有一个顶 芽或者腋芽的茎段)的规格。

步骤(1)外植体消毒过程：首先用洗衣粉清洗干净，在无菌操作台上 用无菌水洗5～7次，用70％酒精浸润30秒～1分钟，再放入0.1％的升汞溶 液中灭菌8～15分钟，无菌水冲洗5～6次，备用。

步骤(1)优选使用的培养基：MS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L+IAA0.25 mg/L+NAA0.5mg/L+矮壮素0.1mg/L；或者优选使用培养基： MS+6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+IAA0.3mg/L+NAA0.4mg/L+矮壮素0.3mg/L。

步骤(1)诱导出的原球茎继续继代培养，每隔40～50d继代一次。

步骤(2)优选使用的培养基：MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.3mg/L+NAA0.4 mg/L+矮壮素0.6mg/L；或者优选使用培养基：MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2 mg/L+NAA0.6mg/L+矮壮素0.9mg/L。

步骤(2)培养时每隔35～45d出苗一次。

步骤(1)和(2)的培养温度为24℃±2，1000～2000lx环境中，每 天10～12小时光照培养。

步骤(3)试管苗移栽具体过程：试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的瓶 苗，放置室外炼苗5-7d，随后取出清洗根部培养基，将幼苗移栽至栽培基 质中，栽培基质中质量比例苔藓：树皮:蛭石＝5:3:1，在温度为20～28℃， 空气湿度80～90％的条件下生长，30～40d长出新叶时，即已成活。

本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、针对现有技术存在的不足之处，本发明通过组织培养技术短期内获得大 量原球茎，增殖倍数达到22-45，一般增殖倍数在5-20之间；现有的组培方 法生长的原球茎一般都要切割，而采用本发明方法和培养基则获得的原球 茎不用切割，直接转瓶(可通过图2看出长出的一株株单独的原球茎，是无 需采用工具分割开的)，方法极其简单，可以节约接种工的生产成本。

2、根据前人的研究，铁皮石斛的组织培养主要采用外植体一原球茎(诱 导培养)一分化幼苗(分化培养)一壮苗(壮苗培养)一生根(生根培养)— 移栽(移栽培养)等多个培养程序完成，至少需要120d。本发明培养程序 分两步完成，首先提高原球茎增殖倍数，加快基础苗的繁殖(增殖倍数达 22-45)，在较短时间内实现大规模生产；其次，批量化生产阶段原球茎同 步增殖分化壮苗和生根，将培养程序中四步简化为一步完成，即“一步成 苗”方法，形成完整植株只需35-45天，节约了60～80d时间获得优质种苗， 生产效率高。

3、原球茎增殖时，添加低浓度矮壮素(浓度为0.01-0.5mg/L)，促进原 球茎的增殖和分化，而且芽苗健壮；批量化生产时，再添加较高浓度矮壮 素进行培养，能获得高质量的种苗。本发明在生产过程中，根据苗的长势， 控制好矮壮素的适宜浓度，能获得最佳培养效果。

4、以生产10000L铁皮石斛培养基为例，如每升添加100g香蕉，需添加1000 kg香蕉，单价为7.0元/kg，增加了7000元的成本；如每升添加1g脯氨酸， 需10kg脯氨酸，单价1.8元/g，增加了18000元的成本；每升添加100毫升 椰子汁，需1000000ml椰子汁，单价为0.015元/ml，增加了15000元的成 本。本发明选择常用MS为基本培养基，矮壮素为壮苗剂，无需添加香蕉汁、 马铃薯汁、脯氨酸、水解酪蛋白、茶多酚、活性炭等其它特殊成分；本发 明方法配置10000L培养基，只需5-10克矮壮素，单价为0.9元/g,仅需 4.5-9.0元，可忽略不计。本发明不仅减少了无菌操作步骤，而且节约了培 养室空间，简化了健康种苗生产程序，大幅度降低了生产成本，提高了生 产效率。

附图说明

图1为铁皮石斛原球茎增殖分化生长情况；

图2为铁皮石斛分散的原球茎；

图3为铁皮石斛原球茎转瓶后的情况；

图4为铁皮石斛继代培养原球茎同步增殖分化壮苗和生根情况；

图5增殖分化壮苗生根苗；

图6为移栽成活的铁皮石斛试管苗生长情况；

图7为铁皮石斛大规模瓶苗生产；

图8为铁皮石斛大规模盆苗生产；

图9为铁皮石斛大规模成苗生产。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、组织培养快速繁殖铁皮石斛。

一、培养基配制和灭菌

初代培养基用于基础苗繁殖：MS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L+IAA0.25 mg/L+NAA0.5mg/L+矮壮素0.1mg/L

继代培养基用于一步成苗批量化生产：MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.3 mg/L+NAA0.4mg/L+矮壮素0.6mg/L。

以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

二、基础苗繁殖

取铁皮石斛0.5cm长带顶芽的茎段，首先用洗衣粉清洗干净，在无菌操 作台上用无菌水洗5～7次，用70％酒精浸润1分钟，再放入0.1％的升汞溶液 中灭菌8～12分钟，无菌水冲洗5～6次，将顶芽和腋芽转入装有初代培养 基上，每瓶外植体个数为2～3个，在下述培养条件下进行培养：24℃左右， 每天10小时光照，光照强度为1000～2000lx左右；顶芽接种30个，腋芽接 种50个。培养8周左右，获125个原球茎。基础苗繁殖时，将原球茎转入初 代培养基中，每隔45d左右增殖一次，每次继代中，原球茎增殖倍数平均 为30，最高达42。同步诱导原球茎和芽生长情况，如图1所示。根据生产规 模，繁殖充足的基础苗，再进行批量化生产。

三、一步成苗批量化生产

取上述125个株系中的10000个株系原球茎进行批量化生产，具体方法如 下：将步骤二获得的原球茎如图2所示，直接转入一步成苗培养基中进行培 养，如图3所示，培养条件同步骤二；培养35-45d后，每个原球茎同时从 基部分化小芽，逐渐长成2-6cm高的健壮丛芽，而且从基部长出5-10条根的 完整植株。同步增殖分化壮苗和生根的试管苗生长情况如图4、图5所示。

四、试管苗移栽：

试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的瓶苗，放置室外炼苗5-7d，随后取 出清洗根部培养基，将幼苗移栽至栽培基质中，在温度为20～28℃，空气 湿度80～90％的条件下生长，30～40d长出新叶时，既已成活,如图6所示。

本发明所提供的铁皮石斛组织培养繁殖方法，顶芽或茎段为外植体，取 材容易，数量大，遗传稳定性高，生长良好等优势。在初代培养过程中， 同步诱导原球茎和芽，繁殖系数大。批量化生产阶段，采用四步合一的铁 皮石斛培养方法，简化了健康种苗生产程序。以生产10000L铁皮石斛培养 基为例，如每升添加100g香蕉，需添加1000kg香蕉，单价为7.0元/kg，增 加了7000元的成本；如每升添加1g脯氨酸，需10kg脯氨酸，单价1.8元/g， 增加了18000元的成本；每升添加100毫升椰子汁，需1000000ml椰子汁，单 价为0.015元/ml，增加了15000元的成本。本发明采用矮壮素为壮苗剂，配 置10000L培养基，仅需5-10g矮壮素，价格极其便宜，成本可忽略不计。本 发明不仅减少了无菌操作步骤，而且节约了培养室空间，简化了健康种苗 生产程序，降低了生产成本，提高了生产效率。本发明技术已成功应用到 大规模生产中，且获得非常好的应用效果，如图7、图8、图9所示。

实施例2、组织培养快速繁殖盾叶薯蓣

一、培养基配制和灭菌

二、初代培养基：MS+6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+IAA0.3mg/L+NAA0.4 mg/L+矮壮素0.3mg/L；

三、继代培养基：MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L+NAA0.6mg/L+矮壮素 0.9mg/L

以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

取铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)顶芽或茎段，基 本操作方法同实施例1一致；效果与实施例1相差不大。