一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法及其应用。膜的制备包括：壳聚糖、聚乙烯醇、硅胶进行混合制得壳聚糖-聚乙烯醇膜；利用氢氧化钠溶液处理制孔；将其加入至环氧氯丙烷与氢氧化钠中，得到网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联膜；将其浸入至含有亚氨基二乙酸的碳酸钠溶液中；再将晾干后的膜浸入至含有二价金属离子的溶液中，即可得到螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜，其具有较强的机械强度，并对含组氨酸的蛋白质具有高效的亲和吸附能力。其应用于富含组氨酸蛋白质或酶的分离，主要包括粗酶液制备、膜对富含组氨酸蛋白质或酶的特异性亲和吸附、吸附蛋白的洗脱、膜的再生四个过程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法及应用，属于新型材料的制备，属于生物化学交叉学科领域。

背景技术

伴随着生命科学与生物工程等相关学科的快速发展，特别是基因工程取得的巨大成就，人们可以在细胞中生产出所需要的目标产物，因此对生物产品的分离纯化要求也越来越高。亲和层析是一种蛋白纯化重要方法，它具有很高的选择性和分离性能以较大的载量。亲和层析组要由亲和载体与亲和配基组成。传统的载体与配基价格昂贵，不适用于大规模的生产。壳聚糖来原广泛具有大量的氨基和羟基活性官能团并有较好的成膜性，是一种良好的亲和膜材料。

目前壳聚糖亲和膜存在着物理、化学结构不稳定，机械强度较差的缺点。直接将吸附金属离子的亲和膜用于对富含组氨酸蛋白的吸附时，由于金属离子颗粒较小，密集的附着在亲和膜上。蛋白质属于大分子，与膜上金属离子作用时存在着较大的空间位阻，阻碍了壳聚糖在亲和层析中的应用。

本方法制备了一种大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜，通过加入聚乙烯醇，使得壳聚糖与聚乙烯醇发生物理化学反应形成一种高聚物，增加亲和膜的机械强度，利用环氧氯丙烷作为交联剂，使得链状的壳聚糖聚乙烯醇膜成为网状结构，增加了膜物理化学稳定性能，扩大了亲和膜在各种条件下的使用范围，如在酸性条件下也不溶解。通过在亲和膜上连接亚氨基二乙酸、汽巴蓝染料或三羟甲基乙二胺等不同的螯合剂与间隔臂，有效避免了金属离子泄露，并降低了金属离子与目标蛋白的空间阻力，增大了其对蛋白的吸附能力，并有利于洗脱液将目标蛋白从亲和膜上洗脱。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法，其制备出来的亲和膜具有较强的机械强度，并且与现有制备的膜对组氨酸标记的蛋白吸附能力相比，其优点在于它能避免金属离子的流失，减小了金属离子与目标蛋白之间的空间位阻，增大了其对目标蛋白的吸附量并能有效的把目标蛋白从膜上洗脱下来，同时发挥了螯合金属离子的膜壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜对蛋白的吸附能力，与膜本身的截留效果的协同作用。本发明方法具有一步高效吸附蛋白，操作简便，可重复利用，能耗低，有潜在的工业化应用价值等优点。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法，包括以下步骤：步骤一：浓度为1％-3％的壳聚糖与浓度为3％-9％的聚乙烯醇按体积比1：(2-3)进行混合，并加入硅胶，在50-60℃水浴中反应24-30小时，反应混合溶液倒入制膜模板，得壳聚糖-聚乙烯醇膜；步骤二：利用氢氧化钠溶液对壳聚糖-聚乙烯醇膜浸泡，得到孔径为5-50nm的大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜；步骤三：将大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜加入至环氧氯丙烷与氢氧化钠的混合溶液中，于50-60℃温度下，进行交联反应，得到网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联膜；步骤四：将网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜浸入至含有亚氨基二乙酸、汽巴蓝染料或三羟甲基乙二胺的碳酸钠溶液中，在50-60℃水浴中反应8-12小时后，用水冲洗，并在室温下晾干；再将晾干后的膜浸入至含有二价金属离子的溶液中，进行螯合金属离子，即可得到螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜。

进一步地，所述壳聚糖溶于酸水溶液中，所述聚乙烯醇溶于水中。

进一步地，所述二价金属离子为铜离子、镍离子或钴离子。

进一步地，所述二价金属离子的浓度为0.05-0.1mol/L。

进一步地，所述含有二价金属离子的溶液为CuCl₂溶液或NiCl₂溶液或CoCl₂溶液。

本发明还提供一种的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的应用，所述螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜用于富含组氨酸的蛋白或酶的分离和纯化。

进一步地，所述螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜对富含组氨酸的蛋白或酶进行分离和纯化的步骤如下：步骤一：混合酶液的制备，取浓度为0.2-1mg/ml的富含组氨酸蛋白质的粗蛋白混合液或粗酶液；步骤二：蛋白吸附，取上述混合酶液5mL，分别加入螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜0.1g，调节pH4-8和离子浓度0.1-0.5mol/L，在温度4-25℃对富含组氨酸蛋白或酶特异性吸附1-5小时；步骤三：目标蛋白或酶洗脱，取步骤二中吸附目标蛋白的亲和膜，利用体积为2-10ml浓度为0.05-0.1mol/L咪唑洗脱亲和膜，利用透析方法将蛋白质大分子与咪唑小分子物质分离，得到富含组氨酸的目标蛋白或酶；步骤书四：膜的复性，将步骤三中的亲和膜在5ml浓度为0.1-0.2mol/L的EDTA溶液，温度为25-30℃，浸泡2-3h，用去离子水冲洗2-10次，室温干燥，重新螯合金属离子，吸附目标蛋白，反复进行多次操作，实现膜的循环利用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法，通过上述步骤制备出来的亲和膜具有较强的机械强度，并对含组氨酸的蛋白质具有高效的亲和吸附能力。与现有制备的膜对组氨酸标记的蛋白吸附能力相比，其优点在于它能避免金属离子的流失，减小了金属离子与目标蛋白之间的空间位阻，增大了其对目标蛋白的吸附量并能有效的把目标蛋白从膜上洗脱下来，同时发挥了螯合金属离子的膜壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜对蛋白的吸附能力，与膜本身的截留效果的协同作用。本发明方法具有一步高效吸附蛋白，操作简便，可重复利用，能耗低，有潜在的工业化应用价值等优点。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：浓度为1％-3％的壳聚糖与浓度为3％-9％的聚乙烯醇按体积比1：(2-3)进行混合，并同时加入200-300目硅胶2.5％-7.5％，混合均匀，在50-60℃水浴中反应24-30小时，反应混合溶液倒入制膜模板，得壳聚糖-聚乙烯醇膜。其中，所述的浓度为1％-3％的壳聚糖溶于2-5％的乙酸水溶液中，所述的浓度为3％-9％的聚乙烯醇溶于水中。在本较佳实施例中，壳聚糖与聚乙烯醇按体积比1：2至3：8的任一比例进行混合。

步骤二：利用1-3mol/L的氢氧化钠溶液对壳聚糖-聚乙烯醇膜浸泡，浸泡时间为1-3小时，得到孔径为5-50nm的大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜，膜的透水率为1-50ml(cm²·min)。

步骤三：将大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜加入至环氧氯丙烷与氢氧化钠的混合溶液中，于50-60℃温度下，进行交联反应2-3小时，得到网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联膜；其中，环氧氯丙烷的含量为10％-20％。通过红外光谱可知壳聚糖-聚乙烯醇膜中可能含有-O-H缔合、-C-H、-C-O-、R-NO₂和-C-N-等官能团，通过环氧氯丙烷交联后-O-H-自由向-O-H缔合转变，–C-H键变小R-NO₂，-C-N键变弱。使得单个壳聚糖-聚乙烯醇成为网状结构，稳定性能增加，使得其机械强度较高。

步骤四：将网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜浸入至含有亚氨基二乙酸、汽巴蓝染料或三羟甲基乙二胺的碳酸钠溶液中，在50-60℃水浴中反应8-12小时后，用水冲洗，并在室温下晾干；再将晾干后的膜浸入至含有二价金属离子的溶液中，持续2-3小时，进行螯合金属离子，即可得到螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜。所述二价金属离子为铜离子、镍离子或钴离子，所述二价金属离子的浓度为0.05-0.1mol/L，在本较佳实施例中，所述含有二价金属离子的溶液为CuCl₂溶液或NiCl₂溶液或CoCl₂溶液。

进一步地，在步骤四中，碳酸钠的浓度为1-3mol/L，亚氨基二乙酸和汽巴蓝染料的浓度为0.1-1mol/L；或者，碳酸钠的浓度为1-3mol/L，三羟甲基乙二胺的含量为5％-10％。

大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜连接亚氨基二乙酸，螯合铜离子，纯化组氨酸标记的蛋白质的示意结构如下：

本发明的具体的实验组如下：

本发明还提供一种的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的应用，本发明的制备方法制备的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜可用于分离和纯化富含组氨酸的蛋白质或酶，其主要过程为：

(1)蛋白溶液或粗酶液的制备

取浓度为0.2-1mg/ml的富含组氨酸蛋白质的粗蛋白混合液或粗酶液(如浓度0.2-1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)或浓度为0.5-1.3mg/ml的重组丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)粗酶液或浓度为0.4-0.8mg/ml的重组pfu粗酶液或0.2-1.5mol/L海因酶或0.2-1mol/L免疫球蛋白或0.2-1mol/L重组青霉素酰化酶，不限于所列粗酶液)。

BSA表面含有17个组氨酸残基，铜离子可以与暴露在BSA表面的组氨酸残基相互作用，铜离子有6个配位点，其中3个点与IDA结合，另外3个点可以与BSA结合。重组SHMT、重组pfu粗酶、重组青霉素酰化酶均含有组氨酸标记。溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。海因酶是一类金属依赖性酶，活性中心主要结合二价阳离子离子，为活性所必须；免疫球蛋白即免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)。

(2)蛋白吸附

取(1)中的混合酶液各5ml，分别加入螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜0.1-1g，调节pH＝4-8，温度为4-25℃，离子浓度为0.1-0.5mol/L，吸附1-5小时。

(3)蛋白洗脱

取(2)中吸附目标蛋白的亲和膜，利用体积为2-10ml，浓度为0.05-0.1mol/L咪唑洗脱亲和膜，利用透析方法将蛋白质大分子与咪唑小分子物质分离，得到富含组氨酸的目标蛋白或酶；

(4)膜的复性

将(3)中的亲和膜在5ml浓度为0.1-0.2mol/L的EDTA溶液，温度为25-30℃，浸泡2-3h。用去离子水冲洗2-10次，室温干燥，重新螯合金属离子，吸附目标蛋白，反复进行多次操作，实现膜的循环利用。

具体实施例如下：

上述实验的结果表明，制备的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜连接亚氨基二乙酸(IDA)、汽巴蓝染料(Cibacronblue3GA)、三羟甲基乙二胺(TED)能够有效地螯合金属离子，避免了金属离子的流失。对组氨酸标记的蛋白有较大的吸附量，在蛋白质的分离中具有较大的应用前景。

综上所述，本发明提供的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法，通过上述步骤制备出来的亲和膜具有较强的机械强度，并且与现有制备的膜对组氨酸标记的蛋白吸附能力相比，其优点在于它能避免金属离子的流失，减小了金属离子与目标蛋白之间的空间位阻，增大了其对目标蛋白的吸附量并能有效的把目标蛋白从膜上洗脱下来，同时发挥了亲和膜对蛋白的吸附能力与膜本身的截留效果的协同作用。本发明方法具有一步高效吸附蛋白，操作简便，可重复利用，能耗低，有潜在的工业化应用价值等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。