检测呋喃唑酮代谢物的单抗、ELISA方法及试剂盒

摘要

本发明属于兽药残留分析和免疫分析技术领域,具体涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的单抗，ELISA方法及试剂盒。本发明主要包括半抗原、免疫原和包被原的合成，单克隆抗体的制备以及ELISA方法的建立。本发明的试剂盒主要由抗呋喃唑酮代谢物AOZ的单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、包被有与AOZ单克隆抗体特异性结合的包被原的酶标板组成。本发明的酶联免疫试剂盒灵敏度好，性价比高，适用于水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留检测。

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种检测呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体(单抗)，ELISA(酶联免疫)方法及试剂盒。

背景技术

呋喃唑酮属于硝基呋喃类药物，因其内服后难吸收，肠中浓度高而血中浓度低，故适用于各种肠道感染的治疗。该类药物对畜禽有一定毒性，大剂量或长期连续使用，易出现毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、兴奋、惊厥、瘫痪等，中毒严重时可引起动物死亡。呋喃唑酮在体内代谢迅速，其代谢产物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)能与蛋白质结合，形成比原药化合物更稳定的蛋白结合物。这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。

为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。在最初的时候多数国家对呋喃唑酮的监控是通过检测原形药物的残留，由于原形药物的不稳定性和检测监控的困难，研究员开始着手研究和寻找能够代替原形药物进行检测的残留标示物。2000年，欧委会提出了要要发展两种不同类型的筛选试验和一种确证试验来提高欧盟各药残实验室的检测和监控能力。于是，酶联免疫吸附试验(ELISA)方法诞生，并以其高通量、高灵敏度、低检测限、操作简单、耗费少的诸多优点被普及到残留检测的筛选工作。

2004年，Cooper等设计出AOZ半抗原，得到第一株多克隆抗体，采用直接ELISA方法对衍生物进行特异性检测，最低检测限为0.1μg/kg，定量限0.4μg/kg。2005年，Diblikova等用相同的半抗原免疫小鼠，获得AOZ特异性单克隆抗体，用于动物组织中AOZ残留的检测，检测限为0.3μg/kg，与LC-MS/MS对AOZ的检测结果有高度相关性。2008年，常超等对鱼、猪、鸡组织用苯甲醛作为衍生介质，将AOZ衍生成为N-苯亚甲基-3-氨基-2-噁唑烷酮，用间接ELISA方法进行检测，用磷酸盐缓冲液做标准曲线进行回归分析，得到组织检测限均小于0.5μg/kg。

呋喃唑酮残留检测的仪器方法日臻成熟，LC-MS/MS的应用大大提高了检测灵敏度，通常将其作为确证手段。ELISA试剂盒基于抗原抗体的特异性结合反应，具有常规理化分析技术无可比拟的高选择性和高灵敏度等特点，非常适于基质复杂、痕量残留的分析，是理想的残留筛选分析方法之一，是目前世界各国推行并实施的高通量筛选方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能识别呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体，利用该单克隆抗体，建立一种能呋喃唑酮代谢物(AOZ)残留检测的ELISA(酶联免疫方法)及试剂盒与应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过制备，得到一种能够识别呋喃唑酮代谢物(AOZ)的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO：C2015129的杂交瘤细胞株SC20150701A所分泌的，该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株SC20150701A，于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：C2015129。

进一步，本发明提出了一种适用于呋喃唑酮代谢物(AOZ)残留检测的酶联免疫方法(ELISA)，该方法包括半抗原、免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤，本发明的具体步骤如下所述：

⑴将呋喃唑酮代谢物(AOZ)进行衍生制备得到半抗原CNPAOZ和CPAOZ；

⑵将半抗原CNPAOZ与血蓝蛋白(KLH购于sigma公司)偶联得到免疫原；

⑶将半抗原CPAOZ与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被原；

⑷利用步骤⑵所述的免疫原制备能分泌识别呋喃唑酮代谢物的单克隆抗体的抗AOZ杂交瘤细胞SC20150701A；

⑸用步骤(3)的包被原包被固相载体(即，酶标板)；

⑹将待检的样品前进行处理后得到待测物并进行酶联免疫检测。

基于上述检测方法，本发明提供了一种包含保藏号为CCTCCNO：C2015129的抗AOZ杂交瘤细胞SC20150701A所分泌的单克隆抗体的ELISA试剂盒。

所述的试剂盒是检测水产品中呋喃唑酮代谢物的ELISA试剂盒。

发明人以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂，对酶联免疫方法进行了验证，实现了本发明的目的，从而完成了本发明。

本发明制备的单克隆抗体可在制备检测水产品中呋喃唑酮代谢物的ELISA试剂盒中应用。

本发明制备的的杂交瘤细胞SC20150701A可在制备检测水产品中呋喃唑酮代谢物的ELISA试剂盒中应用。

本发明制备的试剂盒可在检测水产品中呋喃唑酮代谢物残留分析中应用。

本发明的主要优点是：

(1)本发明制备的单克隆抗体亲和力高，特异性强。

(2)本发明建立的酶联免疫方法(ELISA)简便，易操作，而且灵敏度高，准确度和精密度好。

更详细的技术方案如实施例所述。

附图说明

图1：本发明制备的CNPAOZ–KLH免疫原的紫外扫描图谱。

图2：本发明制备的CPAOZ–BSA包被原的紫外扫描图谱。

图3：以AOZ为标准品建立的间接竞争ELISA反应标准曲线图，附图标记说明：X轴为AOZ标准溶液浓度对数值，Y轴为AOZ标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B₀)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1免疫原和包被原的制备

取1g呋喃唑酮代谢物(AOZ)、1.65g5-羟基-2硝基-苯甲醛，用无水乙醇使之溶解，室温下搅拌反应5h，4℃冰箱静置过夜，过滤，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入100mg的NaOH，缓慢滴加4-溴丁酸乙酯600mg；待反应结束后，加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，过滤，滤液蒸干后加入少量的DMF使之溶解之后，加入1NNaOH40mL，室温下搅拌反应2h，将反应液用HCL调pH＝3，过滤，即得半抗原CNPAOZ，其结构式如下所示：

取0.2gAOZ，用2mL左右的甲醇于室温下搅拌使之溶解；取0.15g3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在搅拌下缓慢滴入上述AOZ溶液中，室温下搅拌反应5h，过滤，烘干滤渣即得CPAOZ，其结构式如下所示：

取半抗原CNPAOZ10mg，二环己基碳二亚胺(DCC)8mg，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)5mg，DMF1mL使之溶解，室温搅拌反应24h，之后离心取上清缓慢滴加到KLH溶液(5mg血蓝蛋白溶解于5mL蒸馏水中)中4℃反应24h。磷酸盐缓冲液(简称PBS，配制方法：准确称取NaCl8.00g，KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O2.90g，KCl0.20g，少量去离子水溶解，定容至1000mL)透析5d即得免疫原CNPAOZ-KLH。

取半抗原CPAOZ8mg，DCC8mg，NHS5mg，DMF1mL使之溶解，室温搅拌反应24h，之后离心取上清缓慢滴加到20mg的牛血清白蛋白(BSA)溶液中于4℃反应24h。用磷酸盐缓冲液透析5d即得包被原CPAOZ-BSA。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1小鼠免疫

以实施例1制备的CNPAOZ-KLH偶联物为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含50μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含50μg免疫原的蛋白乳液加强免疫。从第三次免疫起，每次免疫后第7天采小鼠的尾血，分离血清，用常用的间接ELISA法(参照董国伟和刘贤进，2001报道的方法)检测血清抗体效价。

2.2细胞融合与筛选

在融合前3天给免疫合格的小鼠腹腔注射100μg免疫原CNPAOZ-KLH强化免疫。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合；以1500r/min离心5min，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴；将吸有1mL预温至37℃的50％聚乙二醇(PEG)的lmL刻度吸管插入到管底，缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90sec，用预温至37℃的RPMI–1640基础培养液(购于Hyclone公司)沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀；以1500r/min离心5min，弃去上清，用含有饲养细胞的HAT完全培养基(购于Hyclone公司)轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于CO₂培养箱中培养。根据细胞的生长情况，取细胞培养上清，以发明人制备的CPAOZ-BSA偶联物为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌AOZ抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法克隆化，最终建立得到一株稳定的分泌且能够识别呋喃唑酮代谢物(AOZ)的单克隆抗体的杂交瘤细胞，申请人将该杂交瘤细胞命名为抗AOZ杂交瘤细胞SC20150701A，于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：C2015129。

2.3腹水制备与鉴定

在接种前7天取Balb/c小鼠数只腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用基础培养基悬浮保藏号为CCTCCNO：C2015129的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔。待小鼠腹部明显膨大收集腹水，采用常规的辛酸硫酸铵方法(参照杨利国等，2011报道的方法)纯化获得单克隆抗体。采用单克隆抗体亚型鉴定试纸条确定所得的单克隆抗体为IgG1κ亚型。

实施例3ELISA检测方法的建立

3.1最佳反应条件的确定

通过方阵滴定(结果见表1)，在包被浓度随着抗体的稀释度加大，其OD值下降不明显，说明本发明的包被原与抗体的亲和力不强，这对药物的竞争较有利，这也是本发明选择CPAOZ-BSA作为包被原的一个原因。故最终选择1ppm浓度的包被原CPAOZ-BSA为最佳包被浓度。

表1最佳ELISA反应条件的确定

3.2标准曲线的建立

将AOZ标准品配制成0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/L等6个浓度梯度，每个浓度2个平行孔，做间接竞争ELISA，绘制标准曲线(见图3)，间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：Y＝-0.5330x+0.1820，r²＝0.9996，IC₅₀＝0.26ppb，线性范围是0.05-0.8ppb。

3.3抗体特异性

分别将半抗原CPAOZ、AOZ、衍生试剂2-硝基苯甲醛倍比稀释成梯度浓度，按所建立的间接竞争ELISA方法，测定其IC₅₀值，与NPAOZ标准品(购于sigma公司)IC₅₀值对比得到交叉反应，结果见表2，从表2可以看出本发明制备的杂交瘤细胞SC20150701A对NPAOZ的识别较好，但是对其它药物则不能识别。

表2本发明制备的单克隆抗体特异性测定

竞争物>IC₅₀(μg/L)>交叉反应率(％)>NPAOZ>0.42>100>CPAOZ>＞1000>＜0.1>AOZ>＞1000>＜0.1>2-硝基苯甲醛>＞1000>＜0.1>

实施例4ELISA试剂盒组装

4.1试剂盒所需材料

96孔酶标板1块；AOZ标准液6瓶，浓度分别配制为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/L；AOZ抗体液1瓶；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(购于武汉飞羿有限公司)1瓶；洗涤液(准确称取NaCl8.00g，KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O2.90g，KCl0.20g，少量去离子水溶解，加入Tween200.50mL，定容至1000mL；)(10×浓缩)1瓶；磷酸盐缓冲液((PBS，准确称取NaCl8.00g，KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O2.90g，KCl0.20g，少量去离子水溶解，定容至1000mL；)(10×浓缩)1瓶；底物显色液A(准确称取TMB160mg，四丁基硼氢化氨21mg，加入10ml二甲基乙酰胺溶解混匀)(TMB)1瓶；底物显色液B(准确称取柠檬酸13.70g，柠檬酸三钠10.14g和过氧化氢脲282.00mg，少量超纯水溶解，并定容至1000mL；)过氧化氢脲1瓶；终止液(准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到900mL去离子水中)1瓶。

4.2待检测的水产品样品的处理

称取淡水虾肉(例如克氏原螯虾，清虾等，品种不限)或鱼肉(例如草鱼，鲢鱼，武昌鱼等，品种不限)1±0.01g于50mL塑料离心管中先后加入0.1MHCl2mL、0.01M衍生化试剂(购于sigma公司)0.1mL，用旋涡仪充分涡旋混合1min以使组织分散均匀，37℃恒温箱中恒温孵育16h左右，先后加入1MNaOH0.2mL、乙酸乙酯8mL，用旋涡仪充分涡旋混合1min，4000r/min离心5min。取上清液4mL于5mL塑料离心管中，在60℃左右水浴氮气吹干，分别先后加入正己烷0.5mL、PBS缓冲液0.5mL，涡旋后于4000r/min离心5min，取下清液用于分析检测。

4.3试剂盒测定程序

(1)剪开密封袋，取出酶标板回温至室温。

(2)加AOZ标准液或待测样品：加入试剂盒中提供各浓度的AOZ标准品或按试剂盒说明书中方法处理的检测液50μL到微孔中。

(3)加抗体：加入AOZ抗体工作液(将试剂盒中提供的AOZ抗体液用磷酸盐缓冲液稀释400倍使用)50μL到每一个微孔中充分混合，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG工作液100μL到每一微孔中充分混合，置于湿盒中，在37℃培养箱中孵育30min。

(4)洗涤：倒出孔中的液体，洗涤5次并拍干，每孔中加入底物混合液(准确吸取底物显色液B10mL，加入100μL底物显色液A，混匀；)100μL，充分混合后，置于湿盒中，在37℃培养箱中孵育15～20min；

(5)终止：每孔中加入终止液50μL，在450nm处测量光密度(OD)值。

4.4结果判定

将AOZ标准液或样品液吸光值的平均值(B)除以0标准孔的吸光值(B₀)再乘以100％，即可计算出抑制率。在0.05ppb-0.8ppb范围内，以AOZ标准液的抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。将样品的抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数(采用本试剂盒测定时，要求样品的稀释倍数为4倍)，即为样品中AOZ的实际浓度。计算公式如下：

实施例5本发明试剂盒的灵敏度、精密度和准确度试验

5.1本发明试剂盒的灵敏度试验

根据我国农业部发布的兽药残留酶联免疫试剂盒备案参考评判标准(农医发[2005]17号，2005)中提供的考察检测组织中药物(呋喃唑酮代谢物(AOZ))残留最低检测限的方法，即20份空白样品的测定平均值加3倍标准差法为组织中最低检测限。测定20份虾肉(品种来源见实施例4)和鱼肉(品种来源见实施例4)中呋喃唑酮代谢物(AOZ)的最低检测限为0.06～0.08μg/kg。

5.2本发明试剂盒的精密度

每个浓度的标准品设置5个复孔，重复5次，以标准品抑制率的变异系数为指标，评价本发明检测方法的重复性和精密度，结果显示各浓度的变异系数均<7％(表3)。

表3方本发明ELISA方法的精密度测试

AOZ(μg/L)>0.05>0.1>0.2>0.4>0.8>变异系数(％)>3.67>4.64>4.33>5.72>5.99>

5.3本发明试剂盒的准确度试验

取空白组织样品，按照药物(呋喃唑酮代谢物)在各种组织中的最大残留限量分别进行添加实验，使组织中添加药物(呋喃唑酮代谢物)的浓度为0.1、0.2和0.4μg/kg，每个样品浓度设置5个平行样。然后进行样品处理，用常用的ELISA方法测定药物(呋喃唑酮代谢物)浓度，重复3批，计算回收率，回收率按下面公式计算，并计算批内和批间变异系数。

表4水产品组织中添加回收率测试

本发明将AOZ分别添加到淡水鱼肉(品种来源见实施例4)和淡水虾肉(品种来源见实施例4)中，其添加回收率及批内与批间变异系数测定结果见表4。药物回收率在81.16％～128.73％之间，批内和批间差异均小于25％。