参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子

摘要

本发明提供一个参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子（CmbHLH2），具有SEQ：NO.1所示的核苷酸序列。CmbHLH2与CmMYB6协同在烟草叶片中瞬时过量表达时，可强烈诱导花青苷的积累，使得原本绿色的叶片变成红色。因此，通过转基因的手段，使得CmbHLH2在植物中过量表达，或者抑制菊花植株中CmbHLH2的表达，即可分别获得花青苷合成受到增强或者抑制的转基因植株，其色泽会因花青苷合成的变化而变化。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与花青苷生物合成调控的新型菊花bHLH转录因子CmbHLH2（SEQ：NO.1）。

背景技术

菊花是世界重要花卉之一，为仅次于玫瑰的世界第二大切花。菊花亦是我国传统名花，具有悠久的历史和深厚的文化积淀。至今，我国研究者已自主培育了近250个切花菊品种，其中单头切花大菊占切花产量总数的一半左右。花色是菊花重要的观赏性状之一，单头切花大菊的花色多以原始色系黄、白为主，除此黄、白色系之外，我国自主培育的菊花品种还有绿、青、粉红、红、紫和间色等其他色系。分析紫红粉色系菊花的呈色机制，是培育多色系菊花重要的理论基础，有助于改善切花菊文化的发扬及其产业的多元化。

花青苷是众多紫红粉色系菊花品种的主要呈色色素，其积累量越高花色越偏红紫色。花青苷，又名花色素苷，属黄酮类化合物，由花青素和糖基结合而成。花青苷在植物体内的生物合成起始于苯丙氨酸途径，由多个酶参与催化，而编码这些酶的基因在转录水平上则受到MYB、bHLH和WD40转录因子形成的MBW转录复合体的协同调控。在这三类转录因子中，尽管MYB转录因子对花青苷的生物合成调控具有较高的特异性，然而bHLH转录因子的协同作用亦不容忽视。

bHLH是植物中第2大转录因子家族，其基因序列中拥有保守的bHLH结构域，由约60个氨基酸组成。典型的bHLH结构域的N端包含13~17个亲水的碱性氨基酸残基，其后连接被任意长度的环一分为二的α螺旋（HLH，helix-loop-helix）。在bHLH结构域的碱性氨基酸序列中，HER（His5-Glu9-Arg13）基序具有高度的保守性，可结合启动子序列中的六核苷酸E-box基序（CANNTG），进而调控靶基因转录。bHLH可参与植物心皮、花药和表皮细胞的发育，光敏色素信号转导，植物激素信号转导和逆境响应，黄酮类化合物的生物合成调控等生命进程。参与植物花青苷生物合成调控的bHLH成员，已在众多植物体内得到鉴定，然而菊花中参与花青苷生物合成转录调控的bHLH成员至今未见报道，极大地限制了菊花花色品质改良育种及其产业多元化的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一个参与花青苷生物合成调控的新型菊花bHLH转录因子（CmbHLH2），具有SEQ：NO.1的核苷酸序列，其编码序列全长为1842个核苷酸，可编码一个含614氨基酸的蛋白。CmbHLH2氨基酸序列中含有碱性螺旋-环-螺旋结构域，且在碱性结构域内含有高度保守的HER（His5-Glu9-Arg13）基序，可结合启动子序列中六核苷酸E-box基序（CANNTG）；在其氨基酸序列的C端分布着MIR结构域，可与MYB转录因子相互作用。

本发明提供的菊花bHLH转录因子（CmbHLH2）在红色菊花品种中的基因表达最高，粉色次之，黄色品种中最低。CmbHLH2的这一表达模式与不同菊花品种积累花青苷的能力呈显著正向相关。CmbHLH2可与CmMYB6相互作用形成转录蛋白复合体，结合花青苷合成关键基因CmDFR启动子并增强其表达活性，进而诱导花青苷的积累。

本发明的另一个目的是提供菊花bHLH转录因子在改变植物色泽中的应用。CmbHLH2与CmMYB6协同在烟草叶片中瞬时过量表达时，可强烈诱导花青苷的积累，使得原本绿色的叶片变成红色。因此，通过转基因的手段，使得CmbHLH2在植物中过量表达，或者抑制菊花植株中CmbHLH2的表达，即可分别获得花青苷合成受到增强或者抑制的转基因植株，其色泽会因花青苷合成的变化而变化。

CmbHLH2（SEQ：NO.1）是菊花中首例克隆并经过功能鉴定的可调控花青苷生物合成，进而修饰植株色泽的bHLH成员。

本发明以三种不同花色的菊花品种Z1（红色），Z2（粉色）和Z3（黄色）为试材，应用RACE、实时定量PCR、酵母双杂交、瞬时表达等生物学技术，分离鉴定出参与菊花花青苷生物合成调控的bHLH成员CmbHLH2（SEQ：NO.1）。研究发现，CmbHLH2的基因表达与菊花花色中红色程度呈良好正向相关，即越红的菊花品种中，CmbHLH2的表达量越高；CmbHLH2可与CmMYB6相互作用形成转录蛋白复合体，增强菊花花青苷生物合成关键基因CmDFR启动子活性，进而显著诱导烟草叶片花青苷的积累。

附图说明

图1菊花2个bHLH基因在不同菊花品种中的表达模式分析。

图2菊花2个bHLH基因对花青苷合成基因CmDFR启动子的调控效应分析。

图3菊花2个bHLH与CmMYB6转录蛋白质间的相互作用分析。

图4CmbHLH2（SEQ：NO.1）诱导花青苷生物合成功能的鉴定。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）。

实施例1：菊花CmbHLH2基因克隆

依据菊花RNA-Seq数据库信息，筛选出可能参与菊花花青苷生物合成调控的bHLH转录因子CmbHLH2部分序列（SEQ：NO.2）。应用基因特异引物2（GSP2）SEQ：NO.3，以及巢式基因特异引物2（NGSP2）SEQ：NO.4，利用3'cDNA末端快速扩增（3'RACE）技术获得CmbHLH2的3'非编码区（3'UTR）序列（SEQ：NO.5）。进而应用基因特异引物1（GSP1）SEQ：NO.6，以及巢式基因特异引物1（NGSP1）SEQ：NO.7，利用5'cDNA末端快速扩增（5'RACE）技术获得CmbHLH2的5'非编码区（5'UTR）序列（SEQ：NO.8）。根据所得的3'和5'UTR拼接得到自起始密码子（ATG）至终止密码子的CmbHLH2（SEQ：NO.1）的全长序列。

RACE中第一轮PCR程序为94^oC5min；94^oC10s，72^oC2min30s，5个循环；94^oC10s，70^oC30s，72^oC2min30s，5个循环；94^oC10s，67^oC30s，72^oC2min30s，30个循环；72^oC10min，16^oChold。第二轮PCR程序为94^oC5min；94^oC10s，65^oC30s，72^oC2min30s，30个循环；72^oC10min，16^oChold。

RACE第一轮PCR体系为10×Ex-Buffer2μL，2.5mmol/LdNTPs1.6μL，10μmol/LGSP1或GSP20.5μL，下游引物UPM2μL，Ex-Taq0.1μL，cDNA0.5μL，加灭菌双蒸水至20μL。第二轮PCR体系为10×Ex-Buffer2μL，2.5mmol/LdNTPs1.6μL，10μmol/LNGSP1或NGSP20.5μL，下游引物NUP2μL，Ex-Taq0.1μL，稀释10倍的第一轮PCR产物1μL，加灭菌的双蒸水至20μL。

根据3'和5'UTR拼接得到自起始密码子（ATG）至终止密码子的CmbHLH2（SEQ：NO.1）的全长序列。为更加明确阐述本发明的内容，文中还应用了CmbHLH1（GenBankKC686698）和CmMYB6（GenBankKR002097）两个基因，其序列均来自已有的报道。

实施例2：菊花CmbHLH2基因表达模式分析

（一）实验方法

利用PrimerPremier5，依据CmbHLH1（SEQ：NO.9）和CmbHLH2（SEQ：NO.5）的3'UTR序列分别设计实时定量PCR（QPCR）引物组合SEQ：NO.10和SEQ：NO.11以及SEQ：NO.12和SEQ：NO.13，PCR产物包含终止密码子，长度分别为201bp和192bp。以菊花actin基因（SEQ：NO.14）的表达为内参分析CmbHLH1和CmbHLH2的表达模式，其QPCR引物组合为SEQ：NO.15和SEQ：NO.16。所有QPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。

分别提取三种不同花色的菊花品种的花瓣RNA，参照cDNA合成kit（Bio-Rad，USA）说明书，合成cDNA。参照SsofastEvaGreenSupermixkit（Bio-Rad，USA）说明书开展QPCR分析，采用20μL体系：其中10μL2×SsofastEvaGreenSupermix(Bio-Rad，USA)，1.0μL上游引物（10μM），1.0μL下游引物（10μM），2.0μL稀释的cDNA和6.0μLH₂O。QPCR程序为：94^oC，10min；94^oC10s，60^oC30s，45个循环。

（二）实验结果

基因表达分析结果表明，CmbHLH2（SEQ：NO.1）的基因表达与不同花色菊花品种中的花青苷积累呈良好正向相关（附图1），即CmbHLH2在红色菊花品种Z1中表达量最高，在粉色菊花品种Z2中表达量次之，而在黄色菊花品种Z3中不表达。CmbHLH1（SEQ：NO.9）的基因表达虽然也呈相似的趋势，但是相关性弱于CmbHLH2（附图1）。

实施例3：调控靶基因活性分析

（一）实验方法

应用引物组合应用引物组合SEQ：NO.17和SEQ：NO.18、SEQ：NO.19和SEQ：NO.20以及SEQ：NO.21和SEQ：NO.22，分别扩增CmbHLH1（SEQ：NO.9）、CmbHLH2（SEQ：NO.1）和CmMYB6（SEQ：NO.23）的全长序列。扩增时选用FastStartHighFidelityPCRsystem（Roche），PCR体系为Buffer（withMgcl₂）2μL，dNTP（2.5μM）1.6μL，上下游引物（10μM）各2μL，cDNA0.5μL，酶0.5μL，水11.4μL。PCR程序为95^oC2min；95^oC30s，55-72^oC30s，72^oC30s-3min，35个循环；72^oC6min，16^oChold。PCR产物分别经过限制性内切酶组合NotI和SpeI、SalI和ApaI、NotI和SpeI的消化后，搭载到pGreenII002962-SK表达载体上，重组成表达载体CmbHLH1-SK、CmbHLH2-SK和CmMYB6-SK。将最终确认正确构建的表达载体电转化入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，挑选3个阳性克隆，用25%灭菌甘油保存，放于-80^oC。

将存放于-80^oC的甘油菌划线接种于含25μg/ml庆大霉素、5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28^oC培养48h，刮取少量菌落涂布到新的相同LB固体培养基上，28^oC培养12h。刮取生长良好的菌落，用渗透液（10mMMES，10mMMgCl₂，150mM乙酰丁香酮，pH5.6）悬浮，将其OD₆₀₀调整为0.75左右。

利用双荧光素酶系统，分析不同转录因子与菊花花青苷合成基因CmDFR启动子间是否存在调控效应。将含有不同重组表达载体的农杆菌按照两种方案进行组合处理，将含有pGreenII002962-SK、CmbHLH1-SK、CmbHLH2-SK或CmMYB6-SK的农杆菌菌株分别与含有CmDFR-LUC的农杆菌菌株按照10:1比例混合；将含有CmbHLH1-SK或CmbHLH2-SK的农杆菌菌株分别与含有CmMYB6-SK或pGreenII002962-SK的农杆菌菌株按照1:1比例混合，再按照10:1比例与含有CmDFR-LUC的农杆菌菌株混合。农杆菌菌株混合后，分别注射到本氏烟草叶片中，每株烟草注射3片叶片。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。

注射后的烟草于16h：8h光暗周期、25^oC、75%空气湿度的条件下培养3天，应用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem（Promega，USA）和ModulusLuminometer（Promega，USA）检测叶片中两种荧光素酶（LUC和REN）的比值，据此分析转录因子与目标基因启动子之间的调控效应。

（二）实验结果

双荧光素酶瞬时表达分析结果显示，与pGreenII002962-SK表达载体相似，CmbHLH1（SEQ：NO.9）和CmbHLH2（SEQ：NO.1）均无法调控菊花花青苷合成基因CmDFR启动子活性（附图2）。CmMYB6（SEQ：NO.23）可激活CmDFR启动子的效应，当其与CmbHLH2协同表达时，该激活效应得到极显著增强，可强烈增强CmDFR启动子的转录活性至40多倍（附图2），而CmbHLH1并无此功效。这一结果说明，CmbHLH2可与CmMYB6协同作用，参与菊花花青苷的生物合成调控。

实施例4：蛋白质相互作用分析

（一）实验方法

首先构建应用于酵母双杂交（Y2H）系统的重组表达载体CmbHLH1-AD、CmbHLH1-BD、CmbHLH2-AD、CmbHLH2-BD、CmMYB6-AD和CmMYB6-BD，所用引物组合分别为SEQ：NO.24和SEQ：NO.25、SEQ：NO.26和SEQ：NO.27、SEQ：NO.28和SEQ：NO.29、SEQ：NO.30和SEQ：NO.31、SEQ：NO.32和SEQ：NO.33以及SEQ：NO.34和SEQ：NO.35。扩增基因全长时选用FastStartHighFidelityPCRsystem（Roche），PCR体系为Buffer（withMgcl₂）2μL，dNTP（2.5μM）1.6μL，上下游引物（10μM）各2μL，cDNA0.5μL，酶0.5μL，水11.4μL。PCR程序为95^oC2min；95^oC30s，55-72^oC30s，72^oC30s-3min，35个循环；72^oC6min，16^oChold。PCR产物分别经过限制性内切酶组合SacI和XhoI、EcoRI和BamHI、EcoRI和BamHI的消化后，搭载到酵母双杂交（Y2H）表达载体上，构建重组表达载体。

然后参照Y2H系统（Matchmaker^TMGoldYeastTwo-HybridSystem，Clontech，US）说明书，将CmbHLH1-BD、CmbHLH2-BD和CmMYB6-BD分别转化入Y2HGold感受态内，检测其自我激活特性。分析显示，三个转录因子的自我激活特性不同。CmbHLH1和CmbHLH2的自我激活特性较弱，AbA¹⁰⁰和AbA⁴⁰⁰即可分别抑制其自我激活。CmMYB6的自我激活特性则较强，AbA¹⁰⁰⁰亦不可抑制。因此，本发明以CmbHLH1和CmbHLH2为bait，分析两种转录蛋白的相互作用机理。

（二）实验结果

酵母双杂交系统分析结果显示，CmbHLH2（SEQ：NO.1）可与CmMYB6（SEQ：NO.23）相互作用，形成转录蛋白复合体（附图3），而CmbHLH1（SEQ：NO.9）无法与CmMYB6相互作用（附图3）。这一结果说明，CmbHLH2可与CmMYB6协同互作形成转录蛋白复合体，以此增强各自的功效，共同参与CmDFR启动子活性的调控，进而参与菊花花青苷生物合成的调控。

实施例5：诱导花青苷积累分析

（一）实验方法

将分别含pGreenII002962-SK、CmbHLH1-SK、CmbHLH2-SK或CmMYB6-SK的GV3101::pSoup农杆菌菌株按照1:1比例组合成农杆菌混合液，包括：CmbHLH1-SK+pGreenII002962-SK，CmbHLH2-SK+pGreenII002962-SK、CmbHLH1-SK+CmMYB6-SK和CmbHLH2-SK+CmMYB6-SK。选取长势优良普通烟草植株的3片嫩叶，以每片叶片中心叶脉为分界线，用无针头注射器在叶片左侧注射CmbHLH1-SK+pGreenII002962-SK或CmbHLH2-SK+pGreenII002962-SK混合液，右侧注射相应的CmbHLH1-SK+CmMYB6-SK或CmbHLH2-SK+CmMYB6-SK混合液。注射部位为远离叶片中心叶脉的表皮细胞内，每种农杆菌组合注射3株不同的普通烟草植株。烟草于16h：8h光暗周期、25^oC、75%空气湿度的条件下培养8天，观察叶片的注射部位有无花青苷的积累。每个基因的3个阳性克隆各重复一次上述操作，构成3个生物学重复。

（二）实验结果

分析结果显示，注射CmbHLH2-SK+CmMYB6-SK（SEQ：NO.1+SEQ：NO.23）混合农杆菌的烟草叶片表皮细胞内可显著积累花青苷，使得叶片注射部位呈现明显的红色（附图4）。而注射CmbHLH1-SK+CmMYB6-SK（SEQ：NO.9+SEQ：NO.23）混合农杆菌的烟草叶片表皮细胞内无花青苷的积累（附图4）。

本发明利用RACE、实时定量PCR、双荧光素酶系统技术、酵母双杂交系统技术和烟草瞬时表达技术，分离并鉴定出菊花CmbHLH2（SEQ：NO.1）对花青苷生物合成具有转录调控效应，可应用到植物颜色修饰的基因工程中。

<110>浙江大学

<120>参与花青苷生物合成调控的菊花bHLH转录因子

<160>29

<210>1

<211>1842

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>1

ATGGCTGCCAGCGGACCACCTCGTGATTCACTGAAAGAGATGTTGCAATCTGCTGTCCATTCTATTCAATGGACCTACAGTATTTTCTGGCAACTTTGTCCTCAACAAGGGGTTTTGGTATGGGGAGATGGATACTACAATGGATCTATAAAGACGAGGAAGACTGTTCAGTCGATTGAAGTTAGCACTGAGGAGGCTGCTTTAAGTAGAAGCGATCAACTTAGAGAGCTCTATGATTCGTTGGTTGCTGGTGATCACCTGGTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACTATAAGGCGACCATCAATGGCCCTGTCACCAGAAGATCTCACTGAATCCGAGTGGTTTTACCTCATGTGTGTCTCTTTTTCTTTTCTTCCTGGTGCCGGATTGGTTGGAGAGGCATACACGAAGCAGCGACATATATGGCTCACAGGGGCAAACCAAGTCGATAGTAAAGTTTTTACCAGAGCTATTCTTGCTAAGAGTTCAAATATACAGACAGTGTTGTGCATCCCTCTACTAAACGGAGTCATAGAGCTTGGAACGACGGACAAGGTGGAAGAGGCTATTGAACTAGTTCAACATGTAAAACTGTTCTTCATGGCCGGCAATGACAAGCCGATTCTCATACCTCCAAAGCCCGCCCTTTCGGCCCATTCTTCAAACACCACCGTTTCCTCAAATCAGATGACAACTACAATCAAACCTCTCGACAACACATATTCAATGGACAAAGATGATGAGAGCGAAGAAGATGAGGAGGATGAGGAAGAATATGAAGAAGCAGAAGAAGAAAATGTGTCGGGCATTGTGGCAGATACATGTCACTATTCCGATTTTCAAAAACCTAGTCGGGATAAAACTGGAATGGATGCAATTATGGAGGCGAACGAATTATTGCCACTTGATATGTCAGAAGATATTAGATTTGGATCACTAAATGATGATCCCAATCACTTGGACTCTCATTTTAACTTGTTAGCAACGAGCCACGACGATTCATATAGAGCCGAGTCAATCCCCAAATGGTCAGATAATTTGGGGTTCAACGAGCCATCAAGCATTCAACTACAAGTATCAGGTGAATTATCACAAGGGGAGGACACACATTATTCTTACACAGTTTTAACCCTTCTCAACAACCAACTAACTCAACGGTCCAATTTTCGGACACCTTCTCACCAAAACTCCATCCAATCAGCCTTCGCCACGTGGACACCAAATCACCACTTTGCCGCCAAAACCACAAAAACATCCCAACGCATCCTAAAATACATGCTATGCACCGTACCTTATCTCCACTCCACAGTCAGCCCCGGAGACACCTCCACAGTGGGAGGGGCAGCCTCTCGCCATGAGGAGGTCAGCACGAACCATGTCATGGCGGAACGGCGTCGTAGAGAGAAGTTAAACGAGCGTTTCATCACACTCCGGTCACTAGTCCCACTAGTGACCAAAATGGACAAAGCGTCGATACTAGGTGACACGATTGAGTACGTGAAACACTTGCGTAAAAAAGTTGCTGAGCTTGAGGCGCGGGGAAGGTTGCCAGAGAAGAGGAAGATTAGGGTTGTTGAAGGTGGAGGTACGGCGGTGGAGGTTTCGATAATCGAGAGTGATGCGTTGGTGGAGATTGAGTGTGTGTATAGAGAAGGGTTGTTGCTTGACGTGATGAAGAAGTTAAGGGAATTTGGTATCGAGATCGTGACCGTTCAATCCTGTGTCGATGGTGGGATTTGTACGGCTGAGATGAGAGCTAAGGTGAAGGTGAAGGGTATTAGGGGGAAGAAAATTAGCATAATGCAAGTAAAGAAAGGCATCAACCAAATAATATCTCCTTAG

<210>2

<211>377

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>2

ATTCCTGGTGATCACCTGGTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACTATAAGGCGACCATCAATGGCACTGTCACCAGAAGATCTTACTGAATCCGAGTGGTTTTACCTCATGTGTGTCTCTTTTTCTTTTCCTCCTGGTGTCGGATTGGTTGGAGAGGCATACACGAAGCAGCGACATCTATGGCTCACAGGGGCAAACCAAGTCGATAGTAAAGTTTTTACCAAGAGCTATTCTTGCTAAGAGTGCTAATATACAGACAGTGTTGTGCATCCCTCTACTAAACGGAGTCATAGAACTTGGAACAACGGACAAGGTGGAAGAGGCTACTGAATTATTCAACATGTAAAACTGTTCTTCATGGCCGGCAATGACAACCC

<210>3

<211>26

<212>碱基序列

<213>人工序列

<400>3

GTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAAC

<210>4

<211>28

<212>碱基序列

<213>人工序列

<400>4

TGGTGTCGGATTGGTTGGAGAGGCATAC

<210>5

<211>1741

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>5

GTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACTATAAGGCGACCATCAATGGCCCTGTCACCAGAAGATCTCACTGAATCCGAGTGGTTTTACCTCATGTGTGTCTCTTTTTCTTTTCTTCCTGGTGCCGGATTGGTTGGAGAGGCATACACGAAGCAGCGACATATATGGCTCACAGGGGCAAACCAAGTCGATAGTAAAGTTTTTACCAGAGCTATTCTTGCTAAGAGTTCAAATATACAGACAGTGTTGTGCATCCCTCTACTAAACGGAGTCATAGAGCTTGGAACGACGGACAAGGTGGAAGAGGCTATTGAACTAGTTCAACATGTAAAACTGTTCTTCATGGCCGGCAATGACAAGCCGATTCTCATACCTCCAAAGCCCGCCCTTTCGGCCCATTCTTCAAACACCACCGTTTCCTCAAATCAGATGACAACTACAATCAAACCTCTCGACAACACATATTCAATGGACAAAGATGATGAGAGCGAAGAAGATGAGGAGGATGAGGAAGAATATGAAGAAGCAGAAGAAGAAAATGTGTCGGGCATTGTGGCAGATACATGTCACTATTCCGATTTTCAAAAACCTAGTCGGGATAAAACTGGAATGGATGCAATTATGGAGGCGAACGAATTATTGCCACTTGATATGTCAGAAGATATTAGATTTGGATCACTAAATGATGATCCCAATCACTTGGACTCTCATTTTAACTTGTTAGCAACGAGCCACGACGATTCATATAGAGCCGAGTCAATCCCCAAATGGTCAGATAATTTGGGGTTCAACGAGCCATCAAGCATTCAACTACAAGTATCAGGTGAATTATCACAAGGGGAGGACACACATTATTCTTACACAGTTTTAACCCTTCTCAACAACCAACTAACTCAACGGTCCAATTTTCGGACACCTTCTCACCAAAACTCCATCCAATCAGCCTTCGCCACGTGGACACCAAATCACCACTTTGCCGCCAAAACCACAAAAACATCCCAACGCATCCTAAAATACATGCTATGCACCGTACCTTATCTCCACTCCACAGTCAGCCCCGGAGACACCTCCACAGTGGGAGGGGCAGCCTCTCGCCATGAGGAGGTCAGCACGAACCATGTCATGGCGGAACGGCGTCGTAGAGAGAAGTTAAACGAGCGTTTCATCACACTCCGGTCACTAGTCCCACTAGTGACCAAAATGGACAAAGCGTCGATACTAGGTGACACGATTGAGTACGTGAAACACTTGCGTAAAAAAGTTGCTGAGCTTGAGGCGCGGGGAAGGTTGCCAGAGAAGAGGAAGATTAGGGTTGTTGAAGGTGGAGGTACGGCGGTGGAGGTTTCGATAATCGAGAGTGATGCGTTGGTGGAGATTGAGTGTGTGTATAGAGAAGGGTTGTTGCTTGACGTGATGAAGAAGTTAAGGGAATTTGGTATCGAGATCGTGACCGTTCAATCCTGTGTCGATGGTGGGATTTGTACGGCTGAGATGAGAGCTAAGGTGAAGGTGAAGGGTATTAGGGGGAAGAAAATTAGCATAATGCAAGTAAAGAAAGGCATCAACCAAATAATATCTCCTTAGTAAAAACAGAGTAGAGGGCACATAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATATCGGATTTTTTTTCTCTCTTTGAAATAAGATCATGGTATGTGAAGGACGTTTGAAGAGTAATTAAGAATCATTTTTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

<210>6

<211>28

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>6

GTCGCTGCTTCGTGTATGCCTCTCCAAC

<210>7

<211>28

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>7

TAGTTGCTGCTTGCTGGTTCTCTGTCAC

<210>8

<211>429

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>8

ACATGGGGATCAACAGTCACTCTCATTTTCTTTTGTATAACAAACACAGTCTCAAAATCTCTACTAGCAGGTTTTGACTGAAACTCGCTGGAGATACTTGCTATTCTCGATTGAAGCAGTTGCCTATTTGAAGCTAAGGAGATGGCTGCCAGCGGACCACCTCGTGATTCACTGAAAGAGATGTTGCAATCTGCTGTCCATTCTATTCAATGGACCTACAGTATTTTCTGGCAACTTTGTCCTCAACAAGGGGTTTTGGTATGGGGAGATGGATACTACAATGGATCTATAAAGACGAGGAAGACTGTTCAGTCGATTGAAGTTAGCACTGAGGAGGCTGCTTTAAGTAGAAGCGATCAACTTAGAGAGCTCTATGATTCGTTGGTTGCTGGTGATCACCTGGTGACAGAGAACCAGCAAGCAGCAACT

<210>9

<211>987

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>9

ATTTTACCAAACAGCGTCTTACGAGAACAACAAACGCCACCAACCTACCCGCCACATTTCCACCGGAAAATCTTCAATTTCCGACTATGGTTTCACCGGAGACTACTACTAATTGGATCTACGATTGCACAAGTGCGGAACAAGATGGCTCACTTGCGGATTCAGATGGACGCAAGCAAACTGGTTCAAAAAAGCGGGGGAGGGCTGAACCTAGCAGTGGTACGAGTTCCAAAGCATGCCGAGAAAAATTGAGGAGGGATAAGCTAAACGATAAGTTTGTTGAATTGGCGTCGATCCTTGAACCTGGGAAGCCCCCTAAAATTGACAAGGCTGCTATATTGGTTGATGCCGTGCGGAAGCTTGCTCAGTTAAGAAACGAAGCCCAGAAGCTGAAAAACTCAAATACAGAAATTCAGCAGAATATTAAAGAGATGAAGAATGAGAAGACCAAATTGCGGGATGAAAAGCAGAGGCTAAAGTCTAAGAAAGAGGATCTTGAACAAAAAGTCAAATCAATGAACACCCAACCGAACTTTATGATTCCTCCACCTGGAATCCAGGCTGCATATCCTGCTGCCGTTGCAGCAGCTCAAGGCCAAACAATGGGCAATAAATTTGTTCCTGTCATCAGTTACCCGGGAATGGCAATGTGGCAGTTCCTGCCACCAGCTGCTGTCGACACCTCGCAAGATCACGTGCTTCGCCCTCCTGTTGCCTAATCTGAGCCGAGGAGCTTCCATCTGATGAAGCCATGTCCATGGTTTGCCATTGCGTAATGATTGTGTTAGGTTTCTTTTTATGTAATTTATGGAGTCAGGATATGGTTATATCATACATACCTTTTAACTTATAGCTGTGGTGTATTTACTAAGATCCAACGTCTGTGTAATTGTGTGCTATTGTTCAGTTTATGTTGGGTGTCTCCTTAGAACTTAATATAACCTGCATGGTGTCTCCGTTTAGAAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

<210>10

<211>23

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>10

CCTCCACCTGGAATCCAGGCTGC

<210>11

<211>23

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>11

CAGATGGAAGCTCCTCGGCTCAG

<210>12

<211>24

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>12

GTGAAGGTGAAGGGTATTAGGGGG

<210>13

<211>24

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>13

CTCTTCAAACGTCCTTCACATACC

<210>14

<211>532

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>14

GTTCCCTGGCATTGCTGACAGGATGAGCAAGGAAATCACCGCTCTTGCTCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTCGTTGCACCCCCAGAGAGAAAATACAGTGTCTGGATCGGAGGATCTATCCTTGCATCACTCAGCACCTTCCAACAGATGTGGATCTCCAAGGGTGAATACGACGAGTCTGGCCCATCCATTGTTCACAGGAAGTGCTTCTAAGTATGGATTTTGTTGCTTTTGAAGATTGAATTTCTTTTGGTTTTTGGTTTTTTTTATTGCCTTTCTTTTTCGTGTTATGTTTCATGTGAACTAAGTAAGGCTGGCAGACGTTGGGCCATGGGGAAAGTGAAGGGGATTAACACCACGTTCATCTCTTAATCCATCACTCTGCTCTACCCCATTTGTCGATTGTTGCCAGAGATGTTTGTAGTTGGAGAGTGGTTGTGATGTCTTATTATGAATTCAAACTGTCGGTCTTTTTTTAATCCGTTTGTTGGCAATAATTATGTCAATGTCTACTGTATCAGAAATTATCTT

<210>15

<211>20

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>15

CACCCCCAGAGAGAAAATAC

<210>16

<211>20

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>16

ATCTGTTGGAAGGTGCTGAG

<210>17

<211>23

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>17

ATGGTTTCACCGGAGACTACTAC

<210>18

<211>24

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>18

TTAGGCAACAGGAGGGCGAAGCAC

<210>19

<211>38

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>19

ATCGATACCGTCGACATGGCTGCCAGCGGACCACCTCG

<210>20

<211>39

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>20

ATTGGTACCGGGCCCCTAAGGAGATATTATTTGGTTGAT

<210>21

<211>35

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>21

ATGCGGCCGCATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGAC

<210>22

<211>33

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>22

ATACTAGTGGATTGCAATATCATAGTTGGTCCG

<210>23

<211>765

<212>DNA序列

<213>菊花（Chrysanthemummorifolium）

<400>23

ATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGACCGAGTAGTAGTACAGGTTTAAGGTTGAAGAAAGGTGCATGGACTCCCAAAGAGGACATGCTTCTCAGGAACTGTATTCAGAAACATGGCGAAGGCAAATGGCATCTAATTCCTCTTAAAGCCGGTTTAAGCCGATGTAGGAAGAGTTGTAGGTTGCGATGGTTAAATTATCTAAGGCCAAATATAAAGAAAGGAGATTTTGAAGAAGATGAGATTGATCTCATTCTAAGGCTTCACAAGCTTCTAGGCAACAGATGGTCACTGATTGCTGGGAGAATACCAGGAAGAACTGCGAATGACGTGAAGAACTACTGGAACACACATATTCGCCCACGGTCCAACAAACAAGATAATGAAGCTAAAGACATTACCACGGCCGTCACAGTTATTAAGCCTCAACCACGGATCTTGTCTAAAACCGTAAATTCTAACCCACCCATTGCAGCTCCTCAAGACTATAACCTAGTAAGGTCAACACATGATGGTGTCGAAACTGCCTTTGATATATCCTCAGGGTATATCTCGTCACCCATCGTATCAGATGCCAAGATTGACAAGTATTTGGTTGAGTTATTTGACAATGAGGATAAGGAATTTGACGGCGAAATAGGGTGGTCATTAGATGGTTGTCCATTCCAAGGGGAGGCTTTAGATGCGGAGCAAGAAGATGGTGAAAGCAGTGTGTTTGATTTGCCCATAGACGAGTTCATGTGGGACTTTTTAAATTCGGACCAACTATGA

<210>24

<211>31

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>24

ATGAGCTCATGGGAAGAGCACCGTGTTGCCA

<210>25

<211>31

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>25

ATCTCGAGTTAAGAAAGAAGCCATGCATCTG

<210>26

<211>31

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>26

ATGAATTCATGGCTGCCAGCGGACCACCTCG

<210>27

<211>32

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>27

ATGGATCCCTAAGGAGATATTATTTGGTTGAT

<210>28

<211>33

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>28

ATGAATTCATGGGGGAGTACAGAAAAATGAGAC

<210>29

<211>33

<212>碱基序列

<213>人工合成

<400>29

ATGGATCCGGATTGCAATATCATAGTTGGTCCG