声明
缩略词说明
1 前言
1.1 花青苷的结构与功能
1.1.1花青苷的结构
1.1.2 花青苷的功能
1.2花青苷的生物合成途径
1.2.1花青苷的合成
1.2.2花青苷合成中的结构基因
1.3影响花青苷合成的环境因子及激素
1.3.1温度对花青苷的影响
1.3.2光照对花青苷的影响
1.3.3激素对花青苷的影响
1.3.3糖对花青苷的影响
1.4影响花青苷合成的调控因子
1.4.1 MBW复合体参与花青苷合成的研究
1.4.2 MYB转录因子
1.4.3 bHLH转录因子
1.4.4 WD40转录因子
1.4.5 其他转录因子
1.5 本研究的目的及意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 植物材料、菌株和载体
2.1.2药品和试剂盒
2.1.3 培养基
2.2 试验方法
2.2.2 果肉蔗糖，葡萄糖和果糖含量的测定
2.2.3 UDP-glucose和UDP-galactose含量的测定
2.2.4 基因组DNA的提取
2.2.5 总RNA的提取
2.2.6反转录合成cDNA
2.2.7实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验
2.2.8 基因克隆
2.2.9胶回收产物
2.2.10 连接克隆载体（pEASY Blunting Zero）
2.2.11 转化大肠杆菌感受态（DH5α）
2.2.12 菌落PCR阳性验证与菌液测序
2.2.13 质粒提取
2.2.14 载体和质粒双酶切
2.2.15 连接目的载体
2.2.16 构建目的载体
2.2.17 农杆菌LBA4404感受态的制备及转化
2.2.18 大肠杆菌感受态DE3（BL21）的转化
2.2.19 红肉及‘王林’苹果愈伤组织的转化
2.2.20 ‘王林’苹果愈伤组织原生质体的提取
2.2.21 亚细胞定位
2.2.22 GUS染色及活性测定
2.2.23 酵母转化实验
2.2.24 双荧光素酶互补实验
2.2.25 蛋白相关实验
2.2.26 染色质免疫共沉淀（Chip）实验
2.2.27 数据分析
3 结果与分析
3.1 MdMYB16和MdbHLH33 参与花青苷合成的分析
3.1.1 ‘红脆1-5号’果实成熟期花青苷含量及相关转录因子表达分析
3.1.2参与类黄酮合成相关MYB转录因子进化树及MdMYB16氨基酸序列
3.1.3 MdMYB16 蛋白C端EAR抑制序列和N端bHLH结合基序的敲除
3.1.4 MdMYB16、LESMdMYB16和MdbHLH33在红肉苹果愈伤中的转基因分析
3.1.5 MdMYB16和LESMdMYB16蛋白与MdANS和MdUFGT的启动子的酵母单杂交分析
3.1.6 MdMYB16能够与MdbHLH33互作形成异源二聚体
3.1.7 MdMYB16能够与自身互作形成同源二聚体
3.1.8 MdMYB16、LBSMdMYB6和MdbHLH33在红肉苹果愈伤中的转基因分析
3.2 MdMYB15L与MdbHLH33参与花青苷合成的分析
3.2.1 MdMYB15L进化树及氨基酸序列分析
3.2.2 MdMYB15L蛋白N端bHLH结合基序的敲除
3.2.3 MdMYB15L和LBSMdMYB15L与MdbHLH33蛋白互作分析
3.2.4 MdMYB15L和MdbHLH33参与花青苷合成和冷信号途径分析
3.2.5 MdMYB15L结合MdCBF2的启动子
3.3 MdMYB6调控MdTMT1参与花青苷合成的分析
3.3.1 ‘红脆1号’果实发育期花青苷和可溶性糖含量及相关转录因子的表达分析
3.3.2超表达MdMYB6的红肉愈伤与野生型红肉愈伤的蛋白组相对定量分析
3.3.3 MdMYB6结合MdANS和MdGSTF12的启动子
3.3.4单糖转运蛋白MdTMT1进化树、氨基酸序列和功能分析
3.3.5 MdMYB6激活并绑定MdTMT1启动子
3.3.6 MdMYB6和MdTMT1 参与红肉苹果愈伤花青苷合成分析
4 讨论
4.1 MdMYB16能够通过自身EAR序列直接抑制花青苷的合成
4.2 MdbHLH33能够与MdMYB16互作减弱其对花青苷的抑制作用
4.3 MdMYB15L能与MdbHLH33互作减弱其对花青苷的促进作用
4.4 MdMYB6能够通过调控MdANS和MdGSTF12直接抑制花青苷的积累
4.5 MdMYB6通过调控MdTMT1减少UDP-glu和UDP-gal的含量抑制花青苷的合成
5 结论
参考文献
7 附录
致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
山东农业大学;
