具有L-色氨酸生产力的微生物以及使用所述微生物生产L-色氨酸的方法

摘要

本发明涉及具有增强的L-色氨酸生产力的属于埃希氏菌(Escherichia)属的微生物以及用于生产L-色氨酸的方法，其中所述微生物被转化成表达来自酵母的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶，从而产生高浓度的L-色氨酸；所述方法包括培养所述微生物的步骤。重组大肠杆菌能够以高产率生产L-色氨酸并因此可用于医药和制药工业以及饲料工业，特别是用于动物饲料。

说明书

技术领域

本发明涉及具有增强的L-色氨酸生产力的重组微生物以及使用所述 微生物生产L-色氨酸的方法。

背景技术

L-色氨酸，一种必需氨基酸，已广泛用作饲料和食品添加剂。L-色氨 酸通常通过使用棒状杆菌(Corynebacterium)属、芽孢杆菌(Bacillus) 属或埃希氏菌(Escherichia)属微生物及其变体发酵来生产。L-色氨酸由 用于合成芳香族氨基酸的常见中间体分支酸生物合成。具体地，L-色氨酸 通过由色氨酸操纵子trpEDCBA合成的五种酶作用于分支酸来生物合成， 所述分支酸通过开始于磷酸烯醇丙酮酸和D-赤藓糖-4-磷酸的常见莽草酸 途径产生。首先，邻氨基苯甲酸合酶(TrpE-TrpD复合物)作用于分支 酸以合成邻氨基苯甲酸，然后邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(TrpD) 作用于邻氨基苯甲酸以合成N-(5’-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸。然后，磷 酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(TrpC)和吲哚-3-甘油磷酸合酶(TrpC) 作用于N-(5’-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸以合成吲哚-3-甘油-磷酸，然后色 氨酸合酶(TrpB-TrpA复合物)作用于吲哚-3-甘油-磷酸以合成L-色氨酸 (图1；Bonggaerts等，MetabEng，3，289-300，2001)。

在大肠杆菌(E.coli)中，由trpE和trpD基因之复合物编码的蛋白 质形成邻氨基苯甲酸合酶以合成邻氨基苯甲酸。所合成的邻氨基苯甲酸与 5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)通过由trpD基因编码的邻氨基苯甲酸磷 酸核糖基转移酶反应，从而合成N-(5’-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸。

在本文中，由trpD基因编码的蛋白质与由trpE基因编码的蛋白质组 合充当邻氨基苯甲酸合酶，或者单独充当邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移 酶，并且野生型大肠杆菌菌株保持这两种作用的平衡。

在野生型大肠杆菌菌株中，用作细胞内色氨酸生物合成中的辅因子的 PRPP的浓度为约180μM(Bennett等，NatChemBiol，5，595-599，2009)。 在具有增强的邻氨基苯甲酸生物合成的L-色氨酸生产菌株中，邻氨基苯 甲酸的细胞外累积浓度为最大值，而PRPP的细胞内浓度远低于邻氨基苯 甲酸的浓度。低PRPP浓度充当N-(5’-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸生产中 降低L-色氨酸的总合成速率并提高邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外累积 的限制因素。因此，使用对PRPP具有较高亲和力的邻氨基苯甲酸磷酸核 糖基转移酶使得可防止邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外累积并且提高L- 色氨酸的生物合成速率。

在先前关于L-色氨酸生产菌株改良的报道中，增强生物合成途径并 保持邻氨基苯甲酸合酶和邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性之平衡的 技术尚未被报道。

根据研究，大肠杆菌对PRPP的K_m值为50，而酵母对PRPP的K_m值为约22.4±2.6(Hommel等，EurJBiochem，180，33-40，1989)。因此， 酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶对PRPP的亲和力高于大肠杆菌邻 氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶对PRPP的亲和力。因此，预期使用酵母邻 氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶将对防止邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外 累积以及使具有增强L-色氨酸生物合成途径之微生物中的L-色氨酸生物 合成提高产生更大的作用。

在试图增强大肠杆菌中的分支酸生物合成途径和trp操纵子途径以生 产大量的工业可用L-色氨酸期间，本发明人发现，随着以上两种途径增 强，邻氨基苯甲酸在细胞内和细胞外累积，并因此出现异常培养物。因此， 出于以下期望，本发明人继续进行研究：增强具有增强L-色氨酸生物合 成途径的微生物中邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的表达可以防止邻氨 基苯甲酸的细胞内和细胞外累积并且提高L-色氨酸的生物合成，从而实 现本发明。

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个目的是提供具有增强的L-色氨酸生产力的微生 物，其已被修饰成表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trp4)。

本发明的另一个目的是提供使用上述微生物生产L-色氨酸的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了具有增强的L-色氨酸生产力的埃 希氏菌属微生物，其已被修饰成表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移 酶。

本发明还提供了用于生产L-色氨酸的方法，所述方法包括以下步骤： 培养埃希氏菌属微生物；以及从培养物中回收L-色氨酸。

有益效果

根据本发明的微生物可以以高产率生产L-色氨酸，并因此可以有利 地用于制药工业和饲料工业，特别地用于动物饲料领域。

附图说明

图1是示出了大肠杆菌中L-色氨酸生物合成途径及参与其中的蛋白 质的示意图。

图2示出了酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列同源 性。

图3示出了pCL-P_CJ1-trpD和pCL-P_CJ1-trp4载体。

图4示出了L-色氨酸生产母本菌株与经载体pCL-P_CJ1-trpD或 pCL-P_CJ1-trp4转化的菌株在发酵40小时时的L-色氨酸生产力的比较。

图5示出了L-色氨酸生产母本菌株与经载体pCL-P_CJ1-trpD或 pCL-P_CJ1-trp4转化的菌株在发酵后的色氨酸前体邻氨基苯甲酸累积的比 较。

图6示出了L-色氨酸生产母本菌株与在基因组中插入trp4基因表达 盒的菌株在发酵40小时时的L-色氨酸生产力的比较。

图7示出了L-色氨酸生产母本菌株与在基因组中插入trp4基因表达 盒的菌株在发酵后的邻氨基苯甲酸累积的比较。

具体实施方式

下文中，将详细地描述本发明。

本发明提供了具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏菌属微生物，其 已被修饰成表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶。

邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶是使用邻氨基苯甲酸和PRPP合成 磷酸核糖基邻氨基苯甲酸的酶。在具有增强的L-色氨酸生产力的菌株中， 分支酸合成通过增强的莽草酸途径提高，导致邻氨基苯甲酸提高。提高的 邻氨基苯甲酸在细胞内和细胞外累积，干扰细胞的正常生理学活性，从而 抑制L-色氨酸生产。

因此，本发明旨在通过增强邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的表达来 防止邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外累积，从而增强L-色氨酸的生物合 成。

本文中，本发明旨在通过使用酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶进 一步提高磷酸核糖基邻氨基苯甲酸的合成速率，与由大肠杆菌的trpD基 因编码的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶相比，所述酵母邻氨基苯甲酸磷 酸核糖基转移酶对PRPP具有更高的亲和力。

本发明中使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶来自酵母，并且可以 看出，来自不同种酵母的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶具有87％或更 大的氨基酸序列同源性(图2)。具体地，本发明中使用的邻氨基苯甲酸 磷酸核糖基转移酶具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列。然而，本发明中 使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶不限于此，原因是显示出邻氨基苯 甲酸磷酸核糖基转移酶活性的酶的氨基酸序列根据微生物的物种或菌株 可不同。具体地，本发明中使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶可以是 编码具有以下氨基酸序列的多肽的突变或人工变体，所述氨基酸序列在 SEQIDNO：1的氨基酸序列的一个或更多个位置处包含一个或数个氨基 酸的替换、缺失、插入或添加，或者包含造成变为相似氨基酸的沉默突变， 只要可以保持或增强邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性即可。根据蛋 白质三维结构中氨基酸残基的类型或位置，本文中使用的术语“数个氨基 酸”意指2至20个氨基酸，优选2至10个氨基酸，并且更优选2至5个 氨基酸。此外，基于具有酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的微生物的 个体差异和/或物种差异，氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位可包 括天然突变体或人工变体。

在本发明中，增强酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶可通过用包含 编码酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶之多核苷酸的载体转化或者通 过将所述多核苷酸插入到染色体中来实现。

编码酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的多核苷酸由SEQIDNO： 9表示。可将所述多核苷酸转化到宿主细胞中，为此，可用宿主细胞偏好 的密码子替换该多核苷酸，或者可延长或消除其N端或C端，或者可修 饰其起始密码子以控制表达水平。因此，本发明的多核苷酸可具有编码与 SEQIDNO：1之氨基酸序列具有至少80％、具体为至少90％、更具体为 至少95％，特别具体为至少97％的同源性的蛋白质的多核苷酸序列，只 要其可保持或增强本发明变体的酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的 活性即可。最具体地，本发明的多核苷酸可具有SEQIDNO：9所示多核 苷酸序列。

本文中使用的术语“同源性”是指两个氨基酸序列之间的同一性。同 源性可以使用本领域技术人员公知的方法来确定，例如，计算诸如分数、 同一性或相似性的参数的BLAST2.0。

此外，根据本发明的多核苷酸序列可以是编码酵母邻氨基苯甲酸磷酸 核糖基转移酶的变体，其可在严格条件下与SEQIDNO：9的多核苷酸序 列或来自所述多核苷酸序列的探针杂交并且其正常起作用。

本文中使用的术语“严格条件”意指允许多核苷酸之间的特异性杂交 的条件。这样的严格条件在MolecularCloning，ALaboratoryManual，J. Sambrook等编，第2版，ColdSpringHarborLaboratorypress，Cold SpringHarbor，NewYork，1989或CurrentProtocolsinMolecularBiology， F.M.Ausubel等编，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork中进行了详细描 述，其描述了例如在65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll、0.02％ 聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mMNaH₂PO₄(pH7)、0.5％ SDS、2mMEDTA)中杂交。在本文中，SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠 檬酸钠(pH7)。在杂交之后，将DNA转移至其中的膜在室温下用2×SSC 洗涤，然后在68℃的温度下用0.1至0.5×SSC/0.1×SDS洗涤。

本发明中使用的载体没有具体限制并且可以是本领域已知的任意载 体，只要其可以在宿主中复制即可。常用载体的实例包括天然或重组质粒、 粘粒、病毒和噬菌体。例如，本发明中使用的噬菌体载体或粘粒载体可以 是pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、 Charon4A、Charon21A等，并且本发明中使用的质粒载体可以是pBR 型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。 最优选地，可使用pACYC177、pCL或pCC1BAC载体。

此外，通过包含用于插入到细菌染色体中的多核苷酸的DNA片段可 将编码靶蛋白的新多核苷酸插入到染色体中的特定遗传位点中。将新多核 苷酸插入到染色体中可通过本领域已知的任意方法来实现，例如，通过同 源重组。根据本发明的用于插入到染色体中的多核苷酸还可包含用于确定 多核苷酸是否插入到染色体中的选择标志物，原因是其可通过引起同源重 组插入到染色体中。可使用选择标志物来选择经转化细胞，即确定目标多 核苷酸是否被插入。因此，赋予可选择表型(如抗药性、营养缺陷现象、 细胞毒性剂抗性或表面蛋白质表达)的标志物可用于本发明。在用选择剂 处理的环境中，仅表达选择标志物的细胞存活或者显示出不同表型，并因 此可以选择经转化细胞。

本文中使用的术语“转化”意指将包含编码靶蛋白之多核苷酸的载体 引入到宿主细胞中以便能够在宿主细胞中表达由多核苷酸编码的蛋白质。 经转化的多核苷酸可插入到并位于宿主细胞的染色体中或者位于染色体 之外，只要其可以在宿主细胞中表达即可。此外，所述多核苷酸包括编码 靶蛋白的DNA和RNA。只要所述多核苷酸可以在宿主细胞中引入并且在 其中表达，其可以以任意形式引入。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式 被引入宿主细胞中，所述表达盒是包含自表达所需的所有元件的多核苷酸 构建体。表达盒通常包含与基因的开放阅读框(下文中缩写为“ORF”) 可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。 本发明中使用的启动子没有具体限制并且可以是本领域中已知的任意启 动子，只要其引发编码靶蛋白的多核苷酸在宿主细胞中转录即可。具体地， 可使用T7启动子、trc启动子、tac启动子、CJ1启动子(韩国专利No. 0620092)等。最具体地，可使用trc启动子或CJ1启动子。

表达盒可以是自我复制型表达载体的形式。此外，多核苷酸可自身引 入宿主细胞中并与宿主细胞中表达所必需的序列可操作地连接。

本发明的微生物包括任何原核微生物，只要其可以产生L-色氨酸即 可。例如，其可包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏 菌(Serratia)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、棒状杆菌属或短杆 菌(Brevibacterium)属的微生物。具体地，本发明的微生物是属于埃希 氏菌属的微生物。更具体的，其为大肠杆菌。

为了使本发明的微生物产生L-色氨酸，可进一步增强微生物中选自 以下的至少一种酶的活性：邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢 酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3-脱氢奎 尼酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇 丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)、分支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、 分支酸变位酶和色氨酸合酶(trpAB)；或者可进一步减弱微生物中分支 酸变位酶/预苯酸脱水酶或分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的活性。此外，本 发明的微生物可被修饰为使得由L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制释放一 种或更多种邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油脱氢酶。

在本发明的具体实例中，用包含编码SEQIDNO：1所示酵母邻氨基 苯甲酸磷酸核糖基转移酶的基因(trp4)的载体转化大肠杆菌，将所构建 的菌株命名为CA04-2006，并以登记号KCCM11408P于2013年4月8 日保藏在国际保藏单位韩国微生物保藏中心(韩国首尔西大门区弘济1 洞361-221)。

此外，本发明提供了用于生产L-色氨酸的方法，其包括以下步骤： 培养具有L-色氨酸生产力的埃希氏菌属微生物，其被修饰成表达具有 SEQIDNO：1所示氨基酸序列的酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶； 以及从培养物中回收L-色氨酸。

本发明中的培养过程可在本领域已知的合适培养基中和培养条件下 进行。本领域技术人员根据所选择的菌株类型可容易地改进该培养过程。 培养过程的实例包括但不限于分批培养、连续培养和补料分批培养。

本发明微生物的培养中使用的培养基和培养条件可以是通常用于培 养埃希氏菌属微生物的那些培养基和培养条件中的任意一种，但是这些培 养基和培养条件应适当地满足本发明微生物的要求。

在一个具体实施方案中，本发明微生物可在需氧条件下在包含合适碳 源、氮源、氨基酸、维生素等的常规培养基中培养，同时调整温度、pH 等。

可用于本发明的碳源包括：碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦 芽糖、甘露醇、山梨糖醇；醇和有机酸，如糖醇、甘油、丙酮酸、乳酸和 柠檬酸；以及氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸，但不限于此。此外， 可使用天然有机营养物源，如淀粉水解产物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、 甘蔗渣和玉米浆，但不限于此。具体地，可使用碳水化合物如葡萄糖和无 菌预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，但不限于此。此外，可没有 限制地使用适当量的其他碳源。可用于本发明的氮源包括：无机氮源，如 氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸，如谷氨酸、甲 硫氨酸和谷氨酰胺；以及有机氮源，如蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母 提取物、麦芽提取物、玉米浆、干酪素水解物、鱼粉或其消化产物、脱脂 大豆饼或其消化产物等。这些氮源可单独或组合使用，但是不限于此。所 述培养基可包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及对应的含钠盐作为磷源。所述 培养基可包含无机化合物，所述无机化合物可包括氯化钠、氯化钙、氯化 铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰和碳酸钙，但不限于此。此外，所述培养基 可包含氨基酸、维生素和合适的前体。这些源或前体可以以分批或连续方 式添加到所述培养基中。

化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸可在培养期间以适当 的方式添加到培养基中以调节培养基的pH。此外，在培养期间，可使用 消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫形成。此外，为了使培养基保持为 需氧状态，可向培养基中注入氧或含氧气体。此外，为了使培养基保持为 厌氧或非需氧状态，不注入气体，或者向培养基中注入氮气、氢气或二氧 化碳气。培养基通常保持在27℃至37℃，并且具体为30℃至35℃的温度 下。可持续培养微生物直至获得有用物质的期望水平为止。具体地，培养 期可以是10至100小时。

本发明的方法还可包括纯化或回收培养步骤中产生的L-色氨酸。纯 化或回收过程可通过使用适当方法从培养基中纯化或回收期望的L-色氨 酸来进行，所述适当方法例如分批培养方法、连续培养方法或补料分批培 养方法。

下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，应理解，这些实 施例是举例说明性目的，而并不旨在限制本发明的范围。

实施例1：包含CJ1启动子和大肠杆菌trpD基因或酵母trp4基因的重组载体的构建

1-1：CJ1启动子片段的制备

为了获得包含CJ1启动子的DNA片段，使用包含CJ1启动子的 pECCG117-CJ1质粒(美国专利No.8048648)作为模板进行聚合酶链反 应(下文中缩写为“PCR”)。所述PCR反应使用PCRHL预混合试剂盒 (BIONEER，下文中相同)以及SEQIDNO：2和3的引物在以下条件 下进行：30个循环，各自由94℃下变性30秒、55℃下退火30秒和72℃ 下延伸30秒组成。

在1％琼脂糖凝胶上对PCR产物(下文中称为“P_CJ1片段”)进行电 泳，然后通过洗脱收集具有期望大小的带。

1-2：trpD和trp4基因片段的制备

为了获得trpD基因的ORF，从韩国微生物保藏中心购买了来自野生 型大肠杆菌K-12的W3110菌株；并且为了获得trp4基因的ORF，从美 国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)购买了酵母 菌株(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))。

使用基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)从菌株中制备基因组DNA。 使用大肠杆菌基因组DNA作为模板，使用SEQIDNO：4和5的引物通 过PCR扩增对应于SEQIDNO：6之trpD基因的ORF的DNA片段(1,607 bp)。此外，使用酵母基因组DNA，使用SEQIDNO：7和8的引物通过 PCR扩增对应于SEQIDNO：9之trp4基因的ORF的DNA片段(1,154 bp)。在0.8％琼脂糖凝胶上对PCR产物(下文中分别称为“trpD片段” 和“trp4片段”)进行电泳，然后通过洗脱收集具有期望大小的带。

1-3：重组载体pCL-P_CJ1-trpD和pCL-P_CJ1-trp4的构建

用限制酶EcoRI处理pCL1920载体和实施例1-1中制备的P_CJ1片段， 然后在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用快速DNA连接试剂盒 (ROCHE，下文中相同)经30分钟将各DNA片段连接到载体中，然后 转化到大肠杆菌DH5α细胞中，然后铺板在包含壮观霉素的LB板上，并 选择经转化细胞。

通过铂圈将所选择的细胞接种到20mL包含壮观霉素的LB液体培养 基中并培养过夜，其后使用质粒提取试剂盒(QIAGEN，下文中相同)收 集质粒DNA。重组载体的大小通过用限制酶EcoRI处理来测定(数据未 示出)，并且通过使用SEQIDNO：2和3的引物进行PCR鉴定克隆。将 重组载体命名为“pCL-P_CJ1”。

用限制酶EcoRV和PstI处理pCL-P_CJ1载体和实施例1-2中制备的 trpD片段或trp4片段，然后在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用快速 DNA连接试剂盒(ROCHE，下文中相同)经30分钟将各DNA片段连 接到载体中，然后转化到大肠杆菌DH5α细胞中。以与上述相同的方式选 择经转化细胞，并以与上述相同的方式收集质粒DNA。重组载体的大小 通过用限制酶EcoRI和PstI处理来测定(数据未示出)，并且通过使用 SEQIDNO：2和5的引物进行PCR鉴定克隆。重组载体分别命名为 “pCL-P_CJ1-trpD”和“pCL-P_CJ1-trp4”(图3)。

实施例2：经重组载体pCL-P_CJ1-trpD或pCL-P_CJ1-trp4转化的L-色氨酸生产菌株的构建

使用由EPICENTRE供应的TSS(转化和存储溶液)试剂将实施例 1中构建的pCL-P_CJ1-trpD和pCL-P_CJ1-trp4重组载体各自引入L-色氨酸 生产母体菌株中。

在该实施例中，大肠杆菌KCCM11166P用作L-色氨酸生产母本菌株。 大肠杆菌KCCM11166P是由大肠杆菌KCCM10812P构建的L-色氨酸生 产菌株(韩国专利No.10-0792095)，并且特征在于，染色体tehB基因已 被失活并且NAD激酶的活性提高(韩国专利公开No.10-2012-0083795)。

将一铂圈的L-色氨酸生产母本菌株接种到4mLLB培养基中并培养 3小时，然后离心。将50ngpCL-P_CJ1-trpD载体质粒或pCL-P_CJ1-trp4载 体质粒和100μLTSS试剂添加到所分离的细胞中并与其充分混合。接着， 通过一步转化技术(Chung等，ProcNatlAcadSciUSA，86，2172-2175， 1989)将细胞引入到L-色氨酸生产母本菌株中，将菌株平板接种到包含 壮观霉素的LB板上，并对经转化菌株进行选择。为了确定经转化菌株， 从经转化菌株中分离质粒DNA，用限制酶处理并使其以与实施例1-3中 所述相同的方式进行PCR。经转化菌株分别被命名为 “Con/pCL-P_CJ1-trpD”和“Con/pCL-P_CJ1-trp4”。

实施例3：经转化菌株之间L-色氨酸生产力和生理学活性的比较

使用下表1中示出的色氨酸滴定培养基在Erlenmeyer瓶中培养实施 例2中制备的经转化菌株，并分析其L-色氨酸生产力。

表1：L-色氨酸生产培养基的组成(每升)

组分 含量(g/L) 葡萄糖 60 KH₂PO₄0.3 K₂HPO₄0.6 (NH₄)₂SO₄15 MgSO₄·7H₂O 1 柠檬酸钠 5 酵母提取物 2.5 L-酪氨酸 0.1 L-苯丙氨酸 0.15 NaCl 2.5 碳酸钙 40

将在37℃下在孵育器中的LB固体培养基上培养过夜的一铂圈的各 L-色氨酸生产母本菌株(Con)以及Con/pCL-P_CJ1-trpD和 Con/pCL-P_CJ1-trp4菌株接种到25mL上表1中示出的滴定培养基中，然 后在37℃和200rpm下在孵育器中培养各菌株40小时。结果示于下表2 和3中。

表2：L-色氨酸生产菌株与通过载体表达trpD或trp4基因的菌株之间色氨酸生产力的比较

菌株 L-色氨酸(g/L) 邻氨基苯甲酸(mg/L) Con/pCL 6.9±0.5 722±62 Con/pCL-P_CJ1-trpD 8.0±0.4 42±13 Con/pCL-P_CJ1-trp4 10.3±2.4 28±1

表3：L-色氨酸生产菌株与通过载体表达trpD或trp4基因的菌株之间生理学活性的比较

菌株 细胞浓度(OD₆₀₀) 葡萄糖消耗速率(g/L·h^-1) Con/pCL 18.2±0.7 1.78±0.03 Con/pCL-P_CJ1-trpD 19.1±1.4 1.76±0.05 Con/pCL-P_CJ1-trp4 20.7±1.5 1.67±0.06

如可以从上表2中看出的，L-色氨酸生产母本菌株在40小时培养期 间产生了6.9g/L的L-色氨酸，但是Con/pCL-P_CJ1-trp4菌株和 Con/pCL-P_CJ1-trp4菌株分别产生了8.0g/L和10.3g/L的L-色氨酸，并因 此表明与母本菌株相比，L-色氨酸生产力分别提高了1.1g/L和3.4g/L(分 别提高了16％和49％)。

此外，如可以从上表3中看出的，在葡萄糖消耗速率或细胞生长方面， 经转化菌株与L-色氨酸生产母本菌株是相似的，并且经转化菌株中发酵 副产物乙酸的累积也与L-色氨酸生产母本菌株中相似或更低(数据未示 出)。因此，可以看出，经转化菌株显示出与L-色氨酸生产母本菌株基本 上相似的生理学活性。

特别地，在L-色氨酸生产母本菌株中，由于涉及发酵期间邻氨基苯 甲酸累积的异常发酵而不能保持正常发酵的现象常常发生。因此，在L- 色氨酸生产母本菌株发酵中，控制发酵因素以便防止邻氨基苯甲酸过度累 积是重要的，并且不利地需要连续监测。因此，其中累积较少邻氨基苯甲 酸的L-色氨酸生产菌株被认为是重要的，原因是其可以降低异常发酵的 频率。如可以从表2和3中看到的，与L-色氨酸生产菌株相比，通过pCL 载体表达trpD或trp4基因的经转化菌株显示出较低的邻氨基苯甲酸累积。

通过分别比较表达大肠杆菌邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的经转 化菌株与表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的经转化菌株，可以看 出，在提高L-色氨酸生产力和降低邻氨基苯甲酸累积方面，表达trp4基 因的对PRPP具有高亲和力的经转化菌株更好。

因此，可以推断，当使用表达trp4基因的经转化菌株来生产L-色氨 酸时，L-色氨酸可以以更高的生产力生产，并且通过保持较高的发酵稳定 性可以使L-色氨酸的总生产力保持在高水平。

实施例4：重组载体pCL-P_CJ1-trp4到L-色氨酸生产菌株中的转化和经转化菌株之间L-色氨酸生产力的比较

为了确定在其他L-色氨酸生产菌株中是否也出现实施例中描述的作 用，将pCL-P_CJ1-trp4载体转化到菌株中，并以与实施例3中所述相同的 方式比较经转化菌株之间的L-色氨酸生产力。

该实施例中使用的L-色氨酸生产大肠杆菌菌株是KCCM10805P(韩 国专利No.0850853)和KCCM10814P(韩国专利No.0838036)。 KCCM10805P大肠杆菌突变菌株是来自L-色氨酸生产大肠杆菌菌株 CJ285(韩国专利公开No.10-2005-0059685)的对色氨酸类似物色氨酸异 羟肟酸具有抗性的L-色氨酸生产大肠杆菌菌株，并且特征在于参与亚硝 酸盐还原的nrfE基因因同源重组失活。KCCM10814P大肠杆菌突变菌株 是来自CJ285的L-色氨酸生产大肠杆菌菌株，并且特征在于编码合成内 膜所需之蛋白质的yjeO基因已被缺失。

4-1：多种经重组载体pCL-P_CJ1-trp4转化的L-色氨酸生产菌株的构建

以与实施例2所述相同的方式将重组载体pCL-P_CJ1-trp4引入到L- 色氨酸生产菌株KCCM10805P和KCCM10814P中以构建经转化菌株。 经转化菌株分别命名为“KCCM10805P/pCL-P_CJ1-trp4”和 “KCCM10814P/pCL-P_CJ1-trp4”。

4-2：多种经重组载体pCL-P_CJ1-trp4转化的L-色氨酸生产菌株之间L-色氨酸生产力的比较

以与实施例3中所述的相同方式在Erlenmeyer瓶中培养以上实施例 4-1中构建的经转化菌株，并比较其L-色氨酸生产力。比较结果示出下表 4中。

表4

菌株 L-色氨酸(g/L) 邻氨基苯甲酸(mg/L) Con/pCL 6.5±0.5 833±100 Con/pCL-P_CJ1-trp4 10.2±0.5 45±12 KCCM10805P 8.7±0.3 356±82 KCCM10805P/pCL-P_CJ1-trp4 9.6±0.6 67±12 KCCM10814P 8.2±0.9 484±114 KCCM10814P/pCL-P_CJ1-trp4 9.8±0.5 63±11

如可以从上表4中看出的，当酵母trp4基因在三种L-色氨酸生产菌 株中通过载体表达时，L-色氨酸生产力提高了约0.9g/L至3.7g/L。此外， 还示出当酵母trp4基因在三种L-色氨酸生产菌株中通过载体表达时，邻 氨基苯甲酸的量大幅降低。这表明L-色氨酸生产菌株中酵母trp4基因的 表达具有增强菌株的L-色氨酸生产力同时抑制菌株中邻氨基苯甲酸累积 的作用。

实施例5：已将CJ1启动子和trp4基因引入到L-色氨酸生产菌株染色体中的重组L-色氨酸生产菌株的构建

在实施例3中构建的Con/pCL-P_CJ1-trp4菌株中，经转化菌株在细胞 分裂期间可丢失质粒，并因此可丢失trp4基因表达盒。在这种情况下， 经转化菌株恢复成L-色氨酸生产菌株，表明难以稳定地保持trp4基因表 达盒。此外，存在这样的风险：质粒中耐抗生素选择标志物可以被引入 L-色氨酸生产母本菌株的基因组中，从而产生具有抗生素抗性的突变菌 株。

因此，在本发明中，仅将trp4基因表达盒插入到L-色氨酸生产母本 菌株基因组中的ybiX基因座中以解决该问题。

5-1：包含P_CJ1-trp4片段和氯霉素乙酰转移酶基因的载体的构建

作为用于确定trp4基因表达盒插入基因组中的选择标志物，使用赋 予氯霉素抗性的氯霉素乙酰转移酶基因。为此，使用包含氯霉素乙酰转移 酶基因的pUCprmfmloxC载体(韩国专利公开No.2009-0075549)。

使用实施例1-3中构建的pCL-P_CJ1-trp4作为模板，用SEQIDNO：10 和11的引物进行PCR以制备P_CJ1-trp4片段。用限制酶KpnI和SpeI处 理所制备的片段和pUCprmfmloxC载体，然后在0.8％琼脂糖凝胶上进行 电泳。使用快速DNA连接试剂盒(ROCHE，下文中相同)经30分钟将 各DNA片段连接到载体中，然后转化到大肠杆菌DH5α细胞中。在包含 氯霉素的LB固体培养基上对经转化细胞进行选择。在LB液体培养基中 培养所选择的菌落，回收质粒DNA，用限制酶处理，并测序以确定正确 地构建了包含P_CJ1-trp4基因和氯霉素乙酰转移酶基因的载体。经确定的 载体被命名为“pmlox-Cmt-P_CJ1-trp4”。

5-2：用于将包含P_CJ1-trp4基因和氯霉素乙酰转移酶基因的DNA片段插入到ybiX基因座中的DNA片段的制备

ybiX基因(基因ID：12930961)是其功能还未清楚阐明的基因，并 且已知缺失该基因导致细胞内ATP水平提高(Hara等，FEMSMicrobiol Lett，297，217-224，2009)。已知即使当使ybiX基因从大肠杆菌菌株中缺失 时，大肠杆菌菌株的生理学活性未受很大影响。因此，在本发明中，将trp4 基因表达盒插入到L-色氨酸生产母本菌株基因组的ybiX基因座中。

待插入到ybiX基因座中的trp4表达盒片段使用实施例5-1中构建的 pmlox-Cmt-P_CJ1-trp4质粒作为模板以及SEQIDNO：12和13的引物通过 进行PCR来制备。使所制备的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。 使用经电泳的DNA片段作为模板，用SEQIDNO：14和15的引物再次 进行PCR。使所得DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。

所制备的DNA片段是在5’和3’端分别包含等于ybiX基因的100-bp 序列的片段，并且可以通过重组酶插入到L-色氨酸生产菌株基因组的 ybiX基因座中。所制备的DNA片段的浓度使用NanoDrop(Thermo SCIENTIFIC)来测量。所制备的DNA片段被命名为 “ybiX：：Cm-P_CJ1-trp4”，并且其序列由SEQIDNO：16表示。

5-3：将P_CJ1-trp4的酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶表达盒插入到L-色氨酸生产菌株的ybiX基因座中

通过重组酶将trp4基因表达盒插入到ybiX基因座中。为了实现该插 入，使用由DatsenkoKA等开发的使用λRed重组酶的一步失活技术 (Datsenko等，ProcNatlAcadSciUSA，97，6640-6645，2000)。

以与实施例2中所述相同的方式将表达λRed重组酶的pKD46载体 质粒转化到L-色氨酸生产菌株(KCCM10812P)中。在包含氨苄青霉素 的LB固体培养基上选择经pKD46载体转化的L-色氨酸生产菌株。为了 诱导λRed重组酶的表达，将所选择的经pKD46载体转化的L-色氨酸生 产菌株在20mL包含5mM阿拉伯糖的液体LB培养基中培养。当细胞浓 度达到5×10⁸个细胞/mL时，回收细胞并用10％冷甘油溶液洗涤三次。

通过电穿孔将500ng实施例5-2中制备的ybiX：：Cm-P_CJ1-trp4DNA 片段引入所得的L-色氨酸生产菌株中。在其中引入有DNA片段的L-色 氨酸生产菌株中，通过由λRed重组酶引起的同源重组将氯霉素抗性基因 和trp4基因表达盒插入ybiX基因座中。因为该菌株显示出氯霉素抗性， 所以在包含氯霉素的LB固体培养基上进行选择。使用引物SEQIDNO： 17和18使所选择的菌株进行菌落PCR，并因此确定Cm-P_CJ1-trp4片段 被插入菌株的ybiX基因座中。

因为pKD46载体具有温度敏感的复制起点，所以在40℃或更高的温 度下孵育所选择的菌株以从细胞中移除pKD46载体。该移除通过以下事 实来确定：所选择的菌株在包含氨苄青霉素的固体LB培养基上不生长。

接着，为了从L-色氨酸生产菌株基因组中移除氯霉素抗性基因，以 与实施例2中所述的相同方式将pJW168质粒(Palmeros等，Gene，247， 255-264，2000)引入菌株中。为了由所引入的pJW168质粒表达Cre-重组 酶，将异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)平板接种在包含氨苄青霉素 的固体LB培养基上，并对菌株进行选择。在所选择的菌株中，通过在突 变loxP位置处由Cre-重组酶引起的基因重组移除氯霉素抗性基因，并且 使用SEQIDNO：17和18的引物确定该移除。如上所述确定的菌株是其 中插入有trp4基因表达盒的L-色氨酸生产菌株，并且将其命名为 “Con/ybiX：：P_CJ1-trp4”。

实施例6：染色体中插入有trp4基因表达盒的经转化菌株的L-色氨酸生产力和生理学活性的比较

使用上表1中示出的色氨酸滴定培养基在Erlenmeyer瓶中培养实施 例5中制备的经转化菌株，并且分析其L-色氨酸生产力。

将在37℃下在孵育器中的LB固体培养基上培养过夜的一铂圈个各 L-色氨酸生产母本菌株(Con)和Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株接种到25mL 上表1中示出的滴定培养基中，然后在37℃和200rpm下在孵育器中培 养40小时。培养的结果示于下表5和6中。

表5：L-色氨酸生产母本菌株与染色体中插入有trp4基因表达盒的菌株之间色氨酸生产力的比较

菌株 L-色氨酸(g/L) 邻氨基苯甲酸(mg/L)

Con 6.3±1.5 579±32 Con/ybiX：：P_CJ1-trp4 9.5±1.2 31±18

表6：L-色氨酸生产母本菌株与染色体中插入有trp4基因表达盒的菌株之间生理学活性的比较

菌株 细胞浓度(OD₆₀₀) 葡萄糖消耗速率(g/L·h^-1) Con 17.7±1.3 1.50±0.08 Con/ybiX：：P_CJ1-trp4 19.3±1.6 1.54±0.07

如可以从上表5中看到的，母本菌株在40小时培养期间产生了6.3g/L 的L-色氨酸，但是Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株产生了9.2g/L的L-色氨酸， 因此显示出与母本菌株相比，L-色氨酸生产力提高了2.9g/L(提高46％)。

此外，如可以从上表6中看出的，在葡萄糖消耗速率和细胞生长方面， Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株与母本菌株是相似的，与通过载体引入trp4基因 表达盒的经转化菌株相同。此外，Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株中发酵副产物 乙酸的累积与母本菌株中的相似或者比其更低(数据未示出)。

因此，可以看出，Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株显示出与L-色氨酸生产 母本菌株基本上相似的生理学活性，与通过载体引入trp4基因表达盒的 经转化菌株相同。此外，观察到与L-色氨酸生产母本菌株相比， Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株在发酵期间的邻氨基苯甲酸累积大幅降低，与通 过载体引入trp4基因表达盒的经转化菌株的情况相同。因此，可以推断， 当使用Con/ybiX：：P_CJ1-trp4菌株来生产L-色氨酸时，L-色氨酸可以以更 高的生产力生产，并且通过保持较高的发酵稳定性可以使L-色氨酸的总 生产力保持在高水平。

登记号

保藏单位：韩国微生物保藏中心；

登记号：KCCM11408P；

存放日期：2013年4月8日

保藏微生物或其他生物材料的证明

(PCT细则13bis)

表PCT/RO/134(1998年7月；2004年1月重印)