基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测定方法及其应用

摘要

本发明提供了一种基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测定方法，包括以下步骤：(1)制备染色皮粉：将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散NaCl溶液中形成皮粉悬浮液，振荡使皮粉中的杂质充分进入液相，然后按照每质量份皮粉使用0.15～4.0质量份低温活性染料、0.05～1.2质量份固色剂的量，加入低温活性染料溶液，振荡使低温活性染料与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，再加入固色剂溶液，充分振荡后过滤，洗涤、脱水、干燥、粉碎即得；(2)测定染色皮粉标准曲线；(3)制备待测反应液和空白对照液；(4)测得吸光度值并计算酶活力。该方法可在酸性、中性和碱性条件下测定蛋白酶的胶原水解酶活力。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白酶活力测定领域，涉及基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋 白水解活力测定方法及其应用。

背景技术

胶原蛋白是构成动物皮的主要结构蛋白，胶原蛋白的结构由三条α肽链缠绕成特 有的三股螺旋，多肽链序列是由Gly-x-y序列重复而成的，Gly残基沿三股螺旋的中 心轴堆积，一股链上的Gly与第二股的x残基和第三股的y残基相邻，每个Gly残基 的N-H与相邻链的x残基的C＝O形成氢键，且由于Hyp残基的羟基也参与链间氢键 的形成，三股螺旋得到进一步稳定和增强，由于以上特点，胶原蛋白不易被一般的蛋 白酶水解，但能被具有胶原蛋白酶活力的酶降解。

蛋白酶越来越多地被应用于食品、医药以及制革等行业中。在食品工业，水解动 物皮可得到胶原多肽，该水解产物具有良好的营养功能、理化性能及生理功能；在医 药工业，由皮胶原得到的水解胶原蛋白能有效促进创伤皮肤的愈合、提高骨骼强度、 抑制血压上升等；在制革工业，胶原蛋白酶广泛地用于浸水、脱毛、软化等工序中。 因此，建立蛋白酶胶原蛋白水解活力检测方法，有利于了解胶原蛋白水解酶的性能， 并根据其性能合理地应用。

蛋白酶活力的测定方法有以溶解的酪素作为底物的LVU法、胰蛋白酶的转化倍 数法、福林法，以变性的血清蛋白为底物的Anson法，以琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨 酰-亮氨酰-对硝基苯胺(Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA)为底物的蛋白酶活力测定方法。但 由于酪素、变性血清蛋白、Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA底物与胶原蛋白的性质相差较 大，因而以上方法测得的蛋白酶活力对蛋白酶在对胶原处理等方面的应用中并无实际 指导意义。氨基酸含量分析法则是根据羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸这一原理， 通过测定蛋白酶对胶原蛋白作用后所得水解物中的羟脯氨酸含量来计算蛋白酶的胶 原蛋白水解活力，虽然该方法能克服底物差异性，但存在着测定过程麻烦、测得周期 较长的不足。

对于蛋白酶的胶原蛋白水解活力的测定，还可采用染色皮粉作为底物，该底物在 蛋白酶的催化作用下水解，释放出来的酶解产物带有染料分子，使水解液具有颜色而 易于检测，如Azocoll、Congored和以及CommassieBrilliantBlue等染料染色皮粉被 用作底物来测定蛋白酶的活力。但这些染料主要是含有磺酸基和羧基等亲水基团的酸 性或直接性染料，它们主要是通过染料分子上的磺酸基、羧基与胶原蛋白以范德华力 和氢键相结合，这种结合力较弱，在酸性或碱性条件下，染色皮粉底物上的染料分子 易脱落或染料的颜色容易发生较大的变化，导致染色皮粉底物水解液的光吸收特征不 稳定，因而该方法通常只适合在中性条件下测定蛋白酶的活力，不适合在广谱的pH 值条件下对蛋白酶活力进行测定。由于蛋白酶的种类较多，根据蛋白酶的最适作用 pH值，蛋白酶可分为酸性、中性和碱性蛋白酶，该方法难以准确测定酸性和碱性蛋 白酶的胶原蛋白水解活力，导致其应用受到了很大的限制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于未变性染色皮粉底物的蛋 白酶胶原蛋白水解活力测定方法，以拓宽现有基于染色皮粉底物的蛋白酶活力测定方 法的pH值适用范围。

可实现上述发明目的的基于未变性染色皮粉底物的蛋白酶胶原蛋白水解活力测 定方法，包括以下步骤：

(1)制备染色皮粉：将由动物皮中间网状层制取的皮粉分散在浓度为 0.005～0.2g/mL的NaCl溶液中形成皮粉浓度为0.05～0.1g/mL的悬浮液，于10～45℃振 荡使皮粉中的杂质充分进入液相，然后按照每质量份皮粉使用0.15～4.0质量份低温活 性染料、0.05～1.2质量份固色剂的量，加入低温活性染料溶液，于10～45℃振荡使低 温活性染料与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，再加入固色剂溶液，于10～45℃充分 振荡后过滤，向所得固相皮粉中加入NH₄Cl溶液至液相呈中性，之后经过滤所得皮 粉用水洗涤至洗出液呈无色，洗涤后的皮粉再经脱水、干燥、粉碎制得染色皮粉；

(2)测定染色皮粉标准曲线：称取若干不同质量份的染色皮粉，分别向各染色 皮粉中加入等量的缓冲液以及等量的蛋白酶溶液，于20～50℃振荡至各染色皮粉完全 水解，得到染色皮粉水解产物的浓度呈梯度变化的若干份水解液，以检测波长测定各 份水解液的吸光度值，以染色皮粉的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲 线；

(3)制备待测反应液和空白对照液

向0.5～50mg染色皮中加入1～20mL缓冲液，加热至测定温度，加入将蛋白酶用 水稀释N倍形成的蛋白酶溶液0.1～5mL，在振荡下于测定温度进行酶解反应Tmin， 控制酶解反应的时间使染色皮粉不被完全消耗，酶解反应后立即离心，所得上清液即 为待测反应液；

向0.5～50mg染色皮粉中加入1～20mL缓冲液，加热至测定温度，于测定温度振 荡Tmin，加入将蛋白酶用水稀释N倍形成的蛋白酶溶液0.1～5mL，立即离心，所得 上清液即为空白对照液；

(4)测得吸光度值并计算酶活力：取空白对照液和待测反应液在检测波长下测 定吸光度值，分别记作A₀和A，根据式(1)计算计蛋白酶的胶原蛋白水解活力，

$U=\frac{(A-A_0)\times V_1\times 1000}{T\times V_2\times K}\times N---\left(1\right)$

式(1)中，U为蛋白酶的胶原蛋白水解活力，A₀和A分别为空白对照液和待测 反应液的吸光度值，V₁为酶解反应后反应体系的总体积,mL，V₂为稀释N倍的蛋白 酶溶液的加入量,mL，T为酶解反应的时间,min，K为标准曲线的斜率，N为蛋白酶 的稀释倍数。

上述技术方案中，所述低温活性染料为X型活性染料，优先采用活性艳蓝X-BR、 活性艳红X-3B、活性嫩黄X-7R或者活性艳橙X-GN。

上述技术方案中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶或者碱性蛋白酶。

上述技术方案中，所述固色剂为Na₂CO₃、Na₂HCO₃、NaOH、代碱剂中的至少一 种。

上述技术方案中，所述低温活性染料的浓度为0.015～0.2g/mL，固色剂溶液的浓 度为0.01～0.2g/mL。

上述技术方案中，所述缓冲液的pH值为1～14，优先采用伯瑞坦-罗宾森缓冲液、 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。

上述技术方案中，所述检测波长的确定方法为：向染色皮粉中加缓冲液和蛋白酶 溶液，于20～50℃振荡至染色皮粉完全水解，将得到的染色皮粉的水解液用缓冲液稀 释并测定其在400～800nm波长范围内的光吸收曲线，以最大吸收波长作为检测波长。

上述技术方案中，步骤(1)所述由动物皮中间网状层制取的皮粉和染色皮粉为 过40～200目筛的皮粉。

上述技术方案中，用于制备染色皮粉的动物皮优选为牛皮、猪皮或羊皮。

上述技术方案中，步骤(1)在加入固色剂溶液后，优选在10～45℃振荡30～60min。

上述技术方案中，酶活力定义为：在测定温度和pH值条件下，每分钟催化1μg 的染色皮粉水解成溶液所需蛋白酶的量为一个活力单位。

本发明还提供了一种上述方法的应用，上述方法适用于在制革、食品或者医药领 域中测定蛋白酶或蛋白酶制剂的胶原蛋白水解活力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种测定蛋白酶胶原蛋白水解活力的新方法，该方法采用低温 活性染料对皮粉进行染色，皮粉中的胶原蛋白与低温活性染料之间形成了共价结合， 由于共价结合的形式比氢键、范德华力等形式的结合更加牢固，因此染色皮粉中的染 料分子即使在酸性和碱性条件下也不容易脱落，加之染料的光吸收特性在酸碱度不同 的情况下均无明显变化，因而本发明所述方法适用于在较宽的pH值条件下测定酶活 力，对酸性、中性和碱性蛋白酶均使用。

2.由于本发明所述方法采用低温活性染料在10～45℃对皮粉进行染色，在该温度 染色能避免皮粉发生热变性，以未变性的染色皮粉作为底物测定蛋白酶的胶原蛋白水 解活力，反应体系接近实际应用，因而采用本发明所述方法测定的酶活力结果对实际 用于的指导意义更强。

3.本发明所述方法中采用的染色皮粉被蛋白酶水解形成的水解液在可见光范围 内即可产生吸收，水解产物的浓度易于检测，本发明所述方法具有操作简单、快速、 灵敏、成本低廉的优势，易于推广应用。

附图说明

图1是实施例1中的染色皮粉水解液在pH值为3～11时在400～800nm波长范围 的光吸收曲线，图1中，600nm处的吸光度值由大到小的曲线依次是在pH值为3、5、 9、11和7的条件下测得，OD标示吸光度值。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，实施例只用于 对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

下述各实施例中，所述PY酶是一种碱性蛋白酶，购自成都达威有限公司；所述 LT酶是一种酸性蛋白酶，购自山东隆科特酶制剂有限公司；采用的仪器主要有： FA2004型分析天平、pHS-3C型pH计、LG16-W型高速微量离心机、UV2501PC紫 外-可见分光光度计、MS-100型恒温混匀仪。

实施例1

基于未变性染色皮粉底物的PY酶胶原水解活力检测方法，步骤如下：

(1)试剂准备

配制0.1mol/L的伯瑞坦-罗宾森缓冲液(B-R缓冲液)：称取6.183g硼酸溶解于 适量蒸馏水中，加入11.5294g磷酸和6.005g乙酸，用4mol/L的NaOH溶液调节pH 值至3～12后用蒸馏水定容至1L。

配制0.005g/mL的NaCl溶液：称取0.5gNaCl用蒸馏水定容至100mL。

配制0.015g/mL的活性艳蓝X-BR溶液：称取1.5g活性艳蓝X-BR用蒸馏水定 容至100mL。

配制0.01g/mL的Na₂CO₃溶液：称取1gNa₂CO₃用蒸馏水定容至100mL。

配制0.05g/mL的NH₄Cl溶液：称取5gNH₄Cl用蒸馏水定容至100mL。

(2)制备染色皮粉：牛皮经浸水、脱脂后，取中间网状层充分水洗，然后用丙 酮脱水，自然干燥、粉碎、过40目筛后制得皮粉；称取该皮粉5g置于锥形瓶中，加 入NaCl溶液100mL，振荡至牛皮均匀分散在NaCl溶液形成皮粉悬浮液，于35℃振 荡2h使皮粉中的杂质进入液相，加入活性艳蓝X-BR溶液50mL，于35℃振荡60min 使活性艳蓝X-BR与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，加入Na₂CO₃溶液50mL，再 于35℃振荡60min，过滤，向所得固相中加入NH₄Cl溶液调节液相的pH值至约为7， 用去离子水洗涤皮粉至洗出液呈无色状态，将洗涤后的皮粉用丙酮脱水，自然干燥， 研磨，过50目筛制得染色皮粉；

(3)确定检测波长：称取50mg染色皮粉置于锥形瓶中，加入4mLB-R缓冲液 和1mLPY酶溶液，在恒温混匀仪中于40℃振荡至染色皮粉完全水解，得到染色皮 粉的水解液，取该水解液5份，分别调节pH值至3、5、7、9、11得到5个样品， 然后分别在400～800nm波长范围内检测各样品的光吸收曲线，结果如图1所示，以 最大吸收波长600nm作为检测波长，由图1还可以看出，本实施例采用的活性艳蓝 X-BR分子在较宽的pH值范围均能稳定存在，其光吸收特性没有明显变化。

(4)测定染色皮粉标准曲线：准确称取0、10、20、30、40、50mg染色皮粉置 于锥形瓶中，分别加入4mLpH＝9的B-R缓冲液和1mLPY酶溶液，在恒温混匀仪中 于40℃振荡至染色皮粉完全水解，得到6份染色皮粉水解产物的浓度呈梯度变化水 解液，测得各水解液在600nm波长处的吸光度值，然后以染色皮粉浓度为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制染色皮粉的标准曲线，该标准曲线的斜率K＝0.435。

(5)制备待测反应液和空白对照液

待测反应液：将PY酶用蒸馏水稀释30000倍制成PY酶溶液。称取5±0.1mg 染色皮粉作为底物，加入1mLpH＝9的B-R缓冲液，加热至40℃后加入0.2mL所述 PY酶溶液，在恒温混匀仪中在振荡条件于40℃酶解反应30min，此时染色皮粉未被 完全消耗，立即离心，所得上清液即为待测反应液，酶解反应后反应体系的总体积为 1.2mL；

空白对照液：称取5±0.1mg染色皮粉作为底物，加入1mLpH＝9的B-R缓冲液， 加热至40℃，在恒温混匀仪中于40℃振荡30min，然后加入0.2mL用水稀释15000 倍的PY酶溶液，立即离心，所得上清液即为空白对照液。

(6)测定吸光度值并计算酶活力：取空白对照液和待测反应液在600nm波长处 测定吸光度值，分别记作A₀和A；根据式(1)计算计PY酶的胶原蛋白水解活力， PY酶的胶原蛋白水解活力定义为：在温度为40℃、pH＝9.0的条件下，每分钟催化1 μg的染色皮粉水解成溶液所需PY酶的量为一个活力单位U。

$U=\frac{(A-A_0)\times V_1\times 1000}{T\times V_2\times K}\times N---\left(1\right)$

式(1)中，U为蛋白酶的胶原蛋白水解活力，A₀和A分别为空白对照液和待测 反应液的吸光度值，V₁为酶解反应后反应体系的总体积,mL，V₂为稀释N倍的蛋白 酶溶液的加入量,mL，T为酶解反应的时间,min，K为标准曲线的斜率，N为蛋白酶 的稀释倍数。A＝0.358(5次测量的平均值)，A₀＝0.088，V₁＝1.2mL，V₂＝0.2mL，T＝30min， K＝0.435，N＝30000，带入式(1)，则：

$U=\frac{(A-A_0)\times V_1\times 1000}{T\times V_2\times K}\times N=\frac{(0.358-0.088)\times 1.2\times 1000}{30\times 0.2\times 0.435}\times 30000=4937931$

实施例2

基于未变性染色皮粉底物的LT酶胶原水解活力检测方法，步骤如下：

试剂准备和制备染色皮粉的过程与实施例1相同，检测波长为600nm。

(1)测定染色皮粉标准曲线：准确称取0、10、20、30、40、50mg染色皮粉置 于锥形瓶中，分别加入4mLpH＝4的B-R缓冲液和1mLLT酶溶液，在恒温混匀仪中 于40℃振荡至染色皮粉完全水解，得到6份染色皮粉水解产物的浓度呈梯度变化水 解液，测得各水解液在600nm波长处的吸光度值，然后以染色皮粉浓度为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制染色皮粉的标准曲线，该标准曲线的斜率K＝0.435。

(2)制备待测反应液和空白对照液

待测反应液：将LT酶用蒸馏水稀释200倍制成LT酶溶液。称取5±0.1mg染色 皮粉作为底物，加入1mLpH＝4的B-R缓冲液，加热至40℃后加入0.2mL所述LT 酶溶液，在恒温混匀仪中在振荡条件下于40℃酶解反应30min，此时染色皮粉未被完 全消耗，立即离心，所得上清液即为待测反应液，酶解反应后反应体系的总体积为 1.2mL；

空白对照液：称取5±0.1mg染色皮粉作为底物，加入1mLpH＝4的B-R缓冲液， 加热至40℃，在恒温混匀仪中于40℃振荡30min，然后加入0.2mL用水稀释15000 倍的LT酶溶液，立即离心，所得上清液即为空白对照液。

(3)测定吸光度值并计算酶活力：取空白对照液和待测反应液在600nm波长处 测定吸光度值，分别记作A₀和A；根据式(1)计算计LT酶的胶原蛋白水解活力， LT酶的胶原蛋白水解活力定义为：在温度为40℃、pH＝4.0的条件下，每分钟催化1 μg的染色皮粉水解成溶液所需PY酶的量为一个活力单位U。

$U=\frac{(A-A_0)\times V_1\times 1000}{T\times V_2\times K}\times N---\left(1\right)$

式(1)中，U为蛋白酶的胶原蛋白水解活力，A₀和A分别为空白对照液和待测 反应液的吸光度值，V₁为酶解反应后反应体系的总体积,mL，V₂为稀释N倍的蛋白 酶溶液的加入量,mL，T为酶解反应的时间,min，K为标准曲线的斜率，N为蛋白酶 的稀释倍数。A＝0.408(5次测量的平均值)，A₀＝0.093，V₁＝1.2mL，V₂＝0.2mL，T＝30min， K＝0.435，N＝200，带入式(1)，则：

$U=\frac{(A-A_0)\times V_1\times 1000}{T\times V_2\times K}\times N=\frac{(0.408-0.096)\times 1.2\times 1000}{30\times 0.2\times 0.435}\times 200=37517$

实施例3

基于未变性染色皮粉底物的PY酶胶原水解活力检测方法的操作与实施例1基本 相同，不同之处在于采用pH＝9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，染色皮粉的制备方法如 下：

牛皮经浸水、脱脂后，取中间网状层充分水洗，然后用丙酮脱水，自然干燥、粉 碎、过100目筛后制得皮粉；称取该皮粉5g置于锥形瓶中，加入浓度为0.1g/mLNaCl 溶液50mL，振荡至牛皮均匀分散在NaCl溶液形成皮粉悬浮液，于45℃振荡1h使皮 粉中的杂质进入液相，加入浓度为0.2g/mL的活性艳红X-3B溶液100mL，于45℃ 振荡60min使活性艳红X-3B与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，加入浓度为0.2g/mL 的Na₂HCO₃溶液30mL，再于45℃振荡60min，过滤，向所得固相中加入浓度为0.05 g/mL的NH₄Cl溶液调节液相的pH值至约为7，用去离子水洗涤皮粉至洗出液呈无色 状态，将洗涤后的皮粉用丙酮脱水，自然干燥，研磨，过200目筛制得染色皮粉。

实施例4

基于未变性染色皮粉底物的PY酶胶原水解活力检测方法的操作与实施例1基本 相同，不同之处在于采用pH＝9的Tris-HCl缓冲液，染色皮粉的制备方法如下：

牛皮经浸水、脱脂后，取中间网状层充分水洗，然后用丙酮脱水，自然干燥、粉 碎、过80目筛后制得皮粉；称取该皮粉5g置于锥形瓶中，加入浓度为0.2g/mLNaCl 溶液100mL，振荡至牛皮均匀分散在NaCl溶液形成皮粉悬浮液，于10℃振荡2h使 皮粉中的杂质进入液相，加入浓度为0.15g/mL的活性嫩黄X-7R溶液30mL，于10℃ 振荡30min使活性嫩黄X-7R与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，加入浓度为0.1g/mL 的NaOH溶液10mL，再于10℃振荡40min，过滤，向所得固相中加入浓度为0.05g/mL 的NH₄Cl溶液调节液相的pH值至约为7，用去离子水洗涤皮粉至洗出液呈无色状态， 将洗涤后的皮粉用丙酮脱水，自然干燥，研磨，过100目筛制得染色皮粉。

实施例5

基于未变性染色皮粉底物的PY酶胶原水解活力检测方法的操作与实施例1基本 相同，不同之处在于采用pH＝9的Tris-HCl缓冲液，染色皮粉的制备方法如下：

牛皮经浸水、脱脂后，取中间网状层充分水洗，然后用丙酮脱水，自然干燥、粉 碎、过100目筛后制得皮粉；称取该皮粉5g置于锥形瓶中，加入浓度为0.01g/mLNaCl 溶液100mL，振荡至牛皮均匀分散在NaCl溶液形成皮粉悬浮液，于35℃振荡2h使 皮粉中的杂质进入液相，加入浓度为0.05g/mL的活性艳橙X-GN溶液50mL，于10℃ 振荡60min使活性艳橙X-GN与皮粉中的胶原蛋白发生共价结合，加入浓度为0.05 g/mL的NaOH溶液30mL，再于35℃振荡30min，过滤，向所得固相中加入浓度为 0.05g/mL的NH₄Cl溶液调节pH值至约为7，用去离子水洗涤皮粉至洗出液呈无色状 态，将洗涤后的皮粉用丙酮脱水，自然干燥，研磨，过200目筛制得染色皮粉。