一种检测海洋致病弧菌的基因芯片及其制备方法与检测方法

摘要

本发明公开了一种检测海洋致病弧菌的基因芯片及其制备方法与检测方法，所述基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的检测探针，所述检测探针包括创伤弧菌gyrB基因探针、创伤弧菌毒力基因hemA探针、灿烂弧菌gyrB基因探针、灿烂弧菌毒力基因toxR探针、哈维式弧菌gyrB基因探针、哈维氏弧菌毒力基因hemA探针、副溶血弧菌gyrB基因探针、副溶血弧菌毒力基因toxS探针、鳗弧菌gyrB基因探针和鳗弧菌毒力基因hem探针，其分别由SEQ？ID？NO？1-10的序列所示。本发明首次将基因芯片用于海洋致病弧菌种间的检测。本发明的基因芯片不仅能够快速、灵敏地检测靶细菌感染，而且重复性好，信号强，不易出现非特异信号。

说明书

技术领域

本发明属于基因芯片检测的技术领域，具体涉及一种检测海洋致病弧菌的基因芯片及其制备方法与检测方法。

背景技术

致病菌感染是人类面临的棘手问题，它常造成较高的病死率和致残率。早期诊断和治疗具有重要意义，延迟诊断导致盲目应用抗菌药物，增加经济负担，促进细菌耐药的发生。培养法是目前细菌感染诊断的金标准，但费时长，且常根据生化反应等表型来诊断，易误诊，也不易作为监测致病菌的工具。

生物芯片技术是近年来生物科学领域中迅速发展起来的一项技术。它主要是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面上构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他多种生物成分的准确、快速、大量的信息的检测。常用的生物芯片分为三大类：生物芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于基因表达谱的分析、突变检测、多态性分析、基因测序和基因组文库作图等研究，同时在人类疾病的检测、预防等方面也具有广阔的潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种检测海洋致病弧菌的检测基因芯片及其制备方法与检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测海洋致病弧菌的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的检测探针，所述检测探针包括以点阵样式排列的创伤弧菌gyrB基因探针、创伤弧菌毒力基因hemA探针、灿烂弧菌gyrB基因探针、灿烂弧菌毒力基因toxR探针、哈维式弧菌gyrB基因探针、哈维氏弧菌毒力基因hemA探针、副溶血弧菌gyrB基因探针、副溶血弧菌毒力基因toxS探针、鳗弧菌gyrB基因探针和鳗弧菌毒力基因hem探针，其分别由SEQIDNO1-10的序列所示。

所述固相载体选自：玻璃、尼龙膜、硝酸纤维素、PVDF膜。

所述基因芯片还固定有阴性质控探针、阳性质控探针和定位标记点探针，其分别由SEQIDNO31-33的序列所示。

一种制备本发明的检测海洋致病弧菌的基因芯片的方法：用芯片点样仪将稀释好的探针印点到固相载体上，探针的序列如SEQIDNO1-10所示；点样结束后，将基片放入紫外仪中进行交联。

膜基片在紫外仪中交联至1J/cm2备用。

玻璃基片在紫外仪中交联至500mJ/cm2，然后用0.5％SDS清洗液清洗5-10min，纯净水清洗5-8min，低速离心或吹干后备用。

本发明的检测海洋致病弧菌的基因芯片的检测方法，包括以下步骤：

(1)标记待测样品；

(2)基因芯片与待测样品杂交；

(3)检测杂交结果。

步骤(1)中待测样品采用生物素标记。

步骤(2)中标记的待测样品98℃变性后冰浴骤冷，与杂交液按1:10混合均匀后，滴加在芯片上，42℃杂交2h；其中，杂交液由5XDeharndt，2XSSC，50％去离子甲酰胺，0.2％SDS的溶液组成。

本发明的有益效果为：

本发明首次将基因芯片用于海洋致病弧菌种间的检测。本发明的基因芯片不仅能够快速、灵敏地检测靶细菌感染，而且重复性好，信号强，不易出现非特异信号。直读型检测系统具有操作简单，无需避光，无需特殊昂贵激光扫描检测仪器，因而有可能在临床得到更广泛应用。

附图说明

图1为本发明的海洋致病弧菌的检测基因芯片的点样矩阵图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细地解释说明。

实施例1

本发明的检测海洋致病弧菌的基因芯片的制备方法如下：

(1)引物和探针的设计：将5种弧菌的菌株：创伤弧菌ATCC27562、灿烂弧菌ATCC33125、哈维氏弧菌ATCC33868、副溶血弧菌ATCC17802、鳗弧菌ATCC43308培养在普通牛肉膏蛋白胨和血平板上，利用双向电泳寻找差异蛋白，质谱测序后获得特异性氨基酸和DNA序列，进一步网上比对后确定与致病性相关的基因序列。使用常用的探针设计软件(如ArrayDesigner4)按照引物和探针的设计要求进行设计。将设计好的引物和探针进行商业性合成(如上海生物工程有限公司)。在引物上标记生物素，探针不需要标记。

海洋致病弧菌的各基因的探针及引物的序列如表1所示。基因芯片上还固定有阴性质控探针(NC)、阳性质控探针(PC)、定位标记点探针(BIO)。阴性质控探针(NC)、阳性质控探针(PC)、定位标记点探针(BIO)的序列如下：

BIO：GYCACAYGCGAYGGAYCGAGCYCCYYYAYCAYCGYYCCCACCYYAAYGCA

PC：GCTGCCTCCCGTAGGAGT

NC：GTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT

所述基因芯片上的探针排列顺序为：6行×7列的矩阵，第1列的6个样点均为定位标记点探针，第1行第2-4列的样点均为阳性质控探针，第1行第5-7列的样点均为阴性质控探针，其余样点分别为各弧菌基因的检测探针，每一个弧菌基因的检测探针在同一行上依次形成三个样点，如图1所述。创伤弧菌gyrB基因探针的编号为VV1，创伤弧菌毒力基因hemA探针的编号为VV2；灿烂弧菌gyrB基因探针的编号为VS1，灿烂弧菌毒力基因toxR探针的编号为VS2；哈维式弧菌gyrB基因探针的编号为VH1，哈维式弧菌毒力基因hemA探针的编号为VH2；副溶血弧菌gyrB基因探针的编号为VP1，副溶血弧菌毒力基因toxS探针的编号为VP2；鳗弧菌gyrB基因探针的编号为VA1，鳗弧菌毒力基因hem探针的编号为VA2。

(2)固相载体选自：玻璃、尼龙膜、硝酸纤维素、PVDF膜。

玻璃基片的处理：玻片洗净、超声后放置在浓硫酸、双氧水混合液3h，再放入浓盐酸与无水乙醇混合液过夜，洗净烘干后放入APTES的无水乙醇溶液中浸泡24h，清洗烘干备用。

尼龙膜、硝酸纤维素、PVDF膜可以购买现成的产品，如Millpore公司的系列产品。

(3)芯片点样过程

利用芯片点样仪进行点样(如安捷伦公司设备)，探针浓度10μm、点样针浸没探针溶液时间3s，点样接触时间0.3s，针抬起高度2cm，下落深度1cm(使用膜基质时，将膜用2XSSC浸湿，贴于玻璃片表面，烘干后即可点样)。

点样结束后，膜基片在紫外仪中交联1J/cm²备用。玻璃基片在紫外仪中交联500mJ/cm²，然后用清洗液(0.5％SDS)清洗5-10min，纯净水清洗5-8min，低速离心或吹干后备用。

表1本发明的海洋致病弧菌各基因探针及引物

实施例2

本发明的检测海洋致病弧菌的基因芯片的检测方法如下：

(1)待检样品准备：取水样利用免疫磁珠富集后，95-100℃煮沸5-10min，取1μL作为PCR模板；

(2)Biotin标记的PCR扩增：10×PCRbuffe2.5μL，MgCl₂(20mM)2μL，Biotin标记的上游引物和下游引物各1μL(共有10对，同时加入)，2μLdNTP(dTTP为0.25mmol/L)，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，待检样品模板1μL，用灭菌超纯水补足体积至25μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

(3)杂交采用的杂交液(5×Deharndt，2×SSC，50％去离子甲酰胺，0.2％SDS)，将步骤(2)获得的PCR产物在沸水中煮沸10min，然后立即在冰水中冷却5min；与杂交液中按1:10混匀后，在42℃杂交2h(在杂交管内进行)

(4)加入抗体：杂交结束后取出膜，用含2×SSC-0.1％SDS的洗液42℃洗膜两次，每次5min；之后用纯净水洗涤5min，将膜放进5mLPBS(20mM，pH7.4)中；加入6μL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(1：1000)，反应30min。

(5)将膜按照步骤(4)的洗涤方法洗净，放入显色液(NBT/BCIP)中暗处显色至少10min，待样品显色而本底刚好不显色时取出膜，纯净水洗净，自然晾干。显色结束后的芯片可根据杂交点出现的位置人工肉眼判读，若显示蓝色或蓝紫色杂交点，则表示该样品有相对应的弧菌检测结果阳性，若不显示任何颜色，则表示该样品有相对应的弧菌检测结果阴性。

实施例3

利用创伤弧菌(ATCC27562)、灿烂弧菌(ATCC33125)、哈维氏弧菌(ATCC33868)、副溶血弧菌(ATCC17802)、鳗弧菌(ATCC43308)、强壮弧菌(MCCC1H00104)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)标准菌株作为待测样品进行检测。

创伤弧菌(ATCC27562)检测结果显示，探针VV1与VV2结果呈阳性，其他探针均为阴性。

灿烂弧菌(ATCC33125)检测结果显示，探针VS1与VS2结果呈阳性，其他探针均为阴性。

哈维氏弧菌(ATCC33868)检测结果显示，探针VH1与VH2结果呈阳性，其他探针均为阴性。

副溶血弧菌(ATCC17802)检测结果显示，探针VP1与VP2结果呈阳性，其他探针均为阴性。

鳗弧菌(ATCC43308)检测结果显示，探针VA1与VA2结果呈阳性，其他探针均为阴性。

强壮弧菌(MCCC1H00104)检测结果显示，所有探针均为阴性。

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)检测结果显示，所有探针均为阴性。

阴沟肠杆菌(ATCC13047)检测结果显示，所有探针均为阴性。

以上结果显示，5种弧菌检测的特异性良好。

实施例4

利用本发明的检测海洋致病弧菌的基因芯片检测海水样品的方法如下：

(1)取海水样品1、海水样品2、海水样品3、海水样品4、海水样品5各1L，利用商品化的细菌基因组提取试剂盒对海水中的细菌基因组DNA进行制备。将基因组DNA作为扩增模板进行检测。取1μL作为PCR模板；

(2)Biotin标记的PCR扩增：10×PCRbuffe2.5μL，MgCl₂(20mM)2μL，Biotin标记的上游引物和下游引物各1μL(共有10对，同时加入)，2μLdNTP(dTTP为0.25mmol/L)，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，待检样品模板1μL，用灭菌超纯水补足体积至25μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；

(3)杂交采用的杂交液(5×Deharndt，2×SSC，50％去离子甲酰胺，0.2％SDS)，将步骤(2)获得的PCR产物在沸水中煮沸10min，然后立即在冰水中冷却5min；与杂交液中按1:10混匀后，在42℃杂交2h(在杂交管内进行)；

(4)加入抗体：杂交结束后取出膜，用含2×SSC-0.1％SDS的洗液42℃洗膜两次，每次5min；之后用纯净水洗涤5min，将膜放进5mLPBS(20mM，pH7.4)中；加入6μL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(1：1000)，反应30min；

(5)将膜按照步骤(4)的洗涤方法洗净，放入显色液(NBT/BCIP)中暗处显色至少10min，待样品显色而本底刚好不显色时取出膜，纯净水洗净，自然晾干。

海水样品1的检测结果：所有探针结果均为阴性，表明该海水样品中不含芯片中检测弧菌。

海水样品2的检测结果：探针VS1呈阳性，其他探针均为阴性，该海水样品检出灿烂弧菌。

海水样品3的检测结果：所有探针结果均为阴性，表明该海水样品中不含芯片中检测弧菌。

海水样品4的检测结果：探针VP1与VP2呈阳性，其他探针均为阴性，该海水样品检出副溶血弧菌。

海水样品5的检测结果：所有探针结果均为阴性，表明该海水样品中不含芯片中检测弧菌。

本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。