呼吸道常见致病菌基因芯片检测方法的研究

摘要

呼吸道感染在人体感染性疾病当中所占比例最多，严重威胁人类的生命健康。随着人类社会的发展，全球变暖、环境污染以及抗生素的广泛使用加剧了微生物的变异性，致使新的致病菌不断出现，同时也引起人类对呼吸道疾病的极大关注。呼吸道疾病多为细菌性感染。如果在发病早期能够快速有效地检测病原菌的种类，为后期的合理用药提供可靠的指导，则能够大大降低呼吸道疾病的死亡率。因此，建立快速、高效的检测体系是非常必要的。
　　 本项目针对13种呼吸道常见致病菌大肠杆菌，嗜麦芽糖寡养单胞菌，阴沟肠杆菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，嗜肺军团菌，流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，卡他莫拉菌，选取特异性基因如16S rRNA基因、ITS间区序列、gyrB基因、copB基因等，设计了6对引物和41条探针，此外用检测范围内的菌株、近缘菌株、临床分离株总共90株菌对探针进行筛选，最终得到了能快速检测上述13种菌的基因芯片。该芯片的在基因组水平上的检测的灵敏度为1ng/μl;在进行模拟样品试验时，其检测的灵敏度达到103 cfu/ml。此次研究利用了多重PCR、两步PCR方法对特异性片段进行扩增与标记，建立了针对6对引物的多重PCR体系。另外，还优化了杂交条件，最终确定杂交温度为46度、杂交时间为16小时，能够得到较好的荧光信号。
　　 总之，与传统的方法相比基因芯片灵敏度高、特异性强、通量大、周期短，能够快速、准确的检测病原菌的种类，可以应用于微生物学研究、临床诊断和流行病调查等领域。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 研究背景简介

1．1．1 呼吸道致病菌对人类健康的威胁

1．1．2 呼吸道常见致病菌

1．1．3 呼吸道致病菌检测技术的进展

1．1．4 基因芯片背景介绍

1．1．5 基因芯片的原理

1．1．6 基因芯片的分类

1．1．7 基因芯片的应用

1．1．8 基因芯片的发展前景

1．1．9 基因芯片检测微生物的步骤

1．1．10 论文涉及的特异性基因

第二节 研究目标、内容和创新性

1．2．1 研究目标

1．2．2 研究内容

1．2．3 实验的创新性

第二章 材料和方法

第一节 主要实验材料和仪器

2．1．1 细菌菌株

2．1．2 引物和探针

2．1．3 主要试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 其他酶与试剂

2．1．6 主要仪器

2．1．7 主要软件

第二节 实验方法

2．2．1 特异探针的设计与制备

2．2．2 引物的设计和制备

2．2．3 芯片点制

2．2．4 基因组DNA的提取

2．2．5 目的片段扩增和探针的标记

2．2．6 杂交和洗涤

2．2．7 扫描和分析

第三章 结果与分析

第一节 引物的设计、筛选、浓度的优化以及靶序列的扩增

3．1．1 引物的设计

3．1．2 引物的筛选

3．1．3 引物浓度优化

3．1．4 引物的扩增

3．1．5 扩增标记系统的优化

第二节 探针的筛选

3．2．1 杂交系统的优化

第三节 芯片性能评价

3．3．1 特异性实验

3．3．2 灵敏性实验

3．3．3 双盲实验

第四章 讨论

第一节 关于靶基因的选择

第二节 关于芯片杂交

4．2．1．靶序列扩增

4．2．2 靶序列标记

4．2．3 杂交系统

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历