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法律状态信息
法律状态
2019-05-21
授权
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2015-12-30
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K36/07 申请日:20150915
实质审查的生效
2015-12-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及药物化学及生物医药技术领域,尤其涉及抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法。
背景技术
黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens),又名黄蘑菇、黄环菌,属担子菌亚门,层菌纲,口蘑目,口蘑科,蜜环菌属。野生黄绿蜜环菌子实体中富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、挥发油及多糖等营养成分。
目前,中国专利(CN103190279A)报道采用马铃薯、黄豆芽及复合VB培养基培养应用于饮料、口服液、调味品、膳食食品及保健药膳方面的黄绿蜜环菌菌丝体,然而从黄绿蜜环菌次生代谢产物中规模化制备抗结肠癌浸膏粉的研究未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易规模化实施、质量稳定可控的抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法。
为解决上述问题,本发明所述的抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法,包括以下步骤:
⑴菌体发酵:将黄绿蜜环菌菌种用PDA培养基进行液体发酵2~4个周期,每个周期7~20天,合并培养液,该培养液经离心后,得到上清液;所述上清液经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物;
⑵液液分配富集:所述黄绿蜜环菌次生代谢产物用其质量10~20倍的分析纯水分散,得到分散液;该分散液用10~20倍体积的乙酸乙酯萃取3次,合并得到乙酸乙酯萃取液;所述乙酸乙酯萃取液经减压干燥得黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位;
⑶大孔树脂柱色谱除杂:在所述黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位中加入其质量5~10倍的水进行溶解,然后经大孔树脂柱分离,并依次分别以水、体积分数为75%的乙醇溶液按5~10倍的柱体积进行梯度洗脱,收集75%乙醇洗脱物;该75%乙醇洗脱物经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉;
⑷硅胶柱层析分离:在所述黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉中加入其质量3~5倍体积分数为90~100%的甲醇溶液进行溶解,经硅胶柱色谱分离后,用5~10倍柱体积的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱,按每份100~300mL收集馏分,并经薄层色谱检测,其中展开剂为氯仿、甲醇按5:5的体积比混合而成的混合溶剂,显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液,合并Rf值为0.1~0.8的馏分;所述Rf值为0.1~0.8的馏分经减压干燥,即得呈黄色粉末状的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉。
所述步骤⑴中黄绿蜜环菌菌种来源于中国科学院微生物研究所。
所述步骤⑴中离心速度为3000~8000rpm。
所述减压干燥条件是指真空度为0.07~0.09MPa,温度为60~70℃。
所述步骤⑶中大孔树脂柱为AB-8型树脂柱或X-5型树脂柱。
所述步骤⑷中氯仿-甲醇混合溶剂是指氯仿和甲醇按8:2~2:8的体积比混合而成的溶剂。
如上所述的抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法制得的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉在制备抗结肠癌药物或保健食品中的应用,其特征在于:该黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗结肠癌药用制剂,或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用黄绿蜜环菌菌种发酵生产黄绿蜜环菌次生代谢产物,发酵量可以按需求放大,不存在原料不足的问题。
2、本发明采用液液分配法富集黄绿蜜环菌次生代谢产物中乙酸乙酯萃取部位,溶剂价格低廉,而且可以再生循环使用,易于规模化。
3、本发明大孔树脂柱可以再生循环使用,同时树脂有脱色的功效,且回收率较高。
4、本发明采用硅胶柱层析分离,可直接将黄绿蜜环菌次生代谢产物中挥发性类组分与目标组分分开,同时去除部分强极性杂质。
5、本发明工艺简单、重复性较好、质量稳定可控。
6、本发明所获得的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉经测试,具有很好的抗结肠癌的作用。
⑴实验方法采用国际通用的MTT测定方法进行:首先,在96孔细胞板上接种2×104个对数生长期的结肠癌细胞HCT116,3个复孔,细胞贴壁后;再加入不同浓度待测样品,共设置7个药物浓度梯度,分别为:1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL和50μg/mL的该黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉样品组;72小时后,于96孔板对应孔中加入5mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养3h;弃去96孔板中上清液,加入100μLDMSO溶解,使用酶标仪检测570nm波长下的吸光值并计算待测样品对结肠癌细胞生长的半数抑制浓度IC50。
⑵实验结果表明,实施例1~3组黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉对结肠癌细胞株均有明显的抑制作用,依次为30.6μg/mL、29.4μg/mL、30.1μg/mL,平均值为30.0μg/mL。
具体实施方式
实施例1抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法,包括以下步骤:
⑴菌体发酵:将黄绿蜜环菌菌种用PDA培养基进行液体发酵2个周期,每个周期20天,合并培养液,该培养液经3000rpm的离心速度离心后,得到上清液;上清液在真空度为0.07MPa、温度为70℃的条件下经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物248.2g。
其中:黄绿蜜环菌菌种来源于中国科学院微生物研究所。
⑵液液分配富集:黄绿蜜环菌次生代谢产物用其质量10倍的分析纯水分散,得到分散液;该分散液用10倍体积的乙酸乙酯萃取3次,合并得到乙酸乙酯萃取液;乙酸乙酯萃取液在真空度为0.07MPa、温度为70℃的条件下经减压干燥得黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位81.4g。
⑶大孔树脂柱色谱除杂:在黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位中加入其质量5倍的水进行溶解,然后经大孔树脂柱分离,并依次分别以水、体积分数为75%的乙醇溶液按5倍的柱体积进行梯度洗脱,收集75%乙醇洗脱物;该75%乙醇洗脱物在真空度为0.07MPa、温度为70℃的条件下经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉56.1g。
其中:大孔树脂柱为AB-8型树脂柱。黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位与大孔树脂比例为1g:50mL。
⑷硅胶柱层析分离:在黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉中加入其质量3倍体积分数为100%的甲醇溶液进行溶解,经硅胶柱色谱分离后,用5倍柱体积的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱,按每份100mL收集馏分,并经薄层色谱检测,其中展开剂为氯仿、甲醇按5:5的体积比(mL/mL)混合而成的混合溶剂,显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液,合并Rf值为0.1~0.8的馏分;Rf值为0.1~0.8的馏分在真空度为0.07MPa、温度为70℃的条件下经减压干燥,即得呈黄色粉末状的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉44.0g。
其中:氯仿-甲醇混合溶剂是指氯仿和甲醇按8:2的体积比(mL/mL)混合而成的溶剂。
硅胶柱的尺寸为30mm×60mm。
实施例2抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法,包括以下步骤:
⑴菌体发酵:将黄绿蜜环菌菌种用PDA培养基进行液体发酵4个周期,每个周期7天,合并培养液,该培养液经8000rpm的离心速度离心后,得到上清液;上清液在真空度为0.09MPa、温度为60℃的条件下经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物868.5g。
其中:黄绿蜜环菌菌种来源于中国科学院微生物研究所。
⑵液液分配富集:黄绿蜜环菌次生代谢产物用其质量20倍的分析纯水分散,得到分散液;该分散液用20倍体积的乙酸乙酯萃取3次,合并得到乙酸乙酯萃取液;乙酸乙酯萃取液在真空度为0.09MPa、温度为60℃的条件下经减压干燥得黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位286.3g。
⑶大孔树脂柱色谱除杂:在黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位中加入其质量10倍的水进行溶解,然后经大孔树脂柱分离,并依次分别以水、体积分数为75%的乙醇溶液按10倍的柱体积进行梯度洗脱,收集75%乙醇洗脱物;该75%乙醇洗脱物在真空度为0.09MPa、温度为60℃的条件下经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉194.8g。
其中:大孔树脂柱为X-5型树脂柱。黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位与大孔树脂比例为1g:50mL。
⑷硅胶柱层析分离:在黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉中加入其质量5倍体积分数为90%的甲醇溶液进行溶解,经硅胶柱色谱分离后,用10倍柱体积的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱,按每份300mL收集馏分,并经薄层色谱检测,其中展开剂为氯仿、甲醇按5:5的体积比(mL/mL)混合而成的混合溶剂,显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液,合并Rf值为0.1~0.8的馏分;所述Rf值为0.1~0.8的馏分在真空度为0.09MPa、温度为60℃的条件下经减压干燥,即得呈黄色粉末状的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉153.2g。
其中:氯仿-甲醇混合溶剂是指氯仿和甲醇按2:8的体积比(mL/mL)混合而成的溶剂。
硅胶柱的尺寸为60mm×100mm。
实施例3抗结肠癌黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉的制备方法,包括以下步骤:
⑴菌体发酵:将黄绿蜜环菌菌种用PDA培养基进行液体发酵3个周期,每个周期10天,合并培养液,该培养液经5000rpm的离心速度离心后,得到上清液;上清液在真空度为0.08MPa、温度为65℃的条件下经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物394.8g。
其中:黄绿蜜环菌菌种来源于中国科学院微生物研究所。
⑵液液分配富集:黄绿蜜环菌次生代谢产物用其质量15倍的分析纯水分散,得到分散液;该分散液用15倍体积的乙酸乙酯萃取3次,合并得到乙酸乙酯萃取液;乙酸乙酯萃取液在真空度为0.08MPa、温度为65℃的条件下经减压干燥得黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位129.8g。
⑶大孔树脂柱色谱除杂:在黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位中加入其质量8倍的水进行溶解,然后经大孔树脂柱分离,并依次分别以水、体积分数为75%的乙醇溶液按8倍的柱体积进行梯度洗脱,收集75%乙醇洗脱物;该75%乙醇洗脱物在真空度为0.08MPa、温度为65℃的条件下经减压干燥即得黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉87.4g。
其中:大孔树脂柱为AB-8型树脂柱8。黄绿蜜环菌次生代谢产物乙酸乙酯萃取部位与大孔树脂比例为1g:50mL。
⑷硅胶柱层析分离:在黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粗粉中加入其质量4倍体积分数为90~100%的甲醇溶液进行溶解,经硅胶柱色谱分离后,用8倍柱体积的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱,按每份200mL收集馏分,并经薄层色谱检测,其中展开剂为氯仿、甲醇按5:5的体积比(mL/mL)混合而成的混合溶剂,显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液,合并Rf值为0.1~0.8的馏分;所述Rf值为0.1~0.8的馏分在真空度为0.08MPa、温度为65℃的条件下经减压干燥,即得呈黄色粉末状的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉68.1g。
其中:氯仿-甲醇混合溶剂是指氯仿和甲醇按5:5的体积比(mL/mL)混合而成的溶剂。
硅胶柱的尺寸为50mm×80mm。
上述实施例1~3制得的黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉在制备抗结肠癌药物或保健食品中的应用是指:该黄绿蜜环菌次生代谢产物浸膏粉作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗结肠癌药用制剂,或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
机译: 一种抑制木材攻击末端生长的方法和手段锯齿真菌,蜜环菌和蜜环菌以及木材攻击末端的担子菌
机译: 蜜环菌的拮抗剂组成及其制备方法和用途
机译: 可见的铁an丝菌丝体中的一种称为m-蛋白酶的酶,蜜环蜜菌中的一种名为fruktkroppar的酶。