吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用

摘要

本发明公开了一种吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用，属于吐曼酸的医药新用途技术领域。本发明的技术方案要点为；吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用，其中吐曼酸的分子式为C

说明书

技术领域

本发明属于吐曼酸的医药新用途技术领域，具体涉及一种吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease，AD）是常见的神经系统的退行性疾病，表现为老年斑的沉积，进行性学习记忆能力丧失和智力减退。老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽（beta-amyloid，Aβ）。研究报道，女性患者血液中雌激素水平降低与AD临床症状密切相关。雌激素不仅具有调控生殖和机体发育的作用，还有降低兴奋性氨基酸释放、神经保护和改善学习记忆等功能。流行病学显示，AD是一种有性别倾向的疾病，老年女性的发病率明显高于老年男性，提示雌激素缺乏在AD发生发展过程中具有显著意义。

脑中广泛存在雌激素受体（Estrogenreceptors，ER），研究发现雌激素受体如ERα、ERβ等可以调节海马的神经兴奋性及基于海马的学习记忆能力。同时，学习记忆损害程度与胆碱能神经元的数量密切相关。因此，提高脑内乙酰胆碱的含量是治疗AD的一个非常好的策略。

吐曼酸是一种三萜皂甙类物质，可以从草莓果、紫苏的叶子和橄榄等中提取。研究发现，吐曼酸能拮抗LPS-诱导的小胶质细胞的炎性反应。抑制平滑肌细胞的增殖和存活。吐曼酸能抑制坐骨神经的病理性疼痛及高脂饮食诱导的高脂血症及暴发性肝功能衰竭。

雌激素替代疗法己被肯定，但作为安全的长期用药仍有争议，如能增加阴道不规则出血和增加乳腺癌的风险等等。我们采用卵巢切除小鼠，作为研究对象，以期阐明吐曼酸、雌激素受体和神经功能在AD发病中的相互关系，明确吐曼酸对雌激素受体及对神经系统中的作用，为临床雌激素缺乏后引起的AD疾病的治疗提供理论依据。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用。

本发明的技术方案为，吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用，其中吐曼酸的分子式为C₃₀H₄₈O₅，结构式为：

。

进一步限定，所述的药物是由吐曼酸和药学上可接受的载体或赋形剂制成的。

本发明所述的吐曼酸在制备治疗或预防绝经期妇女合并阿尔茨海默病药物中的应用，其中吐曼酸的分子式为C₃₀H₄₈O₅，结构式为：

。

进一步限定，所述的药物是由吐曼酸和药学上可接受的载体或赋形剂制成的。

本发明的吐曼酸可改善AD患者的认知功能障碍，提高脑内胆碱能神经元的数量，对CNS具有神经保护作用，该保护作用可能通过ERα实现，该结果为吐曼酸作为治疗绝经期妇女合并AD的药物选择提供了实验依据。

附图说明

图1是本发明各组小鼠Meynert核团ChAT阳性神经元免疫组织化学检测图；

图2是本发明各组小鼠海马ERα和ERβ蛋白表达的Westernblot检测图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

1材料与方法

1.1造模和分组

卵巢切除痴呆模型小鼠造模：选用C57BL小鼠，3月龄，体重（30±2）g。以质量浓度为1.5%的戊巴比妥钠（0.25mL/100g）腹腔麻醉小鼠，消毒备皮耻骨以上的皮肤，沿正中切开耻骨上方皮肤2cm，切开腹壁肌层并打开腹腔，分别分离暴露双侧粉红色卵巢，结扎并摘除双侧卵巢（ovariectomy，OVX），依次缝合肌肉和皮肤，术后碘伏消毒。假手术组仅暴露卵巢。术后第3天进行阴道细胞涂片，连续7天出现上皮角化细胞则证明卵巢切除成功。卵巢切除痴呆模型是由于雌激素缺乏而引起的神经系统疾病，卵巢切除痴呆模型时间需要6-8周。

吐曼酸为湖北巨胜科技有限公司产品，其分子式：C₃₀H₄₈O₅，结构式：

。

成年雌性小鼠随机分成四组，即假手术组，OVX组，OVX+吐曼酸治疗组和OVX+载体假治疗组。吐曼酸治疗组以30mg/kg进行灌胃治疗，每两天一次，治疗8周。8周后进行Morris水迷宫测试小鼠的学习记忆能力。然后处死小鼠，分离海马，测定相应的指标变化。

1.2Morris水迷宫测定实验

Morris水迷宫视频分析系统的水槽由直径120cm、高55cm的圆形水池构成，黑色内壁，水深41cm，水温24±2℃，池壁平均分成4个象限，逃避平台位于其中一个象限内，平台低于水面1cm。水池周围参照物保持不变作为空间参照线索。动物运动轨迹由迷宫上方的摄像系统采集。Morris水迷宫实验程序包括：（1）定向航行实验：实验历时5d，每天上、下午进行。从一个象限开始依次将小鼠从各象限边缘放入水中，记录在60s内找到逃避平台的时间即为潜伏期。（2）空间探索实验：撤除逃避平台，任选一个入水点将小鼠放入水中，记录60s内小鼠穿越逃避平台的次数。

1.3ELISA检测的实验步骤

将各组小鼠的海马脑组织部位匀浆，匀浆液：5M的盐酸胍（含50mM的Tris-HCL，pH=8.0）匀浆后-70℃冻存待测。测定时，融化样本，1.5mL离心管中4℃，12000×g，离心30min，取上清50μL，按ELISA试剂盒说明书方法测定海马Aβ40水平。ELISA试剂盒购于BioSource公司（BioSourceInternational，Inc.，Camarillo，California）。

（1）标准品的稀释：按照说明书要求将鼠的Aβ1-40标准品稀释成以下浓度：500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.63pg/mL、7.81pg/mL、0pg/mL。

（2）加样：设立空白对照孔、标准孔和待测样本孔。空白对照孔加样品稀释液100μL，其他孔加标准品或待测样本各100μL，37℃，120min，弃液。

（3）加入A工作液100μL，37℃，60min，弃去。

（4）漂洗：加洗涤液350μL，漂洗3min×3次。

（5）加入B工作液100μL，37℃，60min。

（6）漂洗：加洗涤工作液350μL，3min×5次。

（7）显色：加底物90μL，37℃避光孵育30min，反应液逐渐变为蓝色。

（8）终止：加终止液50μL终止反应，此时反应液变为黄色。

（9）读数：酶标仪在450nm波长测定各孔的光密度（OD值）。

（10）根据标准曲线和测得的OD值计算出Aβ1-40浓度。

1.4免疫组织化学染色检测胆碱乙酞转移酶神经元：

小鼠麻醉后用质量浓度为4%的多聚甲醛灌注固定，取脑组织后固定，蔗糖梯度脱水、包埋，在冰冻切片机上作连续冠状切片，片厚20μm。各组小鼠的每只动物取Meynert基底核的相似平面切片5张，加入兔抗小鼠ChAT一抗，4℃冰箱孵育24h，PBS清洗3次，加入抗兔二抗，37℃孵育2h。每张切片随机选择5个视野，分别计数Meynert基底核视野内所有ChAT阳性细胞数。

1.5超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）活力测定：

SOD试剂盒购自上海碧云天公司，操作步骤如下：

（1）NBT/酶工作液的配制：按照每个反应160μL（158μLSOD检测缓冲液、1μLNBT和1μL酶溶液），4℃或冰浴保存。

（2）反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液（40X）融解后混匀，每1μL反应启动液（40X）加入39μLSOD检测缓冲液进行稀释，4℃保存。（3）SOD标准品准备：用试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下浓度：200U/mL，100U/mL，50U/mL，20U/mL，10U/mL，5U/mL，2U/mL。在随后的检测中各取20μL，参考样品进行检测。在560nm测定吸光度。SOD活力=（对照管OD值-测定管OD值）/对照管OD值×（反应液总体积/取样量）/蛋白含量。

1.6蛋白免疫印迹（Westernblot）

水合氯醛麻醉小鼠，断头并剥除脑膜暴露脑组织。在解剖显微镜镜下仔细切取海马组织50mg。迅速将组织置于预冷的含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液中（10mMHEPESpH=7.5，1.5mMMgCl₂，10mMKCl，1mMEDTA，1mMDTT，质量浓度10%glycerol，1mMPMSF，1×蛋白酶抑制剂）。冰上匀浆放置30min。100℃水浴5min。冰上冷却5min，4℃，12000×g，离心30min。取上清液，BCA法测浓度，分装，-80℃中保存备用。经质量浓度为5%的浓缩胶和质量浓度为10%的分离胶电泳，然后电转至PVDF膜上，质量浓度为5%的脱脂奶粉封闭，分别加入一抗（兔抗PKC-α（Millipore公司，美国）4℃孵育过夜，TBST漂洗10min×3次，加入HRP标记二抗，室温孵育2h。TBST漂洗10min×3次。ECL发光，显影、定影，以α-tubulin（Millipore公司，美国）作为内参进行灰度定量分析。

1.7统计学处理

实验数据用均数±标准差（±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较用t检验。逃避潜伏期用完全随机设计的方差分析和重复测量数据的多因素方差分析；空间探索试验用完全随机设计的方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1吐曼酸对卵巢切除痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响

研究结果显示：卵巢切除组与假手术组比较，小鼠的逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数明显减少，P＜0.05，表明卵巢切除后，雌激素缺乏痴呆模型造模成功。末次药物治疗后，对小鼠进行Morris水迷宫试验，来检测小鼠空间学习记忆能力的改变。结果显示：在刚开始的训练中，小鼠主要沿着水迷宫边缘游动寻找平台，表现为搜索平台的随机性和无目的性。随着训练的增加，卵巢切除组的小鼠仍保持此搜索策略，而吐曼酸治疗组动物搜索平台的行为具有倾向性和目的性，有的动物根据记忆直接游向逃避平台。在组内计算结果显示，时间因素有显著统计学意义（P＜0.05）。组间统计结果显示，吐曼酸治疗组和载体假治疗组间有显著统计学意义（表1）。

在空间探索试验，分析60s内小鼠穿越平台的次数（表2）。结果显示：吐曼酸治疗组小鼠围绕原平台象限以及平台位置进行，而载体假治疗组小鼠仍沿水池壁游动；对穿越平台次数进行统计，结果显示：吐曼酸治疗组比假治疗组明显增多，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。

表1各组小鼠Morris水迷宫逃避潜伏期（±s，n=5，秒）

组别秒假手术组35.73±7.67OVX组49.66±8.12*OVX+吐曼酸治疗组36.43±6.98OVX+载体假治疗组50.04±8.09#

注：OVX组与假手术组比较，*P＜0.05;OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，#P＜0.05。

表2各组小鼠Morris水迷宫穿越平台次数（±s，n=5，次）

组别次数假手术组6.45±1.22OVX组4.12±1.43*OVX+吐曼酸治疗组6.23±1.38OVX+载体假治疗组4.09±1.42#

注：OVX组与假手术组比较，*P＜0.05;OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，#P＜0.05。

2.2吐曼酸对卵巢切除痴呆模型小鼠海马Aβ40水平的影响

ELISA结果显示，卵巢切除痴呆模型组海马的Aβ40表达水平与假手术组比较明显升高，差异有显著性统计学意义P＜0.05，表明OVX可引起海马Aβ40蛋白表达水平升高；而经吐曼酸治疗后，吐曼酸治疗组小鼠海马的Aβ40表达水平与载体假治疗组比较明显降低，P＜0.05，差异有统计学意义，表明吐曼酸可减少海马Aβ40的蛋白表达水平（表3）。

表3各组小鼠海马Aβ40的表达水平（±s，n=5，%）

组别%假手术组100.00±10.42OVX组126.60±16.09OVX+吐曼酸治疗组104.60±9.67OVX+载体假治疗组126.58±16.08

注：OVX组与假手术组比较，*P＜0.05;OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，#P＜0.05。

2.3吐曼酸对卵巢切除痴呆模型小鼠Meynert核ChAT神经元数目的影响

与假手术组相比，卵巢切除组小鼠脑内内侧隔核的ChAT阳性神经元数目明显减少，差异有统计学意义。吐曼酸治疗组与载体假治疗组比较，吐曼酸治疗组小鼠的ChAT阳性神经元数目显著增加。提示吐曼酸治疗能逆转去卵巢引起的ChAT神经元数目减少（图1，表4）。

表4各组小鼠海马Meynert核ChAT神经元数目（±s，n=5，个）

组别个假手术组10.50±1.33OVX组7.09±0.91*OVX+吐曼酸治疗组9.88±1.45OVX+载体假治疗组7.08±0.90#

注：OVX组与假手术组比较，*P＜0.05;OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，#P＜0.05。

2.4吐曼酸对卵巢切除痴呆模型小鼠海马SOD活性的影响

我们实验结果显示：OVX组小鼠海马SOD活性明显降低，与假手术组比较，差异有统计学意义，P＜0.05，说明切除卵巢引起的雌激素缺乏会导致小鼠海马SOD活性降低；OVX+吐曼酸治疗组小鼠海马的SOD活性与载体假治疗组比较明显升高，差异有统计学意义，P＜0.05，说明吐曼酸能使去卵巢小鼠海马SOD活性升高（表5）。

表5各组小鼠海马SOD活性（±s，n=5，U/mgprotein）

组别U/mg protein假手术组65.46±6.03OVX组50.91±6.05*OVX+吐曼酸治疗组64.75±7.10OVX+载体假治疗组50.80±5.99#

注：OVX组与假手术组比较，*P＜0.05;OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，#P＜0.05。

2.5吐曼酸对卵巢切除痴呆模型小鼠海马ERα和ERβ蛋白表达的影响

各组小鼠海马ERαwesternblot结果显示，卵巢切除组海马的ERα表达水平与假手术组比较明显降低，P＜0.05，差异有显著性统计学意义，表明OVX可引起ERα蛋白表达下降。但卵巢切除组海马的ERβ表达水平与假手术组比较无明显改变，差异无显著性统计学意义P＞0.05；吐曼酸组：小鼠海马ERα表达水平与载体假治疗组比较明显提高，P＜0.05，差异有统计学意义，表明吐曼酸可上调海马ERα蛋白表达水平。但吐曼酸组与载体假治疗组的ERβ表达水平无明显改变，差异无统计学意义，P＞0.05（图2，表6）。

表6各组小鼠海马ERα的蛋白表达水平（±s，n=5，相对值）

组别ERα相对值ERβ相对值假手术组1.00±0.101.00±0.10OVX组0.79±0.11*0.97±0.11OVX+吐曼酸治疗组1.02±0.180.92±0.13OVX+载体假治疗组0.78±0.10#0.98±0.10

注：OVX组与假手术组比较，*P＜0.05，OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，#P＜0.05。

在临床上，65岁以后的女性发生AD疾病的几率明显高于男性。小鼠切除卵巢后，其雌激素水平的变化与绝经妇女雌激素变化相类似，卵巢切除是一种较好的雌激素缺乏动物模型。研究显示，卵巢切除8周后动物的学习记忆能力下降。本实验用Morris水迷宫检测动物的行为学改变以及吐曼酸对其影响。我们结果显示：卵巢切除8周后，OVX组小鼠的逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数显著减少，与假手术对照组比较有显著性差异，说明卵巢切除痴呆模型造模成功，卵巢切除导致的雌激素缺乏能引起学习记忆能力降低；而OVX+吐曼酸组小鼠的逃避潜伏期与载体假治疗组相比明显缩短，穿越次数增多，差异有统计学意义，说明去卵巢小鼠采用吐曼酸治疗后，学习记忆能力得到明显改善。

AD的典型病理特征表现为细胞外间隙Aβ沉积。Aβ聚集后对神经元产生毒性，通过引起细胞的氧化应激反应诱导神经元死亡。动物研究提示长期雌激素缺乏会增加海马内Aβ阳性神经元数量。而长期口服小剂量雌激素有助于防止OVX大鼠海马结构内Aβ沉积增加。本研究通过切除卵巢制备雌激素缺乏痴呆大鼠模型，结果发现，OVX组与假手术组比较，OVX组小鼠海马的Aβ40表达水平明显升高，差异有显著统计学意义，说明雌激素缺乏能引起海马内Aβ生成增加，AD症状加剧。而用吐曼酸治疗后，OVX+吐曼酸治疗组与OVX+载体假治疗组比较，OVX+吐曼酸治疗组小鼠海马的Aβ40表达减少，说明吐曼酸能减少雌激素缺乏痴呆模型脑内的Aβ沉积，从而实现保护脑组织作用。

Meynert基底核胆碱能神经元发出纤维投射至海马和大脑皮质，释放的ACh对认知活动起着重要作用。ChAT在胆碱能神经元胞体内合成，是胆碱能神经元的特殊标志。本实验利用ChAT抗体标记胆碱能神经元，观察卵巢切除后Meynert基底核胆碱能神经元变化及吐曼酸治疗对其影响。结果显示：OVX组Meynert基底核胆碱能神经元与假手术组比较，ChAT阳性神经元数量明显减少，说明切除卵巢后导致雌激素缺乏会引起基底前脑胆碱能神经元减少；而OVX+吐曼酸组小鼠Meynert基底核胆碱能神经元与载体假治疗组比较，ChAT阳性神经元数量明显增多，表明去卵巢后应用吐曼酸治疗能逆转基底前脑胆碱能神经元的丢失。

SOD是体内非常重要的抗氧化酶，能清除超氧阴离子，能保护细胞免受氧化损伤，对机体内氧化与抗氧化过程起平衡作用，是反映机体清除自由基能力的重要指标。本实验结果显示：OVX组海马SOD活性明显降低，与假手术组比较有显著性差异，说明切除卵巢导致雌激素缺乏能引起机体清除自由基能力降低；OVX+吐曼酸治疗组与载体假治疗组比较海马的SOD活性明显升高，差异有统计学意义，说明应用吐曼酸治疗后可以减少去卵巢后海马内的氧自由基产生，由此减少神经细胞死亡或丢失。

雌激素主要在卵巢及睾丸中合成，一小部分通过雄激素芳香化作用在末梢组织合成，除了调控生殖系统外，还对心脑血管、和中枢神经系统起着保护作用。雌激素与ER结合形成激素-受体复合物而激活ER，被激活的ER与DNA上的特异性雌激素反应元件作用，从而调节目的基因表达。ER有两种构型：ERα主要分布在子宫、胎盘、乳腺、心血管系统、中枢神经系统和骨组织中，这些组织可以诱导雌二醇反应元件表达；ERβ主要分布在前列腺、睾丸、甲状腺、松果体、甲状旁腺、皮肤、尿道和红细胞中，这些组织中ERβ表达很少。在AD危险因素中雌激素水平及雌激素受体的减少是少数可干扰因素之一，明确雌激素受体与AD的关系具有重要的临床意义。本实验结果显示，OVX导致大鼠痴呆及雌激素受体ERα水平降低，海马ERβ表达无统计学差异，提示ERα比ERβ更易受内源性雌激素水平的调节，ERα表达降低可导致神经元接受雌激素的保护作用减弱，从而导致神经元变性或死亡。给予吐曼酸治疗后，小鼠的海马区域ERα表达明显提高，而ERβ表达无显著性改变，这些结果提示吐曼酸主要通过ERα发挥作用。吐曼酸可能成为改善妇女绝经期后认知功能障碍的理想药物。

总之，吐曼酸可改善AD患者的认知功能障碍，提高脑内胆碱能神经元的数量，对CNS具有神经保护作用，该保护作用可能通过ERα实现，该结果为吐曼酸作为治疗绝经期妇女合并AD的药物选择提供了实验依据。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。