基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱及其应用

摘要

本发明公开了基于谷子DUS测试标准品种开发的SSR指纹图谱及其应用，属于分子生物学技术领域。所述SSR指纹图谱包括引物20对，标准品种32个，引物的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO.1～20所示，标准品种如品种表VAR？ID？NO.1～32。上述引物在32个标准品种中扩增均匀、稳定，扩增条带清晰、多态性丰富。本发明还提供了SSR指纹图谱在谷子品种鉴定中的应用。该指纹图谱能够对谷子品种权权属纠纷提供可靠的证据。

说明书

技术领域

本发明涉及谷子SSR标记，具体地说是基于谷子DUS测试标准品种开发的SSR指纹图谱及其应用，属于分析生物学技术领域。

背景技术

谷子(SetariaitalicaL.Beauv.)属于禾本科，狗尾草属[Setaria(L.)Beauv.]，自花授粉，是一种非常重要的粮食和饲草作物，广泛种植于中国、日本、印度、巴基斯坦等国的干旱和半干旱地区，东亚的朝鲜半岛及蒙古和乌克兰等地区也有稳定的栽培面积，其它地区也有少量栽培，其抗旱节水性强，对水分的利用率高，谷子具有耐贫瘠、耐旱性强，抗逆性强、适应性广、产量相对稳定的特性。

谷子属C4植物，具有高光和作用效率等特性，是开展作物抗旱机理及C4光合系统发育与调控研究的新模式作物，也是应对气候变暖和干旱形势的战略储备作物，是国家现代农业产业技术体系建设的重要组成部分。

新品种的特异性(Distinctness)、一致性((Uniformity)和稳定性(Stability)测试(简称DUS测试)是新品种保护的技术基础和授权的科学依据。为了促进谷子产业发展，保护谷子育种人员的合法权益，谷子新品种权保护工作就显得十分重要。目前国际上通行的DUS测试主要是以植物的表观形态特征作为指标，其测试结果容易受环境因素的影响，且周期较长。随着育种材料遗传基础的日益狭窄及选育品种数目的日益增多，品种间的差异越来越小，单纯依靠传统的植物学性状已经难以将它们准确鉴别。

随着DNA分子标记技术的不断发展，该项技术已广泛应用于各类植物品种的鉴定及纯度检测试验。分子标记检测技术因具有测试周期短、不受环境影响、标记数量多、可进行高通量测试的特点，现已逐步成为“DUS”的辅助手段。鉴于分子标记检测技术在鉴别品种上的优势，欧盟国家植物新品种知识产权保护组织自1994年成立以来，已利用DNA检测来决定是否批准新品种的申请。该技术具体应用在植物新品种保护DUS测试中，是以确定申请鉴定品种和贮藏标准品种的基因特异性差别为核心，在确定最少遗传距离的基础上，通过对两个样品DNA指纹图谱的鉴定比较，加以确认。如果被鉴定品种落入最小距离或范围时，即可认定该品种与已经登记的标准品种一致，拒绝其新品种权申请或确认侵权；反之，则可以受理其新品种权申请或排除该品种侵权嫌疑。

在我国农作物的品种审定中，从2002年起，先后全面启动了玉米、水稻、小麦、大豆、油菜、棉花参试品种DNA指纹检测工作，从目前的情况看，还不能仅用分子技术作为直接判定品种是否具有特异性的依据，但是可以利用分子技术构建已知品种DNA指纹数据库，并通过数据库辅助筛查申请品种的近似品种，然后将筛查出的近似品种与申请品种田间并排种植，进行形态DUS测试。这种方式可以提高特异性测试的针对性，减轻田间测试的工作量，同时，由于品种是否具有特异性是以形态测试作为最终鉴定方法，因此与原有的形态DUS测试系统是相融合的。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种谷子SSR指纹图谱，并将该SSR指纹图谱应用于植物基因型鉴定中，以便对那些没有准确系谱记载的育种材料进行遗传分类，弥补系谱记载的缺失；对自交系的遗传特征进行鉴定，以保护这些自交系的品种权免受侵犯。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱，包含20对引物和32个DUS标准品种，所述20对引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.1～SEQIDNO.20；所述32个DUS标准品种为VARIDNO.1粱谷、VARIDNO.2张矮10、VARIDNO.3豫谷八号、VARIDNO.4红苗青、VARIDNO.5野谷5号、VARIDNO.6日本赤须、VARIDNO.7金苗谷、VARIDNO.8乌克兰、VARIDNO.9W67、VARIDNO.10红十里香、VARIDNO.11桃花米、VARIDNO.12红粉谷、VARIDNO.13延安大粒、VARIDNO.14阴天旱、VARIDNO.1575原406、VARIDNO.16W56、VARIDNO.17肯尼亚、VARIDNO.18蜡烛台、VARIDNO.19矮88、VARIDNO.20佛手水、VARIDNO.21W59、VARIDNO.22猫蹄谷、VARIDNO.23兔蹄谷、VARIDNO.24红粒谷、VARIDNO.25耧里莠、VARIDNO.26黑粘谷、VARIDNO.27冀谷5号、VARIDNO.28豫谷1号、VARIDNO.29安矮17、VARIDNO.30罗马尼亚5号、VARIDNO.31蒙早1号、VARIDNO.32红软谷。

本发明的基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱的构建方法为：

步骤一、DNA提取

利用32个谷子DUS标准品种的幼嫩叶片，按CTAB法分别提取每个谷子DUS标准品种的DNA；

步骤二、引物扩增及电泳检测

分别以步骤一提取的每个谷子DUS标准品种的DNA为模板，并分别利用引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.20对每个谷子DUS标准品种的DNA进行PCR扩增；采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳检测，然后采用银染显色，形成32个谷子DUS标准品种的SSR指纹图谱。

本发明技术方案的进一步改进在于步骤二中PCR扩增所采用的PCR体系为：

2uL浓度为Mg²⁺plus的10×PCR缓冲液，2ul浓度为10mM的dNTPs，0.2ul浓度为5U/μl的rTaq酶，2ul浓度为100ng/μl的DNA模板，上下游引物各1ul，11.8ul去离子水；

扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，退火1min，延伸1min，共扩增30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤二中电泳检测是将3ul的10×loadingbuffer加入到PCR扩增产物中，取5ul样品，以50pbDNAmarker为DNA分子量标准，在GT核酸电泳系统以2000W恒功率电泳1.5h。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述银染显色是指使用2g/1000mlAgNO₃蒸馏水染色液对电泳后的PCR扩增产物进行3-4min染色，然后用浓度为15g/5ml/1000的NaOH/甲醛/蒸馏水显色液进行显色。

利用基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱的应用方法为：

步骤一、待鉴定样品的DNA提取

利用CTAB法提取待鉴定谷子样品的DNA；

步骤二、待测品种的引物扩增及电泳检测

以步骤一提取的待鉴定谷子样品的DNA为模板，并分别利用引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.20对待鉴定谷子样品的DNA进行PCR扩增；扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，检测鉴定谷子样品的DNA扩增条带，形成待鉴定谷子样品的SSR指纹图谱；

步骤三、分析待鉴定谷子样品的DNA图谱，并与32个DUS测试标准品种的SSR指纹图谱进行比较，进行谷子品种鉴定或者进行遗传多样性分析或者进行谷子基因型鉴定或者进行谷子育种材料遗传分类或者鉴定谷子自交系的遗传特征。

本发明所述的应用方法中的谷子品种鉴定的方法是首先编制以32个DUS测试标准品种为横坐标、以20对引物为纵坐标的DNA指纹图谱表；所述DNA指纹图谱表的构建方法为用不同的英文字母表示不同的条带，迁移率最大的标记为A，迁移率次之的标记为B，以此类推，无条带标记为“.”，并将标记记录在DNA指纹图谱表的相应位点中；

一一统计待鉴定品种在不同引物的扩增情况，采用与上述方法同样的方法建立SSR基因型信息数据库，

当寻找谷子品种的亲缘关系时，是将SSR基因型信息数据库与DUS测试标准品种的DNA指纹图谱相进行比较并聚类分析；

当鉴定两个谷子品种是否为同一品种时，则是比较两个谷子品种的SSR基因型信息数据库中各位点上的差异，差异引物数≥2，判定两个品种为不同品种；差异引物数＝1，判定两个品种为近似品种；差异引物数＝0，判定两个品种为相同的品种。

本发明基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱的应用方法中所述的遗传多样性分析的方法是：

利用POPGENE计算引物的等位基因数、基因多样性指数、多态性信息量；利用NTSYSpc2.1软件计算品种间的Dice遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。

上述电泳检测是在DYCZ-20D电泳槽核酸电泳系统中利用DYY-10C电泳仪进行处理；处理过程为取5ul样品，以ThermoScientificGeneRuler50bpDNALadder为DNA分子量标准，用2000W恒功率电泳1.5h。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

本发明的20对SSR引物在32个标准品种中扩增均匀、稳定，扩增条带清晰、多态性丰富，还提供了SSR指纹图谱在谷子品种鉴定中的应用。该指纹图谱能够比对谷子品种是否相同、相近或者不同，在谷子品种权权属纠纷中能够提供可靠证据。促进谷子遗传育种水平的提高和谷子产业的发展。

附图说明

图1为引物p32在32份谷子DUS标准品种中检测到的多态性；

图2为32份谷子DUS标准品种聚类分析结果图；

图3为30份谷子夏谷区试品种聚类分析结果图。

具体实施方式

基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱，该图谱是利用包含20对引物和32个DUS标准品种的谷子的DNA经扩增、电泳检测形成的32个DUS标准谷子品种的SSR指纹图谱，所述20对引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.1～SEQIDNO.20，如序列表所示(表1)，表1中包含了SEQIDNO.1～SEQIDNO.20的NameofSSRmarker(引物名称)、Primersequence(引物序列号)、Chromosoelocated(染色体位置)、Tm(℃)(退火温度)、Expectedsize(bp)(引物大小)；所述32个DUS标准品种为VARIDNO.1粱谷、VARIDNO.2张矮10、VARIDNO.3豫谷八号、VARIDNO.4红苗青、VARIDNO.5野谷5号、VARIDNO.6日本赤须、VARIDNO.7金苗谷、VARIDNO.8乌克兰、VARIDNO.9W67、VARIDNO.10红十里香、VARIDNO.11桃花米、VARIDNO.12红粉谷、VARIDNO.13延安大粒、VARIDNO.14阴天旱、VARIDNO.1575原406、VARIDNO.16W56、VARIDNO.17肯尼亚、VARIDNO.18蜡烛台、VARIDNO.19矮88、VARIDNO.20佛手水、VARIDNO.21W59、VARIDNO.22猫蹄谷、VARIDNO.23兔蹄谷、VARIDNO.24红粒谷、VARIDNO.25耧里莠、VARIDNO.26黑粘谷、VARIDNO.27冀谷5号、VARIDNO.28豫谷1号、VARIDNO.29安矮17、VARIDNO.30罗马尼亚5号、VARIDNO.31蒙早1号、VARIDNO.32红软谷，如表2所示。

本发明构建基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱的方法为：

步骤一、DNA提取

利用上述的32个谷子DUS标准品种的幼嫩叶片，按CTAB法分别提取每个谷子DUS标准品种的DNA；

步骤二、引物扩增及电泳检测

分别以步骤一提取的每个谷子DUS标准品种的DNA作为模板，并分别利用引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.20对每个谷子DUS标准品种的DNA进行PCR扩增；然后采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳检测，然后采用银染显色，形成32个谷子DUS标准品种的SSR指纹图谱。

步骤二中，在进行PCR扩增时所采用的PCR体系为：

2uL浓度为Mg²⁺plus的10×PCR缓冲液，2ul浓度为10mM的dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)，0.2ul浓度为5U/μl的rTaq酶，2ul浓度为100ng/μl的DNA模板，上下游引物各1ul，11.8ul去离子水。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，退火(Tm)1min，延伸1min，共扩增30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

步骤二中的电泳检测是将3ul的10×loadingbuffer加入到PCR扩增产物中,然后取5ul样品进行点样，以50bpDNAmarker为DNA分子量标准，在GT核酸电泳系统以2000W恒功率电泳1.5h。

所述银染显色是指使用2g/1000mlAgNO₃蒸馏水染色液对电泳后的PCR扩增产物进行3-4min染色，然后用浓度为15g/5ml/1000的NaOH/甲醛/蒸馏水显色液进行显色。

利用上述基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱的应用方法包括利用上述基于谷子DUS测试标准品种的SSR指纹图谱进行谷子品种鉴定、进行遗传多样性分析、进行谷子基因型鉴定、进行谷子育种材料遗传分类、鉴定谷子自交系的遗传特征等。其应用步骤如下。

步骤一、待鉴定样品的DNA提取

利用CTAB法提取待鉴定谷子样品的DNA；

步骤二、待测品种的引物扩增及电泳检测

以步骤一提取的待鉴定谷子样品的DNA为模板，并分别利用引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.20对待鉴定谷子样品的DNA进行PCR扩增；扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，检测鉴定谷子样品的DNA扩增条带，形成待鉴定谷子样品的SSR基因型信息数据库(SSR指纹图谱)；所述电泳检测是在DYCZ-20D电泳槽核酸电泳系统中利用DYY-10C电泳仪进行处理；处理过程为：取5ul样品，以ThermoScientificGeneRuler50bpDNALadder为DNA分子量标准，用2000W恒功率电泳1.5h。

步骤三、分析待鉴定谷子样品的DNA图谱，并与32个DUS测试标准品种的SSR指纹图谱进行比较，进行谷子品种鉴定或者进行遗传多样性分析或者进行谷子基因型鉴定或者进行谷子育种材料遗传分类或者鉴定谷子自交系的遗传特征。

具体的谷子品种鉴定的方法是通过比较待鉴定谷子样品的DNA图谱和32个DUS测试标准品种的SSR指纹图谱，并根据DNA分子量标准(参照50bpDNAmarker测量出的相对分子量)和引物的迁移率记录结果(迁移速率代表分子量大小)。谷子品种鉴定时首先编制以32个DUS测试标准品种为横坐标、以20对引物为纵坐标的DNA指纹图谱表。所述DNA指纹图谱表的构建方法为用不同的英文字母表示不同的条带，迁移率最大的(分子量最小的)标记为A，迁移率次之的标记为B，以此类推，无条带记为“.”，并将标记记录在DNA指纹图谱表的相应位点中。待鉴定谷子样品的分析方法是：一一统计待鉴定品种在不同引物的扩增情况，同样建立SSR基因型信息数据库。如果寻找品种的亲缘关系，可以与DUS测试标准品种的DNA指纹图谱相比较，进行聚类分析。

如果鉴定两个品种是否为同一品种，可以比较两品种的SSR基因型信息数据库中各位点上的差异，差异引物数≥2，判定两个品种为不同品种；差异引物数＝1，判定两个品种为近似品种；差异引物数＝0，判定两个品种为相同的品种。

进行遗传多样性分析时的分析方法是：利用POPGENE计算引物的等位基因数、基因多样性指数、多态性信息量；利用NTSYSpc2.1软件计算品种间的Dice遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。

下面结合实施例对本发明的基于谷子DUS测试标准品种开发的SSR指纹图谱及其应用方法进行说明。

一、谷子基因组DNA的提取

1、材料

从谷子核心种质材料中选取32份有代表性的DUS标准品种，开发的SSR指纹图谱的材料，这32份DUS标准品种如表2所示，用于SSR指纹图谱的构建及应用。表3是应用本发明进行分析鉴定的材料。

表2VARIDNO.1～32品种表

编号原序号名称编号原序号名称11601粱谷171614肯尼亚21602张矮10181615蜡烛台31603豫谷八号191616矮8841604红苗青201617佛手水51627野谷5号211618W5961605日本赤须221619猫蹄谷71630金苗谷231628兔蹄谷81631乌克兰241629红粒谷91632W67251620耧里莠101607红十里香261621黑粘谷111608桃花米271633冀谷5号121609红粉谷281622豫谷1号131610延安大粒291623安矮17141611阴天旱301624罗马尼亚5号15161275原406311625蒙早1号161613W56321626红软谷

表3应用本发明开发的SSR指纹图谱进行分析鉴定的材料

编号名称编号名称1冀谷1916济05062济0601-617郑07-13京谷750518安07-41174安10-417219沧3725安09-852520保2003026H33221保2137C25822安0F-45858衡20047523冀谷319保7692446-②10M15082548-②11航谷8号26航天乳谷

编号名称编号名称12衡090227沧36913沧31828晋谷28号14k117429冀谷2515201022230晋谷46号

2、CTAB法提取基因组DNA

采用CTAB法提取谷子DNA，具体步骤如下：

2.1、对所有参试谷子材料(包括表2中的所有32中谷子品种和表3中的参试品种)进行发芽培养，在两叶一心期时提取每种参试谷子的DNA。

2.2、在两叶一心期时剪取适量叶片，将每种参试品种分别置于不同的1.5ml离心管中，磨碎，加入65℃预热的500ul的CTAB提取液，摇匀。所用的CTAB提取液的配方如下表4。

表3CTAB提取液的配方(200ml)

2.3、在水浴锅内于65℃裂解40～60min，期间温和混匀几次(每隔15～20min混匀一次)。

2.4、从水浴锅中取出后，加入500ul氯仿与异戊醇的混合液(氯仿与异戊醇体积比为24:1)，涡旋混匀，静置20min，4℃×12000rpm×10min进行离心，取上清液。

2.5、离心后，取上清液加入到新离心管中。

2.6、在盛有上清液的离心管中加入预冷异丙醇(此时不要混入氯仿)，缓慢摇匀后再猛烈混匀，-20℃过夜，此时能够析出DNA。

2.7、将低温过夜析出的DNA离心，4℃×12000rpm×10min。

2.8、去掉上清，将沉淀物用500ul75％乙醇清洗两次。

2.9、4℃×12000rpm×5min再次离心，放入通风橱中彻底挥发除去乙醇。再将DNA溶于50ulddH₂O(双蒸水)中，放置4℃冰箱使其充分溶解。

3、利用紫外分光光度计检测DNA浓度。

4、稀释DNA浓度至100ng/ul。

5、PCR反应

5.1、PCR反应体系(20ul)：2uL10×PCRbuffer(Mg²⁺plus)，2uldNTPs(10mM)，0.2ulrTaq酶(5U/μl)，2ulDNA模板(100ng/μl)，上下游引物各1ul，11.8ul去离子水。其中dNTP指三磷酸碱基脱氧核苷酸，dNTPs是三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP的组合。

2)PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，退火(Tm)1min，延伸1min，共扩增30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

(6)PCR产物的检测

6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)。

100ml6％的变性凝胶电泳工作液：40％丙烯酰胺胶300ml，尿素840.84g，10×TBE200ml，蒸馏水定容至2000ml。

以50bp(basepair，碱基对；1bp＝1碱基对)的DNA为对照比较扩增产物的分子量大小，电泳缓冲液为0.5×TBE，220V恒压90分钟。

银染步骤

染色液：4gAgNO₃溶于2000ml蒸馏水；

显色液：30gNaOH，10ml甲醛，溶于2000ml蒸馏水；

染色：将带有凝胶的平板置于染色液中进行染色3-4min；

显色：将染色后的平板用蒸馏水清洗后，放入显色液中进行显色，待出现明显的条带时取出电泳时凝胶的载体玻璃板(平板)；

试验结果：

根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率相同的记为A、B、C……等等，无条带记为“.”，建立供试材料SSR基因型信息数据库。

利用20对SSR引物对32份谷子DUS标准品种和30份谷子区试品种DNA进行扩增，最终选取带型清晰、且有多态性的20对引物统计结果(见表5)。这20对SSR引物分布在谷子9条不同的染色体上，构建DNA指纹图谱。比较各引物位点差异发现任意两个品种的DNA指纹图谱都不相同。

表532份材料的DNA指纹图谱

利用popgene软件计算引物位点的等位基因数(Na)、基因多样性指数(He)、多态性信息量(PIC)。表6为20对引物对32份DUS标准品种基因多样性分析结果，在32份谷子DUS标准品种中，20个SSR标记共检测出189个等位基因，每个位点检测出等位基因数至多为22个，平均每个位点9.45个。

表620对引物对32份DUS标准品种基因多样性分析结果

利用PopGene软件计算引物位点的等位基因数(Na)、基因多样性指数(He)、多态性信息量(PIC)。表7为20对引物对30份夏谷区试品种基因多样性分析结果，其中引物的多态性信息量(PIC)变化范围是0.5689～0.9440，平均为0.78464，其中PIC值在0.8000以上的引物有9对，这表明能检测到丰富的遗传变异。图1为引物p32在32份谷子品种中的SSR指纹带型图谱。

表720对引物对30份夏谷区试品种基因多样性分析

Locusna*ne*I*PICMP4422.000018.69233.01970.9440SIMS11911.00008.00952.21670.8628SIMS0177.00004.12841.59970.7218P804.00002.61331.10760.5582P618.00005.88111.93230.8114P5810.00007.75862.16680.8583

Locusna*ne*I*PICP3210.00008.49062.21170.8705P2013.00007.85982.29720.8612b1098.00005.29411.80990.7850b1428.00004.55811.75710.7528b15910.00006.33802.03760.8245b1657.00004.47241.69800.7480b1699.00004.63921.77510.7549b18014.00009.18372.43880.8827b1857.00004.78721.70800.7613b1898.00005.42171.83680.7906b24710.00005.49671.93280.7952b25812.00008.65382.32290.8745b2636.00003.28471.47520.6662b2695.00002.61291.18780.5689Mean9.45006.40881.926615.6928St.Dev3.89973.51310.44060.78464

利用NTSYS软件计算谷子各品种间的Dice遗传相似系数，然后基于相似系数矩阵，利用SHAN子程序按照UPGMA算法进行聚类分析。聚类分析结果见图2，图3。

32份谷子DUS标准品种间遗传相似系数(GS)值变动于0.82～0.97之间。

表1序列表SEQIDNO.1～20(本试验所用引物详细信息)