一种应用线粒体COⅠ序列片段鉴别驴皮与混伪品的方法及其扩增特异性引物

摘要

本发明公开了一种应用线粒体COⅠ序列片段鉴别驴皮与混伪品的方法及其扩增特异性引物，属于中药鉴定技术领域。本发明利用自主设计的引物扩增驴皮与混伪品的CO？I序列，并通过PCR产物在凝胶电泳中扩增条带的有无区分驴皮与猪皮或牛皮，以及对多种来源的驴皮与常见混伪品线粒体COⅠ序列片段进行序列拼接、比对、通过K2P距离法直观鉴别驴皮及其常见混伪品，本法方便快捷、正确率高，可以很好地保证阿胶及驴皮药材的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术领域，具体涉及一种应用线粒体COⅠ序列片段鉴别驴皮与混伪品的方法及其扩增特异性引物。

背景技术

驴皮是制作阿胶的主要原料，但由于货源紧缺，市场上时常出现伪皮。常见的伪皮主要是马皮、骡皮等，马皮功能杀虫止痒，骡皮不药用，一旦混入驴皮势必严重影响阿胶的质量。驴皮在国家现行药典中不载，为避免与其它动物皮张相混，《山东省中药材标准》(2010版)规定驴皮必须为驴的整张干燥皮或鲜皮，碎皮不得药用。因此，寻找简便、准确的鉴别方法，是保证驴皮药材质量、充分利用驴碎皮资源的有效途径。目前驴皮及其混伪品的鉴别主要采用外观的经验鉴别方法，这种方法对于碎的混杂皮鉴别难度较大，因此急需一种快速、准确、没有假阳性的鉴别方法加以补充。DNA条形码(DNABarcoding)是一种新兴的生物分类学技术，是近年来国际上生物多样性研究的热点，其核心是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的身份识别系统^[77]。其简便高效，不受样品的形态性状以及研究者的专业水平限制的特点使其在中药材的真伪鉴定中发挥了重要作用^[1,2]。目前国内的DNA条形码在中药材的物种鉴别中的应用，主要集中在植物领域^[3-6]。动物的DNA条形码序列是由Hebert等于2003年提出的，线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(MtCOI)这一特定基因的特定区段被选作DNA条形编码的基础，并且已确定其在动物鉴定中的作用，Hebert等^[7,8]对动物界11个门13320个物种的研究结果显示，线粒体COI基因对动物界刺胞动物门以外的物种存在显著的序列变异，能较好的区分物种，随后COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因^[8]。研究表明，动物的DNA条形码COI基因可以鉴别出95％以上的物种^[9-11]。中药材中动物的真伪鉴别的报道较少^[114]，尚无利用COI序列来鉴定驴皮与其混伪品的相关研究报道。另外，不同品种驴的外形及生物学特性差异较大，驴皮的产量与质量也有明显差别，研究不同品种驴皮的区分方法，对于合理控制驴皮药材质量也是非常重要的问题。

发明内容：

为解决现有技术中存在的缺陷，本发明旨在提供一种应用线粒体COⅠ序列片段鉴别驴皮与混伪品的方法及其扩增特异性引物，本发明利用自主设计的引物扩增驴皮与混伪品的COI序列，并通过PCR产物在凝胶电泳中扩增条带的有无及对多种来源的驴皮与常见混伪品线粒体COⅠ序列片进行序列拼接、对比、建立NJ系统进化树来直观的对驴皮及其常见混伪品进行鉴别，确定了一种应用线粒体COI序列片段鉴别驴皮与其混伪品的方法，从而保证阿胶及驴皮药材的质量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于扩增驴皮与混伪品基因或片段的特异性引物，其编码序列为：

正向LVCOIF：5′-TCCTCTTCTTATCAAGTCCTGTGG-3′，如SEQIDNO.1所示；

反向LVCOIR：5′-TGCTTCTCACAGACCGTAACTT-3′，如SEQIDNO.2所示。

一种PCR法区分驴皮与混伪品的方法，按照以下步骤进行：

1)提取待测样品的总DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模版，使用权利要求1所述扩增引物进行PCR扩增反应；

3)通过对步骤2)中的PCR产物进行电泳，观察待测样品是否有扩增出阳性扩增条带，并进行如下判定：若待测样品没有扩增出阳性扩增条带，则待测样品为猪皮或牛皮而非驴皮；若待测样品扩增出阳性扩增条带，则待测样品为驴皮或马皮。

本发明还具有以下附加技术特征：

优选的，所述混伪品为猪皮或牛皮。

优选的，所述PCR反应体系为：MgCl₂(25mM)2μL、dNTPMixture(2.5mM)2μL、PCRbuffer(10×)2.5μL、正、反向引物(2.5μM)各1.0μL、TaqDNA聚合酶0.2μL、总DNA1μL，用ddH₂O补至25μL。

优选的，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。

优选的，上述步骤1)所述待测样品包括DNA含量含少以及片段破坏严重的样品。

优选的，上述步骤1)所述待测样品包括干燥皮或其毛发，其提取总DNA的方法分别为：

1)干燥皮总DNA提取方法：取待测样品干燥皮，用动物组织DNA提取试剂盒提取；

2)毛发总DNA提取方法：用DDT和/或蛋白酶K消解后，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取。

优选的，干燥皮与毛发总DNA的提取方法分别为：

1)干燥皮总DNA提取方法：取待测样品的干燥皮，用DDT消解后，使用动物组织DNA提取试剂盒提取；

2)毛发总DNA提取方法：用DDT和/或蛋白酶K消解后，使用TIANampMicroDNAKit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取。

本发明还提供一种应用线粒体COⅠ序列片段鉴别驴皮与混伪品的方法，其为用K₂P距离法鉴别驴皮与混伪品的方法。

优选的，所述K₂P距离法为选择所述驴皮与混伪品线粒体基因5345-5983bp区间的片段进行分析。

优选的，驴种内遗传距离为0-0.018％，驴与混伪品种间遗传距离为0.057-0.245％，判定方法为：对驴皮与待测样品进行K₂P距离分析，若K₂P距离范围为0-0.018％，则待测样品为驴皮，若K₂P距离范围为0.057-0.245％，则待测样品为混伪品。

本发明与现有技术相比的有益效果如下：

1)自主设计了适合驴和马的COI基因专属引物

根据国际动物DNA条形码组织公布有通用引物应用与本研究中，发现通用引物并不适合阿胶源鉴定中采用的具有特殊性的样品，如干燥皮或毛发样品，因此本发明中自主设计了扩增引物，驴皮的扩增效率达到100％。驴皮的混伪品中常见的是马皮、牛皮和猪皮。本发明中自主设计的家驴COI基因的专有扩增引物，与家驴的基因完全吻合，而马与驴是同一母系，线粒体基因又是母系遗传，因此对马的基因有很好的扩增效果。而牛和猪的COI基因与驴的差异位点较多，无法实现特异性扩增，其扩增效率为0％，因此该引物可以有效地区分驴及牛、猪的基因。在DNA提取过程中发现无论是干燥皮张还是毛发，其中的DNA含量均甚微，通过紫外吸收检验和总DNA凝胶电泳其质量均较差，但是在PCR扩增过程中发现，尽管DNA含量少，只要引物合适，扩增体系和扩增条件适宜，仍可以获得适于测序的理想的扩增产物。

2)建立了提取动物干燥皮张和毛发DNA的方法

动物组织DNA提取试剂盒具有操作简单，提取效率高的特点，可以省去溶液配制的麻烦，但用于阿胶源鉴定中的待测样品如干燥皮或毛发时，由于干燥皮张降解严重，毛发中的DNA含量少，DNA提取效果并不好，本发明对外售的试剂盒进行改进，在提取DNA前使用DDT和/或蛋白酶K对待测样品降解后再用试剂盒提取DNA，获得了理想的DNA提取效果。

3)建立了家驴与其他产胶哺乳动物的聚类树

通过对测得的COI序列片段比对，建立驴与其他产胶哺乳动物的K₂P进化树，家驴与马、牛、猪等分别位于不同的分支上，因此可以很好地将其与其它的产胶哺乳动物区分开。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为PCR产物凝胶电泳图谱，其中：

1阴性对照；2德州驴(毛发)；3德州驴(皮张)；4庆阳驴(毛发)；5疆岳驴(毛发)；6华北驴(毛发)；7关山驴(毛发)；8关山驴(皮张)；9广灵驴(毛发)；10加米驴(毛发)；11泌阳驴(毛发)；12晋南驴(毛发)；13埃及家驴(皮张)；14中国家驴随机(皮张)；15蒙古马(毛发)；16中国家马随机(皮张)；17奶牛(毛发)；18家牛随机(毛发)；19家猪(皮张)。

图2为家驴线粒体基因COI序列片段的测序峰图。

图3为家驴与其它哺乳动物基于COI序列片断的聚类树。

具体实施方式

以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。

实施例1

1实验材料

实验所用材料包括干燥驴皮、驴毛、马皮、马毛、牛皮、牛毛及新鲜的猪皮。其中驴皮由山东东阿阿胶有限公司提供，分别为阜新养殖基地养殖驴皮、国内各市场收购的混杂驴皮以及国外收购的埃及家驴皮；马皮和牛皮为山东东阿阿胶有限公司收购时剔除的混杂皮；驴毛、马毛、牛毛均为活体取样；新鲜猪皮，购自超市。各样品均经山东中医药大学张永清教授鉴定，确认分别为马科动物驴(Equusasinus)、马(Equuscaballus)和牛(Bostaurus)的干燥皮和毛发，以及猪(Susscrofa)的新鲜皮。各种样品来源及取样数量见表1，其中驴毛的采样地点及其在全国的分布情况见图1。

表1实验材料和来源

2实验方法

2.1DNA提取方法

2.1.1DNA提取的组织来源

在生物实验中，动物DNA的提取通常采用动物的血液或组织器官，包括内脏器官以及肌肉组织等作为试验样品。而在阿胶的生产企业中，采用的原料主要是干燥或新鲜的驴皮，因此无论是进行原料的质量控制还是实验研究，驴皮都是首选的材料。故本研究将干燥的驴皮做为部分实验材料，探索DNA的提取方法。

另外由于组织器官的取样尤其是活体取样的局限性，为大样本的实验分析带来一定难度，而驴毛样品简便易得，且运输携带方便，不受存储时间和保存温度的影响，为活驴样本的取样带来很大的便利。而驴毛中的DNA含量甚微，据报道驴毛毛干中只含有线粒体DNA，毛囊中既含有线粒体DNA也含有核DNA，而一般情况下含有毛囊的毛发大多是在活体或者是带毛的皮张中获得。本研究选取的是线粒体中的细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(mtCOI)的基因片段，不论是毛干还是毛囊均可以作为实验材料。

2.1.2样品的前处理

2.1.2.1驴皮样品

由于驴皮样品是干燥的，含水量低于15％，皮张坚韧，DNA降解严重，因此对皮张进行适当的处理，保证在DNA提取过程中消化完全，是非常关键的。同时要防止样品间的相互交叉污染，防止在后续的PCR过程中出现非特异性扩增。具体的处理方法如下：剪取一小块带毛驴皮，用自来水洗去表面灰尘污垢，用去离子水冲洗三次，用95％乙醇浸泡三次，自然晾干。用灭菌处理过的手术剪刀将表面的毛发剪去，用一干净灭菌的刀片将皮张四周边缘的污染层切去，再换另一干净灭菌的刀片切下厚度不超过2mm的薄片，切成大小不超过2mm×2mm×2mm的碎块，备用。在操作过程中要保证周围的台面清洁，所用的器具均经过高压高温灭菌处理，且每换一个样品均要更换一次性灭菌手套。

2.1.2.2驴毛样品

对于活体取样的驴毛，主要选取驴鬃毛部位，用镊子拔取，阳光下毛囊清晰可见。首先用去离子水浸泡清洗三次，去掉外表的污垢，毛囊部分不能沾染其他杂质，用95％乙醇浸泡三次，自然晾干。分别对毛囊和毛干部分进行DNA提取，考察驴毛的部位和用量的影响。

2.1.3DNA的提取

准确称取驴、马、牛的干燥碎皮30mg，采取动物组织DNA提取试剂盒(Tiangen，北京)，按照说明书规定的程序提取DNA，由于干燥碎皮失水过多，皮张较硬，因此，在提取DNA前需用DDT或蛋白酶K对干燥碎皮进行消解，即向每个样品加入蛋白酶K或20μL1MDDT，消解过程中可以适量增加消解液的用量或者延长消解时间，直至干燥皮张完全消解后提取DNA，将提取的DNA保存在-20℃的冰箱中，以防DNA降解。

毛发样品，用TIANampMicroDNAKit血液/细胞/组织基因组提取试剂盒(TiangenBiotechCo.)进行DNA提取，在提取DNA前需用DDT或蛋白酶K对毛发进行消解，以获得理想的提取效果。每个样品加入20μL1MDDT，恒温消化过夜。次日如样品中仍有未消解的毛发，可适当延长消解时间，或添加少量蛋白酶K，直到消解完全，溶液中没有悬浮物。将提取的DNA保存在-20℃的冰箱中，以防DNA降解。

2.2DNA的质量检测

2.2.1紫外吸收法

将DNA提取液适当稀释后，用紫外分光光度计测定DNA在260nm和280nm下的吸光度A₂₆₀和A₂₈₀，DNA纯制品的A₂₆₀：A₂₈₀比值应为1.8，如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A₂₆₀：A₂₈₀比值将降低。

2.2.2琼脂糖凝胶电泳法

总DNA提取液采用0.8％的琼脂糖电泳，溴化乙锭显色，凝胶成像系统观察并拍照。

2.3PCR扩增

2.3.1引物设计

前期的预实验中采用从CCDB网站和其它文献资料上获得到动物性药材COI基因PCR扩增的通用引物：

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，如SEQIDNO.3所示；

HC02198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，如SEQIDNO.4所示，

进行PCR扩增，通过不断改变扩增体系和扩增程序进行尝试，均未获得成功。可能原因是该引物和哺乳动物的COI基因的匹配度低，另外我们采用的样品中皮张的DNA降解严重，毛发中的DNA含量甚微，导致扩增失败。

因此根据Xu等已经发表的欧洲驴线粒体DNA全序列，采用PrimerPremier5.0进行引物设计，正向LVCOIF：5′-TCCTCTTCTTATCAAGTCCTGTGG-3′，如SEQIDNO.1所示；反向LVCOIR：5′-TGCTTCTCACAGACCGTAACTT-3′，如SEQIDNO.2所示，扩增位于线粒体5279-6000bp区间的722bp片段长度。

2.3.2反应体系

反应体系为MgCl₂(25mM)2μL、dNTPMixture(2.5mM)2μL、PCRbuffer(10×)2.5μL、正反向引物(2.5μM)各1.0μL、TaqDNA聚合酶0.2μL(BiocolorBioScience&TechnologyCo.)、总DNA约1μL(～30ng)，其余用ddH₂O补至25μL。

2.3.3反应条件

PCR扩增反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。

2.4PCR产物纯度检测

采用0.8％的琼脂糖电泳，溴化乙锭显色，凝胶成像系统观察并拍照。

2.5DNA测序

PCR扩增产物使用ABI3730XL测序仪(AppliedBiosystemsCo.)双向测序。

2.6DNA测序分析并构建系统进化树

数据测序峰图利用CodonCodeAlignerV2.06(CodonCodeCo.)校对拼接，去除引物区，获得变异位点较多的长度为627bp的样品序列，位于线粒体5345-5983bp区间的片段长度。对于从Genbank获得的COI序列或线粒体全基因序列，采用CodonCodeAlignerV2.06软件，与拼接好的样品序列比对后，去除与样品序列相对应的627bp以外的区段，获得最终序列。将所有序列用软件MEGA5.0软件比对并进行遗传距离等分析，用NJ(邻接)法对比对的序列构建系统聚类树，利用bootstrap(1000次重复)检验各分支的支持率，引用genebank中20条哺乳动物COI基因相同区段的序列数据，分别为：1条家驴序列Aquusasinus(NC_001788.1)；1条蒙古野驴Equushemionus序列(HM118851)；1条索马里野驴Equusasinussomalicus序列(AP012271)；3条家马Equuscaballus序列(EF597512、EF597513、EF597514)；2条蒙古野马Equusprzewalskii序列(JN398402、JN398403)；1条家牛BosTaurus序列(HQ184045)；3条家猪Susscrofa序列(NC_014692、DQ518915、DQ534707)；4条斑马序列Equusgrevyi(JX312725)、Equusburchellii(JX312733)Equuszebra(JX312717、JX312724)；2条绵羊Ovisaries序列(HE577848、NC_001941)；1条山羊序列Caprahircus(GU229280)和1条美洲野牛Bisonbison序列(GU947006)。

2.7序列提交

将获得的用于建树的627bp的中国家驴和家马的线粒体DNACOI序列提交到GenBank，获得登录号。

3结果与分析

3.1总DNA质量检测

3.1.1紫外吸收值比较

紫外吸收数据显示，绝大部分DNA的A₂₆₀:A₂₈₀比值(A260/A280)在0.95-2.46之间，不在1.8附近，说明总DNA的质量差异较大，但这不能成为衡量是否可以作为后续扩增模板的依据，最终要看PCR扩增后的DNA的质量。

3.1.2总DNA电泳图谱

经过凝胶电泳分析，所提取的总DNA电泳图谱均呈不同程度的弥散状态，说明获得的DNA降解严重，只能获得DNA的不同程度降解后的DNA片段。

3.2PCR产物电泳图谱

从PCR产物的凝胶电泳图谱(如图1所示)可以看出，驴和马的皮张与毛发均能获得长度约为720bp的较亮的条带，而奶牛和家牛的毛发、皮张和猪的皮张样品均未获得扩增条带。

3.3PCR扩增效率

实验共采用101个家驴样品扩增其线粒体COI基因片段，其中包括30个皮张样品，81个毛发样品，扩增效率100％。同时采用20个中国家马样品扩增其线粒体COI基因片段，其中包括10个张样品，10个毛发样品，扩增效率100％。实验还选取5个奶牛的毛发样品、5个家牛的皮张样品和10个家猪的皮张样品，采用同样的方法提取总DNA，PCR扩增，扩增效率0％。说明该引物对马和驴的样品具有专属性，而对牛和猪的样品不适用。因此，可以依据PCR扩增结果初步将牛皮、猪皮样品与驴皮、马皮区分开，驴皮和马皮样品需要通过PCR产物测序结果进行进一步的区分鉴别。

3.4测序结果

驴、马的毛发和皮张样品的COI序列片段测序成功率达到100％，且均获得质量较好的峰图，如图2所示。序列中没有碱基的插入和缺失。

3.5种内种间变异分析

种内A+T比例为54.7％，G+C比例为45.3％，样品的COI序列片段与参考序列(如SEQIDNO.5所示)比对后长度为627bp，种内序列变异位点有15处，均为T-C、A-G变异，没有插入和缺失。种间序列变异位点共208处。

3.6家驴的单倍型分析

通过序列分析发现家驴线粒体基因的COI序列的627bp片段共获得8种单倍型，Haplotypediversity是0.6354。其在各个驴品种中的分布频率如表2所示，可见Hap1(如SEQIDNO.5所示)和Hap2(如SEQIDNO.6所示)是两种主要的单倍型，分别占全部101个样品的40.59％和44.55％。其次是Hap3(如SEQIDNO.7所示)占样品总数的7.92％，而Hap5(如SEQIDNO.9所示)占样品总数的2.97％。

表2家驴线粒体基因COI序列片段的单倍型在不同品种内的分布

3.7遗传距离分析

家驴与其混伪品COI序列片段比对后长度为627bp。种内最大遗传距离为0.018，平均遗传距离为0.005，种间最小遗传距离为0.057，种间平均遗传距离为0.135。理想的DNA条形码序列应当具有明显的种间变异，同时种内变异足够小。通过对家驴及近缘哺乳动物序列的种内变异、种间变异、种间最小变异和种内最大变异分析发现，COI序列能够满足这一条件，且种间最小变异明显大于种内最大变异。因此，基于COI序列的K₂P距离法可以用来鉴定驴皮及其混伪品，参见表3、表4、表5。

表3种内种间K₂P距离

3.8聚类分析

为了进一步确认COⅠ序列在驴皮及其混伪品中的鉴定能力，建立了基于K₂P模型的NJ系统发生树(bootstrap1000次重复)，如图3所示。从NJ树可以看出，家驴的8个单倍型聚为一支，支持率为83。整个树从根部分化为两支，家驴与不同属的马聚为一大支，猪和牛聚为一支，所以用NJ法构建的基于COI序列序列的系统发生树可以区分开家驴及其混伪品。

3.9序列提交

将101条家驴、20条家马的COI基因627bp序列提交到Genbank，获得的登陆号KC693987-KC694107，这些序列数据将为建立家驴的COI基因数据库提供第一手资料。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

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