由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法

摘要

本发明涉及一种由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法,包括海洋微生物菌株Y112粗酶液的制备、乙醇分级沉淀、凝胶层析和DEAE-Sepharose离子交换层析,制备α-环糊精葡萄糖基转移酶产品单一纯度高,纯度提高了12.4倍，回收率为57.5％。将在医药、食品、化工、化妆品、工业和农业以及分析化学等方面得到广泛的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种由海洋微生物菌株Y112制备α- 环糊精葡萄糖基转移酶的方法。

背景技术

环糊精(cyclodextrin，缩写CD)是由α-1,4-糖苷键相连而成的，环状的，无 还原端的麦芽低聚糖。环糊精通常由6、7或8个葡萄糖残基组成，分别被称为α-、 β-、或γ-环糊精。除了这三种常用的环糊精外，还有δ-、ε-、ζ-和η-环糊精 (分别由9～12个葡萄糖单元组成)。环糊精具有能够将多种化学物质全部或部分封 装入空腔内的能力，从而改变了这些化合物的物理和化学性质。环糊精是由环糊精 葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉转化而成，主要产物为α-、β-、γ-环糊精。 由于环糊精分离提纯工艺非常复杂，因此寻找能催化产生特定环糊精的CGTase的产 生菌非常重要。目前，研究报道主要集中在β-CGTase产生菌株上，而有关α-、 γ-CGTase产生菌的研究报道却很少。几乎很少有主要产α-或γ-环糊精的CGTase 报道。枯草芽孢杆菌BacillussubtilisNo.313、嗜碱芽孢杆菌Bacillusstrain 290-3、芽孢杆菌Bacillussp.AL-6和短杆菌Brevibacteriumsp.No9605是目 前已知的产γ-CGTase的菌株。

目前环糊精的制备主要是采用酶法合成的，化学合成法并不常用，而酶法制备 会产生多种环糊精的混合物，不利于单一环糊精的分离纯化，这极大限制了环糊精 的应用。因此，成为当今世界开发寻求一种能够生产特定单一环糊精的CGTase的生 产菌，降低环糊精分离纯化成本所关注的焦点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术酶法产生多种环糊精的混合物的不足,经发明 人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践,开发提供一种新的由海洋微生 物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法。

本发明提供一种新的α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法,包括下列步骤：

1、由海洋微生物菌株Y112制备粗酶液

在三角瓶中装种子培养基液30mL接种海洋微生物菌株Y112后，30℃、200 r/min下活化22h，以4％(V/V)的接种量接种至装有25mL发酵培养基的三角瓶中， 27℃、230r/min培养50h，收集发酵液在10000g的离心力条件下离心15min， 上清为粗酶液。

所述种子培养基的组成：每升培养基含可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸 粉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.15g，NaCl50g，121℃灭菌20min。所述发 酵培养基的组成：每升培养基含玉米淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.15g，NaCl50g，121℃灭菌20min。

本发明中酶活的测定采用甲基橙褪色法。该酶活单位定义为上述条件下生成1 μgα-环糊精所需的酶量。

生物量的测定：采用比浊法测定生物量。

蛋白含量的测定；蛋白浓度的测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

2、乙醇分级沉淀

一级沉淀：向步骤1的粗酶液中徐徐加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数为 20％—40％，优选为40％，静置，离心取上清液，上清液的酶比活力最高，纯化倍数为 1.25，回收率为95.5％。

二级沉淀：向一级沉淀得上清液中继续加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数 为40％-55％，优选为40％-50％，静置，离心，待沉淀风干后用磷酸缓冲液溶解成溶液， 纯化倍数为3.42，酶活回收率为90.1％。

3、凝胶层析

先用pH7.2磷酸钠缓冲液平衡Superdex200分子筛层析柱(如2.6×60cm)，将 步骤2得到的酶液上样，然后用相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，得到若干 洗脱峰，其中只有主峰有活性，对其进行收集浓缩，测定总酶活力及总蛋白含量。

4、DEAE-Sepharose离子交换层析

先用pH7.2磷酸钠缓冲液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱(如1.6×10cm)， 将步骤3得到的酶液上样，然后用含0～1mol/L的相同缓冲液进行线性梯度洗脱， 流速为2mL/min，得到三个洗脱峰，其中穿透峰较小无活性，仅第二洗脱峰有活性， 对其进行收集浓缩，测定总酶活力及总蛋白含量。

SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳采用10％分离胶和5％浓缩胶，控制恒定电压160V。对纯化过程中 的样品进行适当浓缩，选用10％的分离胶进行SDS-PAGE，结果显示呈现单一的条带, 说明本发明由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶方法得到的α-环 糊精葡萄糖基转移酶产品单一纯度高。

本发明由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶结果列于下表

本发明提供一种新的由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的 方法中,由菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶得到的α-环糊精葡萄糖基转移 酶产品单一纯度高,纯度提高了12.4倍，回收率为57.5％。

本发明提供一种新的由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的 方法中,所述产α-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112来自黄海海域的一 株产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112,其16SrDNA序列长度约1420bp左右。经 过16SrDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌株被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。该产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112于2015年7月13日保藏于中国武汉 中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCCNO：M2015447。

海洋微生物菌株Y112的形态和生理生化特征：

菌株Y112的形态特征：

菌株Y112为不规则短杆状，革兰氏阳性，菌落在琼脂培养基上呈现圆形，乳白 色，表面平坦、边缘不整齐。

菌株Y112生理生化特征：

菌株Y112能在pH8.0-11.0的条件下生长，最适生长pH为10；生长的温度范 围为10-45℃，最适生长温度33℃；最高能耐受16wt％的NaCl，在含有5％wtNaCl 条件下生长量最高。菌株Y112能够分解淀粉、明胶、Tween40或Tween60，不能 分解Tween20。氧化酶、过氧化酶或硝酸盐还原结果为阳性，硫化氢、吲哚产生试 验结果为阴性。菌株Y112还能够利用精氨酸、柠檬酸、尿素或蔗糖，不能利用赖氨 酸、鸟氨酸、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李醇或阿拉伯糖。

本发明提供一种新的由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的 酶学特性为：1、海洋芽孢杆菌Y112所产的环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性较好， 在弱碱性坏境条件下很稳定。α-CGTase分子量为90kDa，最适pH为8.5，最适反 应温度为55℃；在pH7.0-9.0和45℃以下稳定；Ag⁺会使α-CGTase完全失活， Mn²⁺、Mg²⁺对酶活性有一定的促进作用；根据Hanes-Woolf作图法，求得α-CGTase 以可溶淀粉为底物的米氏常数Km为5.5g/L，V_max＝0.25μmol/L/min。

本发明提供一种新的由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的 方法特点：由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶产品单一纯度高, 纯度提高了12.4倍，回收率为57.5％。将在医药、食品、化工、化妆品、工业和农 业以及分析化学等方面得到广泛的应用。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列 实施例。

实施例1—由海洋微生物菌株Y112制备α-CGTase

1、粗酶液的制备

在250mL三角瓶中装种子培养基液30mL接种海洋微生物菌株Y112后，30℃、 200r/min下活化22h，以4％(V/V)的接种量接种至装有25mL发酵培养基的三角瓶 (250mL)中，27℃、230r/min培养50h，收集发酵液在10000g的离心力条件下 离心15min，上清即为粗酶液。

所述种子培养基的组成：每升培养基含可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸 粉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.15g，NaCl50g，121℃灭菌20min。所述发 酵培养基的组成：每升培养基含玉米淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.15g，NaCl50g，121℃灭菌20min。

2、乙醇分级沉淀

一级沉淀：向步骤1的粗酶液中徐徐加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数为 40％,静置，离心取上清液，上清液的酶比活力最高，纯化倍数为1.25,回收率为95.5％。

二级沉淀：向一级沉淀得上清液中继续加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数 为40％-50％,静置，离心，待沉淀风干后用磷酸缓冲液溶解成溶液,纯化倍数为3.42， 酶活回收率为90.1％。

3、凝胶层析

先用pH7.2磷酸钠缓冲液平衡Superdex200分子筛层析柱(如2.6×60cm)，将 步骤2得到的酶液上样，然后用相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，得到若干 洗脱峰，其中只有主峰有活性，对其进行收集浓缩，测定总酶活力及总蛋白含量。

4、DEAE-Sepharose离子交换层析

先用pH7.2磷酸钠缓冲液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱(如1.6×10cm)， 将步骤3得到的酶液上样，然后用含0～1mol/L的相同缓冲液进行线性梯度洗脱， 流速为2mL/min，得到三个洗脱峰，其中穿透峰较小无活性，仅第二洗脱峰有活性， 对其进行收集浓缩，测定总酶活力及总蛋白含量。

由菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶得到的α-环糊精葡萄糖基转移酶产 品单一纯度高,纯度提高了12.4倍，回收率为57.5％。