一种中药组合物在制备治疗放射性肺损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种中药组合物在制备治疗放射性肺损伤药物中的应用。本发明中药组合物主要由连翘、金银花、板蓝根、大黄、广藿香、绵马贯众、红景天等组成，发挥复方中药的整体调节优势，祛除病邪、缓解症状、调节免疫的有机结合，临床实验证实对治疗放射性肺损伤具有显著疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药组合物在制备治疗放射性肺损伤药物中的应用，属于中草药领域。

背景技术

放射性肺损伤（radio-pulmonarylesion）是由于对胸部的恶性肿瘤进行放射治疗引起的并发症，最多见于对肺癌、乳腺癌，其次是对食管癌、纵隔恶性肿瘤的放疗。常见的临床表现为有：患胸部恶性肿瘤接受放射治疗的病史及相关的呼吸道症状，症状—般可在放疗开始后4~16周出现，多数在放疗结束后2~4周内发生，少数在放疗结束半年内也可发生，主要为干咳、少痰、吞咽困难、胸闷、胸痛，严重者呼吸困难、低热、血白细胞正常，抗菌治疗无效，急性期接受照射的肺野闻及湿性哕音，呼吸音粗糙；慢性期局部叩诊呈浊音，呼吸音低或闻及细湿哕音。检查方法主要有：胸部X线检查，（1）早期放射性肺炎：放疗早期致肺部充血及渗出改变，在放射的相应部位出现纹理增多和小片状影，边缘较模糊，严重时逐渐互相融合。（2）肺纤维化：放射区域出现放射性肺炎，部分经治疗吸收，但部分病人后期出现明显的纤维化，呈现放射区肺纹理粗乱、密集，纤维收缩，牵拉邻近组织移位，如纵隔和气管向病侧移，横膈上拉，肋间隙变窄，肺容积缩小等。健康区域代偿性肺气肿。（3）其他改变：在纵隔区放射致放射性纵隔炎，表现纵隔增宽，边缘不清，有时与肺内的放射区互相融合；大面积放疗可致胸膜肥厚、粘连，或少量胸水，叶间裂增宽等；广泛纤维化导致动脉高压，肺门增大和右心受累的征象。

目前尚未完全阐明放射性肺损伤的发生机制。一般认为，放射性肺损伤是多因素参与的多细胞-因子的级联效应的结果，与靶细胞损伤和活性氧自由基有关，与细胞因子的产生、表达和信号转导有关[李凤玉,刘秀芳,张建宇.放射性肺损伤发生机制的研究进展[J].现代肿瘤学医学,2009,17(3):576-578.]。放射性肺损伤的早期表现为放射性肺炎，多在放疗后1～3个月发生，与肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）和单核细胞趋化蛋白（monocyte

chemoattractantprotein，MCP）等致炎细胞因子密切相关，特别是TNF和IL-1[曹京旭,张旭志.细胞因子与放射性肺损伤[J].国外医学·放射医学核医学分册,2001,25,(4):181-185.]

目前西医主要治疗手段为使用大剂量糖皮质激素加抗生素，虽取得了一定效果，但在部分患者疗效仍然欠佳[GhafooriP,MarksLB,VujaskovicZ,etal.Radiation-inducedlunginjury.Assessment,management,andprevention.Oncology(WillistonPark).2008,22(1):37-47;discussion52-53.]。西医治疗放射性肺损伤，根据放射性肺损伤是胸部放射治疗的主要剂量限制性因素，且无有效的治疗措施，故处置放射性肺损伤的关键在于预防。一旦发生放射性肺损伤，目前临床上最常用的治疗方法是使用肾上腺皮质激素联合抗生素。虽然大剂量激素可暂时有效缓解症状，抑制肺纤维化的发展，但容易产生诸多并发症。细胞保护剂氨磷汀可一定限度地保护正常组织，但可能存在较大毒副作用，且价格昂贵。因此，寻找更为有效低毒的防治放射性肺损伤的方法成为研究的热点[王璐.中西医结合治疗放射性肺炎的疗效研究[J].中国医学创新,2010,7(6)：60-61]。

治疗放射性肺损伤西医除了使用肾上腺皮质激素和抗生素外别无有效治疗手段。根据临床症状,放射性肺损伤可归于中医“咳嗽”、“喘证”、“肺痿”范畴。放射线属中医的热毒之邪,易灼伤人体津液,损伤人体正气和阴血。放射线致病与一般热毒之邪不同,可以不遵循卫气营血传变规律,而是直中脏腑血络。肺为娇脏,放射线之邪毒侵袭肺脏,肺脏易受其损伤。首先,热毒之邪最易熏灼肺阴,虚热内盛,耗伤人体正气,气阴两伤;其次,气虚无力鼓动血脉,阴虚津不养血,血液黏稠,导致血行不畅,瘀血内生,阻滞肺络。气阴两虚,瘀毒阻肺,会影响到肺宣发肃降、朝百脉的功能,可导致清气难入、浊气难出,故放射性肺损伤患者可出现呼吸困难、胸闷的症状,严重者可因呼吸衰竭而死亡。总之,热毒为放射性肺损伤的主要病因,气阴两伤和瘀毒互结是该病的主要病机。中医在这一领域具有一定优势。中医学注重整体调整，在防治放射性肺损伤的同时可以增加放疗效果，改善免疫功能，保护造血系统，改善患者生存质量。中医治疗本病应遵循急则治其标，缓则治其本的原则，临证时无论是治标、治本还是标本兼治，应根据不同类型加以辨证施治。

本发明中药组合物具有清瘟解毒，宣肺泄热的功效，方中连翘、金银花、炙麻黄、薄荷、广藿香解表透邪、外宣肺卫，石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、甘草清热解毒、内清气热，红景天益气养阴、清肺化瘀，大黄通腑泄热，是卫气同治、表里双解、清热解毒之良药，通过实验表明本发明药物治疗放射性肺损伤效果显著。

本发明是在ZL03143211专利的基础上进行的改进发明，在此全文引用该专利文件记载的内容。上述专利未公开该中药组合物在制备治疗放射性肺损伤物中的应用。

发明内容

本发明提供一种中药组合物制备治疗放射性肺损伤药物中的应用，该中药组合物由下列重量份的原料药制成：

连翘200-300金银花200-300板蓝根200-300大黄40-60

广藿香60-100绵马贯众200-300红景天60-100薄荷脑5-9

炙麻黄60-100炒苦杏仁60-100鱼腥草200-300

甘草60-100石膏200-300。

本发明中药组合物的原料药的重量份比优选为：

连翘200金银花300板蓝根200大黄60广藿香60

绵马贯众300红景天60薄荷脑9炙麻黄60

炒苦杏仁100鱼腥草200甘草100石膏200。

本发明中药组合物的原料药的重量份比还优选为：

连翘300金银花200板蓝根300大黄60广藿香100

绵马贯众200红景天60薄荷脑5炙麻黄100

炒苦杏仁60鱼腥草300甘草60石膏300。

本发明中药组合物的原料药的重量份比还优选为：

连翘278金银花294板蓝根285大黄55广藿香95

绵马贯众290红景天87薄荷脑8.5炙麻黄88

炒苦杏仁80鱼腥草284甘草95石膏277。

本发明中药组合物的原料药的重量份比还优选为：

连翘255金银花255板蓝根255大黄51广藿香85

绵马贯众255红景天85薄荷脑7.5炙麻黄85

炒苦杏仁85鱼腥草255甘草85石膏255。

本发明中药组合物主要由连翘、金银花、板蓝根、大黄、广藿香、绵马贯众、红景天等组成，发挥复方中药的整体调节优势，祛除病邪、缓解症状、调节免疫的有机结合，临床实验证实对放射性肺损伤有显著疗效。

本发明所述中药可以被有相同或相似功效果的中药代替，并且这些药材均可以按照《全国中药炮制规范》或《中药大辞典》炮制。

本发明中药组合物的活性成分由以下步骤制成:

(1)按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)广藿香碎断，加5-8倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁、煎煮2次，每次0.5-2.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；

(5)将步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，备用；

步骤（5）所得干膏粉、步骤（2）所得挥发油与薄荷脑共同构成该中药组合物的活性成分。

本发明药物的剂型为胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、软胶囊、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。

其中胶囊剂由如下步骤制成：

(1)按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)广藿香碎断，加5-8倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁、煎煮2次，每次0.5-2.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；

(5)步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，备用；

(6)将步骤(5)所得干膏粉加入适当药学上可接受的辅料制粒；

(7)将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(6)所得颗粒，密闭，混匀，装入胶囊，即得。

其中颗粒剂的制备方法，是由以下步骤制成：

(1)按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；

(2)广藿香碎断，加5-8倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1-3小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加入乙醇，调解至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；

(5)将步骤（4）所得所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，备用；

(6)将步骤(5)所得干膏粉加入适当药学上可接受的辅料制粒；

(7)将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(6)所得颗粒，密闭，混匀，装袋，即得。

优选的颗粒剂的制备方法为：

(1)按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；

(2)广藿香碎断，加6倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小时，第二次1.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加9倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁、煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的水滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加95%乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏滤液；

(5)将步骤（4）所得清膏滤液与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.25-1.35的稠膏，备用；

(6)将步骤(5)所得稠膏加入适当药学上可接受的辅料制粒；

(7)将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(6)所得颗粒，密闭，混匀，装袋，即得。

本发明药物其他剂型的制备方法为：按比例称取原料药，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

本发明中药组合物还可降低放射性肺损伤引起的白介素-6和或肿瘤坏死因子-α的表达水平和蛋白质水平。

附图说明：

图1：不同时间放射性肺损伤大鼠肺组织病理改变的影响（HE染色×200），C.为空白对照组；R为单纯照射组；LHQWH为照射加本发明中药组合物高剂量组；LHQWM为照射加本发明中药组合物中剂量组。

图2：照射后各时间点，各实验组的IL-6和TNF-αDNA条带，C.为空白对照组；R为单纯照射组；LHQWH为照射加本发明中药组合物高剂量组；LHQWM为照射加本发明中药组合物中剂量组。

具体实施方式

下述实施例用于举例说明本发明药物的制备，但其不能对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

处方：

连翘255克金银花255克板蓝根255克大黄51克

广藿香85克绵马贯众255克红景天85克薄荷脑7.5克

炙麻黄85克炒苦杏仁85克鱼腥草255克

甘草85克石膏255克。

制备方法：

(1)按照上述处方称取中药材，净选；

(2)广藿香碎断，加6倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小时，第二次1.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加9倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁、煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置24小时，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；

(5)步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，喷雾干燥，得干膏粉，备用；

(6)将步骤(5)所得干膏粉加入淀粉142克，用85%乙醇制粒；

(7)将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(6)所得颗粒，密闭，混匀，装入1000粒胶囊，即得。

实施例2

处方：

连翘200克金银花300克板蓝根200克大黄60克

广藿香60克绵马贯众300克红景天60克薄荷脑9克

炙麻黄60克炒苦杏仁100克鱼腥草200克

甘草100克石膏200克。

制备方法：

(1)按照上述处方称取中药材，净选；

(2)广藿香碎断，加5倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用6倍量50%的乙醇提取2次，第一次1小时，第二次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁、煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置24小时，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；

(5)将步骤(4)所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，喷雾干燥，得干膏粉，备用；

(6)将步骤(5)所得干膏粉加入淀粉151克，用85%乙醇制粒；

(7)将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(6)所得颗粒，密闭，混匀，压制成片，得935片。

实施例3

处方：

连翘300克金银花200克板蓝根300克大黄40克

广藿香100克绵马贯众200克红景天100克薄荷脑5克

炙麻黄100克炒苦杏仁60克鱼腥草300克

甘草60克石膏300克。

制备方法：

(1)按照上述处方称取中药材，净选；

(2)广藿香碎断，加8倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用10倍量90%的乙醇提取2次，第一次3小时，第二次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；

(4)金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加11倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁、煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置24小时，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；

(5)步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，喷雾干燥，得干膏粉，备用；

(6)将步骤(5)所得干膏粉，步骤（2）所得挥发油及薄荷脑按常规方法制成丸剂，得药丸905丸。

实施例4：

原料药配方为：

连翘170克金银花170克炙麻黄57克炒苦杏仁57克

石膏170克板蓝根170克绵马贯众170克鱼腥草170克

广藿香57克大黄34克红景天57克薄荷脑5.0克

甘草57克

制备方法：

（一）提取工艺：

(1)按照上述处方量称取中药材，净选，酌情碎断；

(2)广藿香加6倍量水提取挥发油，提油时间4h，收集挥发油，出油率为0.33±0.05%，提取液过滤后备用，残渣弃去；

(3)连翘、炙麻黄、鱼腥草、大黄，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小时，第二次1.5小时，提取液过滤，滤液合并，回收乙醇至无醇味，备用；

(4)金银花、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加9倍量水煎煮至沸，加入炒苦杏仁，煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液过滤，滤液合并同时加入步骤（2）广藿香提油后的水溶液，浓缩成60℃测定相对密度为1.10-1.15清膏，加95%乙醇，边加边搅拌，至醇浓度70%，冷藏放置24小时，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，与醇提液合并，浓缩至浓缩成60℃测定相对密度为1.25-1.35稠膏，备用；

（二）制剂工艺：

(5)制剂配方为：步骤（4）所得稠膏335.5g薄荷脑5g

步骤（2）所得广藿香油0.2ml糖粉342.5g糊精514.0g

(6)制粒：将糖粉和糊精混合均匀，用稠膏作粘合剂制软材，14目筛网制粒，60—65℃烘干，10目筛网整粒;

(7)分装：筛出细粉适量，将薄荷脑、广藿香挥发油加入适量乙醇，溶解，喷入细粉中，混合均匀，并与颗粒混合均匀，密闭半小时，装袋，即得，以上处方可制成颗粒1000g。

实验例：

为证实本发明中药组合物具有治疗放射性肺损伤的疗效，用按实施例1方法制得的胶囊（以下称本发明药物），进行了以下药理试验研究：

资料与方法

一、材料与方法

1.实验动物及分组：健康、成年、SPF级、雌性、Wistar大鼠48只，体重180～200g，购自湖北省实验动物研究中心（合格证号：SCXK（鄂）2008-0005），实验前在清洁动物房饲养7天,观察无异常者入组。将大鼠随机分为照射加本发明药物高剂量组（treatedbyhigh-doseLHQWwithradiation,LHQWH组）、照射加本发明药物中剂量组（treatedbymiddle-doseLHQWwithradiation,LHQWM组）、单纯照射组（radiationonlyGroup,R组）和空白对照组（BlankControlGroup,C组），每组各12只，并用苦味酸标记。

2．主要试剂与药品：本发明中药组合物由石家庄以岭药业股份有限公司提供（生产批号：130232）；市售试剂：Trizol(invitrogen公司，美国），MMLV逆转录酶及dNTPs（TOYOBO公司，日本），RnaseA酶抑制剂（Takara公司，大连），DNA聚合酶（TransGen公司，北京），IL-6和TNF-αELISA检测试剂盒(PeproTech公司，美国）；oligodT、β-actin、IL-6及TNF-α引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

3.照射方法：大鼠用10%的水合氯醛生理盐水（350mg·kg-1）行腹腔注射麻醉后，仰卧位，四肢展开固定于自制固定板上，充分暴露胸部，照射野大小为2.8cm×4.2cm，总剂量DT=20Gy，SSD=100.0cm。通过监视仪观察受照射大鼠，凡在照射期过程中出现扭动者，剔除出组。

4.动物处理：照射前3天开始灌胃，直至照射后第28天结束，共31天。LHQWH组：灌胃本发明中药组合物药粉0.84g·kg-¹体重，每日1次；LHQWM组：灌胃本发明中药组合物药粉0.42g·kg^-1体重，每日1次；C组及R组：灌胃生理盐水，每日1次。

5.切片及HE染色：肺组织于10%的甲醛固定液中固定24h后，常规石蜡包埋、切片、粘片、脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片，用光学显微镜（OLYMPUSIX81，日本）行切片观察及图像采集。

6.肺泡灌洗液细胞计数：大鼠处死后解剖胸腔，结扎左主支气管，气管插管后用PBS灌洗右肺，每次2mL，共3次，回收率约为90%。将肺泡灌洗液在4℃下

以1200r／min离心5min，弃上清，重复洗2次，最后用4mlPBS重悬细胞并计数。

7.血清中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定：大鼠麻醉后心脏取血约4mL，3000r/min，离心10min，取血清于-80℃保存。血清标本中IL-6及TNF-α的检测按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

8.RT-PCR法检测肺组织IL-6和TNF-αmRNA的表达：用1mlTrizol提取50mg肺组织总RNA，用紫外分光光度计测定RNA纯度（A260/A280=1.6～1.8）及浓度，取0.5μg总RNA按说明书行逆转录反应，30℃反应10min,42℃反应60min，70℃反应15min。取1μlRT产物行PCR，PCR反应按94℃预变性3.5min，94℃30s，53℃15s，72℃20s，33个循环。引物序列如表1。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后拍照观察结果。

9.统计分析

运用SPSS17.0统计软件进行分析,实验数据均以均数±标准差（x±S）表示，组间比较采用组间t检验和方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示差异极具统计学意义。

二、实验结果

1.大鼠一般情况

单纯照射组大鼠自照射后第3天出现精神萎靡、进食量与活动量减少、眼睛出现黄色分泌物、大便干，第14天后照射局部出现脱毛，部分大鼠出现咳嗽症状，照射后第26天上述症状开始逐渐减轻。而照射加本发明药物高、中剂量组大鼠精神状态较单纯照射组好，眼睛分泌物、大便干硬等方面的发生率低、程度较轻、出现时间较晚、持续时间较短，至照射后第18天，上述表现开始逐渐消失，无明显咳嗽症状。

2.病理组织观察

照射加本发明药物高、中剂量组在照射后第1天仅见肺间质少量炎性细胞浸润，第14天见肺间质轻到中度水肿及炎性细胞浸润等急性炎性改变，28天时炎症明显减轻，以及肺间质增厚，肺泡结构轻微破坏。而单纯照射组自照射后第1天即见肺间质增厚，炎性细胞浸润，第14天时炎性反应严重，表现为肺间质充血、出血、水肿，大量炎性细胞浸润，肺泡结构破坏，第28天时炎症稍减轻，肺间质增厚，肺泡腔变小（如图1）。

3.肺泡灌洗液细胞计数：照射后大鼠肺泡灌洗液细胞总数明显升高，与单纯照射组相比，本发明药物高剂量组在照射后的各时间点肺泡灌洗液细胞总数均减低（如表2），其中第14、28天差异具有显著地统计学意义（t=3.237、3.431,P<0.05）。本发明药物中剂量组的肺泡灌洗液细胞总数与单纯照射组比较有所减低，但照射后第14天差异无统计学意义（t=1.710,P>0.05），而照射后的第28天两者比较差异显著（t=2.658,P<0.05）。

表2.本发明中药组合物作用下放射性肺损伤大鼠肺泡灌洗液细胞计数（x±S,×104/ml）

注:LHQWH组与R组比较:t=3.237,#P<0.05;t=3.431,##P<0.05.

LHQWM组与R组比较:t=1.710,###P>0.05;t=2.658,####P<0.05.

4.血清中白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平测定

急性放射性肺损伤大鼠模型血清中IL-6和TNF-a水平均明显升高，但使用本发明药物后，IL-6和TNF-a水平均降低（如表3）。其中，在IL-6水平上，高剂量本发明药物的抑制作用更明显，与单纯照射组比较照射后第1、14、28天差异均具有统计学意义（t=7.748、15.119、6.902,P<0.01）；而在TNF-a水平上，中剂量本发明药物的抑制作用更明显，与单纯照射组比较在照射后的第1天差异均具有统计学意义（t=3.940，P<0.01），照射后第14、28天差异亦具有统计学意义（t=3.333、2.259,P<0.05）。

表3.本发明中药组合物作用下放射性肺损伤大鼠血清TNF-aandIL-6水平（x±S，ng/ml）

注：LHQWH组与R组比较:t=3.940,ⅣP<0.01;t=3.333,t=2.259,ⅤP<0.05.LHQWM组与R组比较:t=7.748,t=15.119,t=6.902,ⅢP<0.01.

5．肺组织白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达

照射后各时间点，各实验组的IL-6和TNF-αDNA条带及相对β-actin内参条带的相对灰度值（见图2、表4）。与单纯照射组比较，照射加连花清瘟高、中剂量组的IL-6和TNF-α条带的相对灰度值均减小，差异具有统计学意义（P<0.01）。

表4.本发明中药组合物对放射性肺损伤大鼠肺组织中TNF-α和IL-6mRNA表达的影响

C.空白对照组；LHQWH.照射加本发明中药组合物高剂量组；LHQWM.照射加本发明中药组合物中剂量组；R.单纯照射组

三、结论

通过以上实验可以得出本发明中药组合物可以改善大鼠的一般情况，减轻肺组织的炎性反应，抑制急性放射性肺损伤所引起的肺泡灌洗液中的细胞总数的升高，从而发挥防治放射性肺损伤的作用。本发明中药组合物抑制大鼠血清IL-6和TNF-α蛋白水平及下调损伤肺组织中IL-6和TNF-αmRNA的表达。

实验结果充分证实本发明药物可以有效的治疗放射性肺损伤，特别适用于放射性肺损伤引起的白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）升高，治疗全过程中未出现任何临床不良反应及毒副作用，具有显著的临床疗效。