富氢水在预防或治疗多发性硬化疾病的药物或保健食品中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种可以用于治疗自身免疫性脑脊髓炎动物模型的含氢气纯净水。本发明提供了富氢水在预防或治疗多发性硬化疾病的药物或保健食品中的应用。本发明所述的富氢水，氢气的浓度为0.36mM-0.89mM，富氢水可显著降低EAE的严重性。它也防止了炎性CD4+T淋巴细胞浸润中枢神经系统并抑制了Th17细胞分化。因此本发明的富氢水可用做治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种可以用于治疗自身免疫性脑脊髓炎动 物模型的含氢气纯净水。

背景技术

氢气(H₂)是存在于人体内的抗氧化气体。它无毒、价廉，通过饮用的 方法服用富氢水易于操作。在最近几年，已报道氢气在疾病的预防和治疗应 用中有着巨大的潜力。许多实验已经进行了对氢气的确认，除其他的气体属 性还显示出抗氧化、抗凋亡、抗炎和抗过敏作用。据报道，给予小鼠脑切片 中加入富氢水培养观察33天后发现，与对照相比能显著减少超氧化物的形 成。大鼠牙周炎模型研究中发现，口服富氢水4周后可以显著降低血清中活 性氧(ROS)和氧化低密度脂蛋白胆固醇。吸入氢气也可以保护大脑缺血和 再灌注诱导的氧化应激损伤。然而，氢气是否能够治疗多发性硬化目前尚未 见报道。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介 导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为 特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化(MS)的理想动物模型，在临床神 经免疫学的研究中具有重要意义。

此病预后不良，FDA所认证的药物均只能推迟和缓解发病的严重性但不 能彻底治愈MS，因此亟待通过新的途径开发新的药物来更好的缓解MS患者 的疾病困扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富氢水的新用途。

本发明提供了富氢水在预防或治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎药物中的 应用。

本发明构建了实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型，EAE模型的构建 方法，也可参考文献：徐全刚、王晓辉、黄德晖、吴卫平，MOG_(35-55)诱 发实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型，《中华神经医学杂志》2006年02 期，38-41。

进一步地，富氢水可以降低EAE的临床评分，减轻疾病严重性。

高浓度富氢水可以预防性治疗EAE。

富氢水可以抑制EAE中枢神经系统炎性细胞浸润和脱髓鞘。

富氢水可以抑制TH17细胞的分化。

所述的富氢水，氢气的浓度为0.36mM-0.89mM，优选0.36mM和0.89 mM，溶于纯净水中。

在本发明的一个优选实施例中，所述的富氢水购自北京活力氢源饮品有 限公司。

本发明还提供了富氢水在预防或治疗多发性硬化疾病的药物或保健食品 中的应用。

所述的富氢水，氢气的浓度为0.36mM-0.89mM，优选0.36mM和0.89 mM，溶于纯净水中。

其中预防给药组H₂含量0.36mM与预防给药组H₂含量0.89mM均在每日 早晚定时供给，治疗给药组H₂含量0.89mM在发病后每日早晚定时供给。

所述的预防或治疗多发性硬化疾病的药物为口服液或注射剂。

具体应用时，可添加医学上可接受的辅料；或者将富氢水与其它对多发 性硬化疾病有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加医学上可接受的 辅料。

本发明证实了富氢水在MS、EAE发病中的治疗和预防性作用。本发明 经实验证明了富氢水可显著降低EAE的严重性。它也防止了炎性CD4+T淋 巴细胞浸润中枢神经系统并抑制了Th17细胞分化。

因此本发明的富氢水可用做治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物。

附图说明

图1是本发明在不同剂量下对EAE发病的预防和治疗作用。

图2是本发明在治疗EAE后脊髓组织学情况。A为对照组与实验组EAE小鼠 脊髓H&E染色结果及其炎性细胞浸润统计分析，其中H&E指苏木精伊红染 色法；B为对照组与实验组EAE小鼠脊髓Luxolfastblue染色结果及其脱髓 鞘范围统计分析，其中Luxolfastblue是指快蓝染色。

图3是本发明在治疗EAE后脑与脊髓中CD4+T细胞变化情况。其中A为对 照组与实验组EAE小鼠脑和脊髓中CD4+细胞流式峰度图；B为A中CD4+ 细胞百分比结果；C为A中CD4+细胞绝对数值结果。

图4是本发明在治疗EAE后中枢神经系统(脑/脊髓)与脾脏中TH1与TH17 比例变化情况。其中A为中枢神经系统中对照组与实验组中TH1与TH17细 胞流式比例；B为淋巴结中对照组与实验组中TH1与TH17细胞流式比例。 图5是本发明在治疗EAE后中枢神经系统(脑/脊髓)中TH1与TH17统计结 果。其中A为对照组与实验组中TH17与TH1细胞百分比统计结果；B为对 照组与实验组中TH17与TH1细胞绝对数统计结果。

图6是本发明在治疗EAE后淋巴结中TH1与TH17统计结果。其中A为对照 组与实验组中TH17与TH1细胞百分比统计结果；B为对照组与实验组中 TH17与TH1细胞绝对数统计结果。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照 制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的富氢水购自北京活力氢源饮品有限公司

实施例1：

1、动物实验

实验动物：C57BL/6J小鼠(雌性，8-12周)购自南京生物医药研究院及 上海斯莱克实验动物有限公司。所有动物实验均获得第二军医大学动物伦理 学委员会认可。

取小鼠60只，雄性，随机分成4组：

正常对照组，对照组；

预防给药组H₂含量0.36mM，预防给药(0.36mM)；

预防给药组H₂含量0.89mM，预防给药(0.89mM)；

治疗给药组H₂含量0.89mM，治疗给药(0.89mM)；

正常对照组给予相同剂量纯净水。

2、EAE造模及体内富氢水干预：

1)制备完全弗式佐剂：将结核菌素Mtb溶解在不完全弗式佐剂CFA中，用陶瓷 研钵边研磨边加CFA，最后溶解浓度为4mg/ml；

2)MOG35-55粉末溶解到无菌PBS中，最后溶解浓度为2mg/ml；

3)将上述1和2中所得溶液，按1：1混匀，玻璃注射器来回推打至完全混匀呈 白色乳状，第一滴到水中，若不弥散开，代表已完全混好；

4)按照300ul/只，背部皮下分三点注射；

5)腹腔注射百日咳毒素PTX，每只200ul；

6)48小时后，再次腹腔注射百日咳毒素PTX；

7)10-14天老鼠开始发病，对老鼠发病进行评分

0未发病

0.5尾巴尖朝下

1尾巴着地，不能抬起

1.5尾巴着地，不能抬起，后肢无力，走路摇晃

2尾巴着地，不能抬起，一条腿瘫痪

2.5尾巴着地，不能抬起，一条或两条腿瘫痪，不能支撑

3尾巴着地，不能抬起，后肢完全瘫痪，不能支撑

3.5尾巴着地，不能抬起，后肢完全瘫痪，前肢部分瘫痪

4尾巴着地，不能抬起，后肢完全瘫痪，前肢瘫痪

5垂死或死亡

预防给药组H₂含量0.36mM与预防给药组H₂含量0.89mM均在造模后每 日早晚定时供给，治疗给药组H₂含量0.89mM在造模发病后每日早晚定时供 给，健康对照组供给时间为造模后早晚各一次。

3.样本制备

实验动物经4％水合氯醛麻醉后，从主动脉灌流，先使用1×PBS溶液， 后使用4％PFA，小心取出老鼠的脊髓，于4％PFA中后固定过夜，20％蔗糖 脱水(1-2天)，待其沉底，再放到30％蔗糖脱水，待其沉底。随后将组织迅 速冰冻，按20um厚度制成冠状切片，贴于涂有明胶的玻片上或存于50％甘 油中备用。

4.LFB-PAS染色

无水乙醇5min

0.1％LFB56-60℃14h

双蒸水洗净

双蒸水洗

0.5％PA5min

双蒸水洗

Schiffregent15min

温水洗5min

苏木精30s

水洗

37℃孵箱烘干

二甲苯透明2min/2次

中性树胶封片

5.HE染色

6统计分析

所有试验至少重复三次；在体实验每组至少三只动物，数据值用平均值 标准误表示，各组之间的统计学差异采用单因素方差分析(ANOVA)和 Student’t检验方法进行分析，p＜0.05被认为具有统计学的显著性差异。

结论：

1、本发明在不同剂量下对EAE发病的预防和治疗作用结果如图1、表1 所示。

表1在不同剂量下对EAE发病的预防和治疗作用的统计结果

造模后每日两次给予富氢水，0.89mM富氢水在EAE造模发病后开始给 予。健康对照采用口服纯净水的方法。所有试验均重复3次以上，n＝5-6每组， EAE模型分析采用non-parametricMann-Whitneytest，图中星号表明各组之间 比较有显著性差异(p＜0.05)。

结果表明，不同浓度氢水处理EAE小鼠相比于对照组均能够明显缓解疾 病进展，显著降低疾病发病时间和严重程度，0.80mM富氢水预防给药组在EAE 发病中具有更好保护作用。

2、为本发明实施中采用富氢水(0.89mM)组治疗EAE小鼠模型后取其脊髓 进行H&E染色后效果；其中，箭头所指为炎症细胞聚集和髓鞘丢失部位，结 果如图2所示，同对照组相比，脊髓白质周围未发现明显脱髓鞘部位。luxol& Fastblue染色后脱髓鞘面积统计，结果显示同对照组相比，脊髓脱髓鞘面积与 整体脊髓白质面积相比比值明显低于对照组，具有统计学意义；进行HE染色 后，发现炎症细胞在脊髓白质聚集部位明显少于对照组。HE染色后浸润炎症 细胞统计，结果显示每mm²脊髓白质炎症细胞浸润数量明显低于对照组，结果 具有统计学意义。

3、在富氢水(0.89mM)治疗组处理EAE小鼠中通过梯度离心方法取出中枢 神经系统(脑与脊髓)中单个核细胞，再通过CD4+T细胞抗体标记发现，结 果如图3所示，与对照组相比治疗组中CD4+T细胞显著降低。

4、通过流式细胞染色方法对两组EAE小鼠的中枢神经系统(脑与脊髓) 和淋巴结进行IFN-γ+andIL-17A+细胞标记，结果如图4所示，我们发现富氢 水(0.89mM)处理组TH17阳性细胞(IL-17A+)在CD4+细胞中的比例明显低 于对照组，结果如图5所示，TH1阳性细胞(IFN-γ+)的绝对值也有所降低， 但在CD4+细胞中的比例却未见改变，结果如图6所示。这些结果表明富氢水 处理组可以显著抑制TH17细胞的分化。

上述实验表明，本发明可抑制EAE中枢神经系统炎性细胞浸润和脱髓鞘 变化，并抑制其中TH17细胞的分化。

因此本发明可用做预防或治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗药物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行 业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明 书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本 发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围 内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。