分离和测定苯磺贝他斯汀光学异构体杂质的方法

摘要

一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体并定量测定R-异构体杂质的方法，采用高效液相色谱法，流动相中含有正己烷和乙醇，其特征在于采用正相液相色谱法；使用的色谱柱中所用的填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶；所述流动相中还含有碱性添加剂。本方法与现有技术方法相比，流动相配制简单，两异构体的分离度均在4.5～5.5范围内。尤其是，本方法的色谱柱耐用性较好，使用一年后仍有较高的柱效，极大降低了分析测定成本。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种分离和测定药物的光学异构体杂质的方法，具体涉及用高效液相色谱 法分离苯磺贝他斯汀及其R-异构体并定量测定该R-异构体的方法。

背景技术：

苯磺贝他斯汀是非镇静类高选择性组胺H1受体拮抗剂类药物，具抗过敏、止痒效果。

苯磺贝他斯汀是S-构型的手性化合物，化学名(+)-(S)-4-[4-[(4-氯苯基)(2-吡啶)甲氧基] 哌啶]丁酸苯磺酸盐，与其R-异构体在药理作用方面有较大差异，苯磺贝他斯汀较R-异构 体更优越。

在制药过程中，往往将苯磺贝他斯汀的R-异构体作为杂质监控。因此，苯磺贝他斯 汀(S-构型)与R-异构体的分离、以及对苯磺贝他斯汀的R-异构体的含量测定，对苯磺 贝他斯汀质量的控制具有非常重要的意义。

现有技术都是用反相液相色谱法来拆分苯磺贝他斯汀的S-构型和R-构型，当使用正 相色谱方法时，使用常用填料的色谱柱不能将苯磺贝他斯汀(S-构型)与R-异构体分离。 如专利(CN1098262C)报道采用ULTRONES-OVM色谱柱反相液相色谱法来拆分，进口 标准(JX20060221)采用ULTRONES-CD反相液相色谱法来拆分。

虽反相色谱所用试剂较便宜，但上述两种反相液相色谱拆分方法都存在明显缺点：

ULTRONES-CD柱对苯磺贝他斯汀两光学异构体的分离效果不理想，且使用一个月 左右后，两异构体基本不能分离；

ULTRONES-OVM柱填料为卵蛋白键合硅胶，对苯磺贝他斯汀及其异构体能够有效 分离，但使用一段时间后，峰型变宽，柱效明显下降，色谱柱耐用性差。

两种方法的拆分条件和结果如表1所示：

表1现有技术两种反相液相色谱方法比较

发明内容：

本发明的目的一是提供一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体的方法，不仅两光学异构体 的分离效果好，而且色谱柱耐用性较好，使用一段时间后仍能保持较高柱效。

本发明另一目的是提供定量测定苯磺贝他斯汀中所含的R-异构体杂质的方法。

本发明提供了一种拆分苯磺贝他斯汀光学异构体并定量测定R-异构体杂质的方法， 采用高效液相色谱法，流动相中含有正己烷和乙醇，其特征在于：

1)采用正相液相色谱法；

2)使用的色谱柱中所用的填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯) 的硅胶，如ChiralpakAD-H色谱柱；

3)所述流动相中还含有碱性添加剂；

所述碱性添加剂为含氮原子的碱性有机溶剂，优选为乙醇胺、二乙胺、三乙胺中的一 种或几种。

所述流动相中正己烷和乙醇的体积比为：正己烷:乙醇＝85～90:10～15。

所述碱性添加剂的比例(V/V)为0.05％～0.15％，优选浓度为0.05％～0.1％。

在本发明的一个实施例中，用ChiralpakAD-H色谱柱(4.6×250mm，5μm，填料为 表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶)；以正己烷-乙醇-乙醇胺 (87:13:0.1)为流动相；检测波长为260nm。分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照 品适量，加乙醇适量超声使溶解，用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg 和R-异构体5μg的混合溶液，按上述色谱条件进样20μl，记录色谱图。出峰顺序依次为 贝他斯汀、R-异构体，理论板数按贝他斯汀峰计算不低于2000，贝他斯汀和相邻异构体 的分离度不低于2.0。

本发明的方法经线性关系、回收率试验、检测限等方法学验证，结果证明该测定方法 准确可靠。方法学验证见实施例1。

用本发明的方法不仅可将苯磺贝他斯汀与其光学异构体进行分离，还能够采用不加校 正因子的主成分自身对照法(见实施例2)对R-异构体的含量进行测定。

实施例1、2给出了有效成分苯磺贝他斯汀(S-构型)与光学异构体(R-构型)分离 的研究，并对三批样品中的光学异构体进行定量测定。结果表明，本方法与专利 CN1098262C方法和进口标准(JX20060221)中的方法相比，本发明方法具有如下优点：

1、流动相配制简单。

2、两异构体的分离度均在4.5～5.5范围内.。

3、色谱柱耐用性较好，使用一年ChiralpakAD-H色谱柱后，仍有较高的柱效。

附图说明：

图1～图6是采用HPLC(高效液相色谱)方法分离苯磺贝他斯汀与R-异构体得到的 色谱图。从各图可看到，现有技术和本发明所用的三种色谱柱，各自在使用时间不同的情 况下，苯磺贝他斯汀及其R-异构体分离情况的比较：

图1本发明所用的ChiralpakAD-H新色谱柱初次使用时；

图2本发明所用的ChiralpakAD-H色谱柱使用一年后；

图3现有技术所用的ULTRONES-CD新色谱柱初次使用时；

图4现有技术所用的ULTRONES-CD色谱柱使用一个月后；

图5现有技术所用的ULTRONES-OVM新色谱柱初次使用时；

图6现有技术所用的ULTRONES-OVM色谱柱使用三个月后。

各图中，纵座标是峰面积(单位：mV)，横座标是时间(单位：min)。

具体实施方式

下面以实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例中所使 用的色谱分离的流动相、流动相的组成和使用的色谱分离柱及色谱分离柱的填料。

以下各实验中所用色谱仪：SHIMADZULC-2010AHT(日本岛津)；检测器：UV； 色谱工作站：LCsolution，流速：1.0ml/min。

实施例1ChiralpakAD-H色谱柱正相HPLC(高效液相色谱)检测

色谱条件

色谱柱：ChiralpakAD-H(填料是表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯) 的硅胶，4.6×250mm,5μm)

流动相：正己烷-乙醇-乙醇胺(87:13:0.1，V/V/V)；所用正己烷、乙醇均为色谱纯， 乙醇胺为分析纯

检测波长：260nm；

进样量：20μl；理论板数按苯磺贝他斯汀峰计不低于2000

方法：分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解， 用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体50μg的混合溶液，照上 述色谱条件进样20μl，记录色谱图(图1、图2)

图1是ChiralpakAD-H色谱柱初次使用记录的色谱图；图2是该色谱柱使用一年后， 采用同样色谱方法条件记录的色谱图。分离数据见表2。

表2ChiralpakAD-H色谱柱使用前后分离数据对比

从表2数据中看出：ChiralpakAD-H色谱柱使用一年后，理论板数和分离度均没有明 显变化。证明ChiralpakAD-H色谱柱对苯磺贝他斯汀及R-异构体不仅有较好的分离效果， 而且该色谱柱耐用性较好。

本发明方法的方法学验证

1、线性关系

精密称取R-异构体对照品16.49mg(含量99.41％)于100ml量瓶中，用8ml乙醇超声溶 解并用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(1)；再精密量取该贮备液5ml至50ml量瓶 中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(2)。

线性溶液的配制：分别精密量取上述贮备液(2)1.5、2.5ml于25ml量瓶中，用溶剂稀 释至刻度，摇匀，配制成异构体浓度为0.98、1.64μg/ml的溶液；再分别精密量取上述贮备 液(1)0.5、0.6、0.9、1.0、1.5ml于25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，配制成异构 体浓度为3.28、3.93、5.90、6.56以及9.84μg/ml的溶液。取上述各线性溶液，由从低到高的 浓度，按异构体测定色谱条件进样20μl，记录色谱图，以浓度为X轴、峰面积为Y轴进行 线性回归，回归方程为Y＝11977.4X-985.5，r＝0.9996(n＝7)，R-异构体浓度在0.98μg/ml～ 9.83μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。

2、回收率试验

精密称取R-异构体对照品25.05mg于50ml量瓶中，用乙醇约16ml超声溶解并用正 己烷稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml至50ml量瓶中，用溶剂稀释刻度，摇匀，作为 贮备液。称取不含主药的空白辅料约2.0、2.5、3.0g各3份于25ml量瓶中，共9份。分 别精密量取上述贮备液2.0、2.5、3.0ml各三份于上述25ml量瓶中，加乙醇约8ml超声溶 解并用正己烷稀释至刻度，摇匀，分别测定，计算回收率，得平均回收率为100.3％，RSD 为0.84％，表明准确度良好，见表3。

表3R-异构体回收率试验

注：准确度良好的标准通常是平均回收率90％～110％，RSD≤2.0％。

3、检测限

取浓度为0.384μg/ml的R-异构体溶液，照前述色谱条件，取20μl注入液相色谱仪， 连续进样6次，信噪比(S/N)均大于3，因此R-异构体的检测限为3.84×10^-7g/ml。

实施例2苯磺贝他斯汀片中光学异构体含量测定

按前述方法、仪器和色谱条件进行正相HPLC测定，具体操作如下：

分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解，用正 己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体5μg的混合溶液，按上述色 谱条件进样20μl，记录色谱图。出峰顺序依次为贝他斯汀、R-异构体，理论板数按贝他斯 汀峰计算不低于2000，贝他斯汀和相邻异构体的分离度应不低于2.0。

取连续三批苯磺贝他斯汀片，研细，称细粉适量(约相当于苯磺贝他斯汀25mg)，置 25ml量瓶中，加乙醇约8ml，超声3分钟使苯磺贝他斯汀溶解，用正己烷稀释至刻度，摇 匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取0.5ml，置100ml量瓶中，用正己烷-乙醇 (70:30)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别精密量取供试品和对照溶液各20μl注 入液相色谱仪，记录色谱图。按不加校正因子的主成分自身对照法计算R-异构体的量。

结果见表4。

表4三批样品中R-异构体含量

样品批号 20130703 20130704 20130705 R-异构体(％) 0.13 0.09 0.11

对比例1ULTRONES-CD色谱柱反相HPLC检测苯磺贝他斯汀与R-异构体

以下实验参照进口标准(JX20060221)异构体的鉴别方法进行。

色谱柱：ULTRONES-CD(填料是β-环糊精，4.6×250mm,5μm)

流动相：0.02mol/lKH₂PO₄水溶液-乙腈(75:25)；

检测波长：225nm；

方法：分别取苯磺贝他斯汀对照品与R-异构体对照品适量，加乙醇适量超声使溶解， 用正己烷稀释至刻度制成每1ml约苯磺贝他斯汀1mg和R-异构体50μg的混合溶液，其它色 谱条件同实施例1进行。

图3是ULTRONES-CD色谱柱初次使用记录的色谱图；图4是该色谱柱使用一个月后， 采用同样色谱方法条件记录的色谱图。分离数据见表5。

表5ULTRONES-CD色谱柱使用前后分离数据对比

表5中数据说明：ULTRONES-CD色谱柱使用一个月后对苯磺贝他斯汀及R-异构体的 分离度明显降低，明显低于本发明方法中的分离度(实施例1表2)，理论板数亦明显降低。

证明对比例1方法的分离效果明显不如本发明方法，且该方法色谱柱耐用性差。

对比例2ULTRONES-OVM色谱柱反相HPLC(高效液相色谱)检测

以下实验参照专利(CN1098262C)中异构体的测定方法进行。

色谱柱：ULTRONES-OVM(填料是卵蛋白键合硅胶，150mm×4.6mm)

流动相：0.02mol/LKH₂PO₄水溶液(pH4.6)-乙醇(100:8)

检测波长：220nm；

检测方法同对比例1。

图5是ULTRONES-OVM色谱柱初次使用记录的色谱图；图6是该色谱柱使用三个月 后，采用同样色谱方法条件记录的色谱图。分离数据见表6：

表6ULTRONES-OVM色谱柱使用前后分离数据对比

表6中数据说明：ULTRONES-OVM色谱柱使用三个月后对苯磺贝他斯汀及R-异构体 的分离度明显降低，明显低于本发明方法中的分离度(实施例1表2)，贝他斯汀峰理论板 数亦明显降低。

证明对比例2方法的分离效果明显不如本发明方法，且该方法色谱柱耐用性差。