石柑子HPLC指纹图谱的构建方法及其HPLC指纹图谱

摘要

本发明公开了石柑子HPLC指纹图谱的构建方法及其HPLC指纹图谱，基于高效液相色谱技术构建的指纹图谱。该指纹图谱具有16个共有峰，其相对保留时间tg分别为：0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、0.507min、0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、1.525min、1.544min、1.579min。通过指纹图谱中共有峰的有无，可全面地对石柑子的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及中药质量检测技术领域，特别是涉及一种石柑子HPLC指纹 图谱的构建方法及其HPLC指纹图谱。

背景技术

柑子是天南星科石柑属植物石柑子Pothoschinensis(Raf.)Merr.的干燥全 草，是瑶医老班药“五虎、九牛、十八钻、七十二风”之一的葫芦钻。石柑 子性平，味淡，具有祛风除湿、活血散瘀、消积止咳的功效，在瑶族地区常 用于治疗跌打损伤、风湿骨痛，疗效显著。由于中药成分复杂，仅凭单一指 标难以准确评价中药的质量。中药指纹图谱是指某种(某产地)中药所共有 的具有特征性的某类或某几类成分的色谱或者光谱图谱。中药指纹图谱因其 具有整体性、模糊性和可量化的特点，能够全面地反应中药的内在质量，目 前已成为中药质量控制最有效的方法之一。

但目前尚无石柑子药材的质量标准，对石柑子药材质量的控制就显得非 常薄弱，只包括显微鉴别等常规性检查，缺乏完善的质量评价体系，难以达 到对石柑子质量的有效控制。

发明内容

本发明的目的在于提供石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，该方法采用 高效液相色谱(HPLC)建立其指纹图谱，并用相似度软件进行评价，可全 面地对石柑子的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药的有效性 与安全性。

其具体的技术方案如下：

一种石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的配制：取石柑子粉末(过四号筛)2g，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟， 放冷，再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液10ml， 蒸干，残渣加50％甲醇溶解并定容至2ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液， 即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照 品适量，分别加甲醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60.42μg、丁香酸120.14μg 和香草酸71.25μg的混合溶液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(3)高效液相色谱分析：

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，

色谱条件如下：色谱柱：ThermoODS-2Hypersil色谱柱，填料粒径5μ m，柱长250mm，柱内径4.6mm；

流动相：以甲醇为流动相A，体积百分含量为0.4％的磷酸水溶液为流动 相B，采用梯度洗脱方式：从0-15mim，流动相A的体积百分含量由10％提 高至20％，流动相B的体积百分含量由90％降低至80％；从15-25mim，流 动相A的体积百分含量为20％，流动相B的体积百分含量为80％；从 25-35mim，流动相A的体积百分含量由20％提高至25％，流动相B的体积 百分含量由80％降低至75％；从35-45mim，流动相A的体积百分含量由25％ 提高至28％，流动相B的体积百分含量由75％降低至72％；从45-50mim， 流动相A的体积百分含量为28％，流动相B的体积百分含量为72％；从 50-60mim，流动相A的体积百分含量由28％提高至32％，流动相B的体积 百分含量由72％降低至68％；从60-70mim，流动相A的体积百分含量由32％ 提高至40％，流动相B的体积百分含量由68％降低至60％；从70-90mim， 流动相A的体积百分含量由40％提高至70％，流动相B的体积百分含量由 60％降低至30％；从90-120mim，流动相A的体积百分含量为70％，流动相 B的体积百分含量为30％；检测波长：300nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；

(4)测定24批石柑子药材并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成 的石柑子HPLC的标准指纹图谱。

所述的石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，其还包括以下步骤：

(5)所述标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性试验，

(51)精密度试验：

取同一供试品溶液，连续进样6次，以11号峰为参照峰，计算出1-16 号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相 似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.990，表明仪器稳定，精 密度良好；

(52)重现性试验：

取同一批石柑子粉末，精密称取6份，按步骤(51)下供试品制备方法 平行制备6份供试品溶液，分别进样，以11号峰为参照峰，计算出1-16号 共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明所述石 柑子HPLC指纹图谱的构建方法重现性良好；

(53)稳定性试验：

取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进样检测，以11 号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD值均小于3％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

本发明的另一目的是提供上述方法构建得到的石柑子HPLC的标准指纹 图谱，所述石柑子HPLC的标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时 间tg分别为：0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、 0.507min、0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、 1.525min、1.544min、1.579min。

本发明具有如下优点和用途：通过高效液相色谱(HPLC)建立石柑子 HPLC的标准指纹图谱，并通过试验确定标准指纹图谱的精密度、重现性及 稳定性；通过指纹图谱中共有峰的有无，可全面地对石柑子的质量进行评价， 保证药材质量的稳定性及临床用药有有效性与安全性。

下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。

附图说明

图1为石柑子HPLC标准指纹图谱；

图2为24批石柑子的HPLC指纹图谱叠加图；

图3为不同流动相系统的HPLC色谱图；

图4为不同浓度磷酸水溶液的HPLC色谱图；

图5为不同提取溶剂的HPLC色谱图；

图6为精密度试验叠加图；

图7为重复性试验叠加图；

图8为稳定性试验叠加图。

具体实施方式

参见图1～图2，以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。

选用Waterse2695-2489型高效液相色谱仪(美国)：PAD检测器，四元 梯度泵，Empower2数据处理软件系统；MilliporeAdvantageA10超纯水系统 (美国)；MettlerToledoXS205DU型电子分析天平(瑞士)；KQ5200DE型 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-8型数显恒温水浴锅(金 坛市科析仪器有限公司)。

选用阿魏酰酪胺(自制，纯度≥99.5％)，丁香酸(自制：纯度≥99.0％)， 香草酸(批号：X-030-140801，购自成都瑞芬思生物科技有限公司)；液相用 甲醇为色谱纯(Merck)；液相用水为超纯水；提取用水为广东省第二中医院 制剂室自制纯化水；其余试剂均为分析纯。

色谱条件：色谱柱：ThermoODS-2Hypersil色谱柱(4.6×250mm，5μ m)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.4％磷酸水溶液为流动相B，按表1 进行梯度洗脱；检测波长：300nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。

表1梯度洗脱程序

供试品溶液的配制：取石柑子粉末(过四号筛)约2g，精密称定，置具 塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷， 再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液10ml，蒸干， 残渣加50％甲醇溶解并定容至2ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照品适量， 分别加甲醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60.42μg、丁香酸120.14μg和香草酸 71.25μg的混合溶液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

指纹图谱的建立：测定24批石柑子药材HPLC指纹图谱，并进行分析 比较，得到由其共有特征峰构成的石柑子HPLC的标准指纹图谱(如图1、2 所示)，其中2号峰为香草酸，3号峰为丁香酸，11号峰为阿魏酰酪胺.

选定该24批样品，将其导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图 谱相似度评价系统(2004A版)”，选取时间窗宽度为0.1min，以中位数生 成对照谱图，经过多点校正后自动匹配，生成石柑子指纹图谱共有模式，并 计算24批样品的指纹图谱与该共有模式的相似度。以11号峰为参照峰，计 算得出该标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时间tg分别为： 0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、0.507min、 0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、1.525min、 1.544min、1.579min。

将其导入药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)， 进行色谱峰匹配，以11号峰为参照确定16个共有峰为构成石柑子指纹图谱 的特征峰，样品共有峰的相对保留时间及相对峰面积分别列于表2、表3，24 批石柑子与标准指纹图谱相似度计算结果分别为：0.958、0.952、0.916、0.954、 0.971、0.919、0.908、0.941、0.926、0.968、0.993、0.952、0.911、0.975、0.998、 0.952、0.969、0.948、0.956、0.915、0.992、0.979、0.975、0.907。

表224批石柑子指纹图谱共有峰相对保留时间

表324批石柑子指纹图谱共有峰相对峰面积

本实施例中，参见图3(图中A为乙腈-水；B为甲醇-水；C为甲醇-甲 酸水溶液；D为甲醇-磷酸水溶液)，图4(图中A为0.05％磷酸水溶液；B 为0.1％磷酸水溶液；C为0.4％磷酸水溶液)，对流动相条件的进行优化，分 别试验了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液4种流动相 系统，并考察了不同浓度的磷酸水溶液对石柑子色谱行为的影响。结果表明， 以乙腈-水为流动相时，大部分成分过早地被洗脱下来，色谱峰堆积在前30 分钟，分离度较差；以甲醇-水为流动相时，谱图信息较少，无法全面反映石 柑子的内在质量；以甲醇-甲酸水溶液为流动相时，色谱峰峰形较差。以甲醇 -磷酸为流动相时，色谱信息较丰富且峰形较好，见图3。流动相中以0.4％磷 酸水溶液为佳，若采用0.05％或0.1％的磷酸水溶液，则部分色谱峰分离度较 差，见图4。确定以甲醇-0.4％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。

提取溶剂的选用，参见图5(A为水；B为乙醇；C为甲醇；D为50％ 甲醇)分别以水、乙醇、甲醇、50％甲醇作为提取溶剂对样品进行提取，并 对所得图谱进行比较。结果表明，采用水作为提取溶剂时，样品中极性较小 的成分没有被充分提取出来，色谱峰主要集中在前50分钟；而采用乙醇和甲 醇作为提取溶剂时，样品中极性较大的成分难以提取出来，大部分色谱峰的 保留时间都在60分钟以后，且提取液中叶绿素等杂质较多，对色谱柱污染严 重；而采用50％甲醇作为提取溶剂时，样品中成分提取完全，图谱信息丰富， 能最大限度的反映药材的成分特征，且降低了叶绿素等杂质的干扰和污染， 因而采用50％甲醇作为样品的提取溶剂。

精密度试验：取同一供试品溶液(S20)，连续进样6次，所得指纹图谱 叠加图见图6。采用中药色谱指纹图谱评价分析系统2004A版对其指纹图谱 进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，各图谱的相似度均大于0.990。以 11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积 的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度 均大于0.990，表明仪器稳定，精密度良好。结果见表4、5、6。

表4精密度试验指纹图谱相似度分析结果

表5精密度试验共有峰相对保留时间

表6精密度试验共有峰相对峰面积

重现性试验：取同一批石柑子粉末(S20)，精密称取6份，按供试品制 备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，同法进行检测，所得指纹图谱 叠加图见图7。采用相似度评价软件对其指纹图谱进行分析，与生成的对照 指纹图谱相比，6份样品的相似度均大于0.990。以11号峰为参照峰，计算 出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表 明该方法重现性良好。结果见表7、8、9。

表7重复性试验指纹图谱相似度分析结果

表8重复性试验共有峰相对保留时间

表9重复性试验共有峰相对峰面积

稳定性试验：取同一份供试品溶液(S20)，分别于0，2，4，8，16，24h 进样检测，所得指纹图谱叠加图见图8。采用相似度评价软件对其指纹图谱 进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，各图谱的相似度均大于0.990。以 11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积 的RSD值均小于3％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合指纹图谱技 术要求。结果见表10、11、12。

表10稳定性试验指纹图谱相似度分析结果

表11稳定性试验共有峰相对保留时间

表12稳定性试验共有峰相对峰面积

相似度评价分析：24批石柑子样品指纹图谱的相似度计算结果见表13， 由结果可知，24批样品中，12批样品的相似度在0.9以上，8批样品的相似 度在0.8～0.9之间，其余4批样品的相似度在0.7～0.8之间。

对相似度在0.8以下的4批样品进行分析，11号样品中茎的部分较多而 叶的部分较少，从而导致化学成分有所不同，共有峰较少；12号样品生长年 限较短，叶片较幼嫩，叶绿素较多，成分富集不够；而22号样品在贮存过程 中有少量霉变，可能导致部分成分发生变化。表明石柑子药材的质量受到生 长年限、采收加工和储存条件等诸多因素的影响。

表1324批石柑子HPLC指纹图谱相似度

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于 本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若 干变动和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范 围应以所附权利要求为准。