一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法为：第一步、设计特异性的定量引物；第二步、乳腺组织RNA的提取；第三步、将乳腺组织RNA反转录为cDNA；第四步、进行荧光定量PCR反应。有益效果：提供了一种简单、快速、低成本、精确度高、便于在基因组水平上筛查和检测C4BPA基因与奶牛乳脂代谢的相关性的定量PCR方法。为进一步研究该基因及探讨可能影响奶牛乳脂的基因提供了依据及可靠的研究方法。本发明筛查获得C4BPA基因与奶牛乳脂代谢相关，可用于奶牛的育种工作，以便满足不同人群对牛奶中乳脂含量的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量PCR检测方法，特别涉及一种牛乳脂代谢相关基因 C4BPA定量PCR检测方法。

背景技术

当前，荧光定量PCR技术是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出 的一种新定量试验方法，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行 分析，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线 性关系，所以成为定量的依据。荧光定量PCR所使用的荧光化学有两种，一种 是荧光探针，如TaqMan荧光探针，在PCR扩增时加入一对引物同时也加入一个 特异性的荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，当 探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发射荧光，但当PCR 扩增时，Taq酶的外切酶活性将探针酶切使其降解，使报告荧光基团和淬灭荧光 基团相互分离，从而荧光检测系统就可以接受到荧光信号，从而实现了对荧光 信号的累积。另一种是SYBR荧光染料，将SYBR荧光染料非特异性的插入DNA 双链后,发射出荧光信号，而不能插入的SYBR染料分子则不能发射荧光，这样 保证荧光信号和PCR产物同步增加。

转录组测序是基因功能及结果研究的基础和出发点，通过高通量测序，能 全面的获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的所有转录本序列信息，而 C4BPA基因是通过对高乳脂奶牛及低乳脂奶牛的乳腺组织进行转录组测序选择 出的差异基因。

C4(Complement4)是补体系统中补体激活第一途径中的一个重要成分， 1977年Ferreira等报道了小鼠血清中的一种蛋白质,其分子结构模式现多以 Dahlback等描述的蜘蛛样结构来进行分析，能与补体C4成分特异性结合，同时 也发现人中也有该种物质，而这种物质被称为C4结合蛋白。

C4BP(complementcomponent4bindingprotein)是参与控制补体活化 的抑制因子，对维持补体在体内的平衡起重要的调节作用。C4BP也是作为I性 因子的一种辅因子，促进I性因子对C4b的裂解，也有抑制C3转化酶的活性的 作用。C4BP是由7条相同的α链和1条β链组成，并且C4b的结合位点是位于 α链，而β链是蛋白质S的结合位点。2012年HillarpA等发现兔子和牛的血清 中缺乏C4BP蛋白质S的复合体，β链基因未表达,而鼠的β链基因也被进化成 一种假基因。2014年StricklandDK等发现C4BP的α链上有结合LRP的结合位 点。LRP能够与多种结构及功能各异的配体相互作用，不仅可以对血脂的动态平 衡及纤溶系统功能的稳定进行调节的作用，而且能参与多种生长因子、细胞激 酶、生物学效应的发挥。C4BP可以通过结合孔蛋白，可以稳定调节血清对淋球 菌的抵抗性，人类的C4BP可以选择性的与淋病奈瑟氏菌相互作用，而造成物种 间特异性的感染。2006年JenkinsHT等发现C4BP与淋病奈瑟氏球菌、百日咳 博德特氏杆菌、化脓性链球菌、大肠杆菌的相互作用，是定位于C4BP的α链的 不同区域，α链上有与其结合的相应位点，并使其表达出相应的性状。因此进 一步研究C4BP的α链具有重要的意义，研究其他功能和作用也具有很大的价值。 但目前对于C4BPA基因的研究还比较少，关于C4BPA基因与奶牛乳脂代谢相关 性的研究尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方 法。

本发明提供的牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法如下 所述：

第一步、设计特异性的定量引物，得到的引物序列如下所示：

C4BPA正向引物F：5’AGATACACCTGTCGTCCTGGC3’

C4BPA反向引物R：5’TCTGTCTTAACTATCACTTGCCCA3’

用所示的特异性定量引物在奶牛的基因组中进行PCR扩增，反应结束后， PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

第二步、乳腺组织RNA的提取：

取高乳脂和低乳脂奶牛的乳腺组织，利用Trizol法进行组织RNA提取，经 过裂解、分层、沉淀、洗涤、干燥及溶解的步骤，将获得的RNA进行分装,利 用琼脂糖凝胶电泳检测后，用分光光度计测总RNA的浓度，调整浓度统一后， 于-80℃的冰箱冻存备用；

第三步、将乳腺组织RNA反转录为cDNA：

将提取的总RNA调整浓度统一后，采用反转录试剂盒将所提取的组织RNA 反转录成cDNA样品，总RNA的反转录体系：5×RNARTBuffer4.0μl；dNTP Mixture10mm2.0μl；Oligo-dT1.0μl；AMVReverseTranscriptase 0.5μl；RNaseinhibitor0.5μl；TotalRNA1.0μl；RNaseFreeH₂O 7.0μl，反转录条件为：70℃5min；冰浴2min；42℃60min；75℃15min； 冰浴10min，所得产物储存于-80℃冰箱中备用；

第四步、进行荧光定量PCR反应：

进行荧光定量PCR时的反应体系20μl，包括2×SYBRmix，10μl；cDNA 模板，1.0μl；ddH₂O8μl；上下游引物各0.5μl，反应条件为：95℃30s； 95℃5s，60℃30s，40个循环。

上述第二步中裂解、分层、沉淀、洗涤、干燥及溶解的具体步骤如下：

裂解:加入裂解液Trizol1ml,将研磨好的组织粉末分别加入EP管中,室温 下裂解5Min；

分层:加入0.2ml的氯仿，颠倒混匀，15～30℃静置10min，再用4℃大离 心机进行离心，12000r离心15Min；

沉淀:吸上清置新的离心管中，加0.5ml的异丙醇充分混匀后15～30℃静 置10min，在4℃的低温离心机以12000r离心13Min，弃上清；

洗涤：加入1ml75％的冷乙醇，轻轻洗涤沉淀，短暂震荡混匀，在4℃， 12000r离心5Min，弃上清；

干燥：室温空气干燥10MinRNA沉淀至半透明；

溶解：加入适量的DEPC0.02ML处理水溶解，最后将获得的RNA进行分装。

本发明的有益效果：

本发明通过对部分乳脂性状关联分析，尤其是对奶牛部分乳脂性状进行关 联分析并预测相应基因对其个体乳脂性状的影响。提供了一种简单、快速、低 成本、精确度高、便于在基因组水平上筛查和检测C4BPA基因与奶牛乳脂代谢 的相关性的定量PCR方法。为进一步研究该基因及探讨可能影响奶牛乳脂的基 因提供了依据及可靠的研究方法。本发明筛查获得C4BPA基因与奶牛乳脂代谢 相关，可用于奶牛的育种工作，以便满足不同人群对牛奶中乳脂含量的要求。

附图说明

图1为奶牛乳腺组织中提取总RNA的电泳图。

图2为奶牛的目的基因PCR扩增产物电泳图。

图3为C4BPA基因在不同奶牛乳腺组织中的表达量差异分析的溶解曲线图。

图4为内参引物在不同奶牛乳腺组织中的表达量差异分析的溶解曲线图。

具体实施方式

一、试验材料与方法：

1实验材料：

1.1试验动物：

研究选用生长在同一环境下并处于泌乳期的中国荷斯坦奶牛15头，应用乳 成分分析仪对奶牛的乳脂率进行检测，早晚各1次，连续检测10天。选取高乳 脂的中国荷斯坦奶牛及低乳脂的中国荷斯坦奶牛各3头，屠宰后取其乳腺组织 迅速液氮保存。乳脂率的检测结果如下表1

表1.高乳脂和低乳脂奶牛的乳脂率的测定

奶牛序号 乳脂率±标准误 4 3.5530±0.0367 5 3.6810±0.00277 6 3.7180±0.00249 9 3.8470±0.00597 11 4.4290±0.01038 13 4.8030±0.02595

1.2试验试剂：

琼脂糖(BIOWEST)；氯仿、异丙醇、乙醇等均为国产分析纯；TAE、水焦磷 酸二乙酯(DEPC)、ddH2O，购自Sigma公司；RT-PCR试剂盒(BioRTcDNAFirst StrandSynthesiskit),购自杭州博日科技有限公司；2×SYBRPremixExtaq (TliRnasePlus)荧光定量试剂盒(TaKaRa)。PCR引物由上海生物工程公司合 成。

1.3分析软件：

PCR引物设计软件：PrimerPremier5；

数据分析软件：SPSS13.0；

2.试验方法：

本实验采用的是高乳脂和低乳脂中国荷斯坦奶牛的乳腺组织进行的RNA提 取，并将其反转录为cDNA,以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，对其表达量 进行分析，下面是对本发明做的进一步详细描述，所述是仅是对本发明的解释 不是限定。

2.1乳腺组织RNA的提取

将在液氮中储存的3头高乳脂及3头低乳脂的中国荷斯坦奶牛的乳腺组织 取出，研磨成粉末状利用Trizol法进行组织RNA提取。

1)裂解：EP管中加入裂解液(Trizol)1ml,将研磨好的组织粉末分别加 入EP管中,加入离心管中室温下裂解5Min；

2)分层：向离心管中加入0.2ml的氯仿，颠倒混匀，15～30℃静置10min， 再用4℃大离心机进行离心，12000r离心15Min(DNA和蛋白质被抽提进入有机 相，RNA留在水相)；

3)沉淀：吸上清置新的离心管中，加0.5ml的异丙醇充分混匀后15～30℃ 静置10min，在4℃，12000r离心13Min，弃上清；

4)洗涤：加入1ml75％的冷乙醇，轻轻洗涤沉淀，短暂震荡混匀，在4℃， 12000r离心5Min，弃上清；

5)干燥:室温空气干燥RNA沉淀至半透明，约10Min,不要让RNA干透；

6)溶解：加入适量的DEPC0.02ML处理水溶解，分装-80℃冻存备用。

将获得的RNA分装，电泳检测后，结果如图1所示。用分光光度计测总RNA 的浓度，调整浓度统一后，于-80℃的冰箱冻存备用。

2.2采用反转录试剂盒将所提取的组织RNA反转录成cDNA样品。

建立的反转录体系如下表2所示。反转录条件为：70℃5min；冰浴2min； 42℃60min；75℃15min；冰浴10min。所得产物储存于-80℃冰箱中备用。

表2.建立的反转录体系

2.3C4BPA基因的引物设计，根据Ensembl数据库(ENSBTAT00000050299) 提供的牛C4BPA基因序列，应用PrimerPremier5.0软件设计引物，并由上海 生工生物技术有限公司合成。

引物序列如下：C4BPA-F5’-AGATACACCTGTCGTCCTGGC-3’，C4BPA-R5’ -TCTGTCTTAACTATCACTTGCCCA-3’,将所设计的引物进行PCR扩增，对得到的PCR 产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，扩增的片段大小与目的基 因的大小相符，无杂带，条带清晰，没有二聚体，表明所设计的引物可以用于 后续的荧光定量PCR试验。

2.4实时定量PCR反应体系和条件。

以所提取的奶牛乳腺组织的cDNA为模板(3个样品重复)进行荧光定量PCR， 反应体系如下表3所示。反应条件为：95℃30s,95℃5s,60℃30s，40个循 坏。

表3实时定量PCR反应体系

2×SYBR mix 10.0μl cDNA Template 1.0μl ddH₂O 8.0μl 上游引物 0.5μl 下游引物 0.5μl

3.筛查获得的C4BPA基因在不同中国荷斯坦奶牛乳腺组织中的表达量差异 分析及应用

为了确定C4BPA基因在不同奶牛乳腺组织中均有表达且表达量差异显著 (P<0.05)，与中国荷斯坦奶牛的乳脂代谢的相关性，采用实时荧光定量的方法 进行相关性的检测，采用SPSS13.0的ONE-WAYANOVA的方法分析C4BPA基因对 中国荷斯坦奶牛乳脂代谢的相关性。

应用荧光定量PCR技术检测查C4BPA基因与中国荷斯坦奶牛乳脂代谢的相 关性研究，通过对筛选出的3头高脂高蛋白奶牛和3头低脂低蛋白奶牛乳腺组 织RNA的提取，反转录成cDNA,并以之为模板，设计荧光定量引物，进行荧光 定量PCR反应，得到6头奶牛的乳腺组织中的表达量的CT值，采用的是2-^ΔΔCT方法计算6头奶牛的乳腺组织C4BPA基因的表达量，以检测C4BPA基因的表达 量。试验数据均以平均值±标准误差表示，C4BPA基因在不同奶牛的乳腺组织的 表达量如下表4所示。对于C4BPA基因在不同奶牛的乳腺组织中的表达情况， C4BPA基因在不同奶牛的乳腺组织中的表达量差异分析，在各组样品中观察溶 解曲线，反应的溶解曲线如图3和图4所示，峰值单一说明特异性良好，各个 峰值基本一致，未见其杂峰信号，PCR参数选择合理，产物的特异性较好，非特 异性产物对试验结果的影响较小，结果可信。

表4C4BPA基因在不同奶牛的乳腺组织的表达差异分析

奶牛 表达量±标准误 高乳脂奶牛 1.7833±0.039 低乳脂奶牛 6.1367±0.120

注：表达量EX＝2^-ΔΔct

4.本发明制备的一种与中国荷斯坦奶牛乳脂代谢相关的C4BPA基因的定量 PCR检测技术在中国荷斯坦奶牛牛群体中应用：

4.1C4BPA基因在奶牛乳腺组织中表达量的相关性分析；

C4BPA基因在所检测的6个不同的乳腺组织中均有表达，且在高乳脂奶牛中 的表达量显著低于低乳脂奶牛(p＝0.026<0.05)。表明C4BPA基因与中国荷斯坦 奶牛的乳脂代谢显著相关，可进一步为遗传育种工作者构建低脂奶牛或高脂奶 牛的育种工作奠定基础，满足对不同人群的不同需求。

为进一步研究该基因及探讨可能影响中国荷斯坦奶牛乳脂的基因提供依据 和可靠的研究方法。