一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成。本发明通过加入环引物显著提升反应速率，与PCR技术相比，检测时间减少约50%，在检测成本方面也较PCR明显减少。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速定性检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的试剂盒及其应用。

背景技术

前列腺癌（Prostatecancer，Pca）是常见的泌尿系恶性肿瘤，据美国肿瘤学会报道，Pca在美国的发病率已经超过肺癌成为第一位，死亡率也高居第2。随着生活节奏的加快和饮食结构的西化，在我国及其他亚洲国家，Pca的发病率也在逐年升高，且发病年龄也趋于年轻化。早期诊断Pca可通过根治性切除术彻底治愈。因此，早期诊断对Pca的治疗和患者的预后至关重要。

目前在临床上仍根据前列腺特异性抗原（PSA）是否异常，指导前列腺穿刺活检用来诊断Pca，具有一定的应用价值，但是血清PSA为前列腺特异性抗原，只具备组织特异性而不具备肿瘤特异性。前列腺增生、前列腺炎等良性病变也可使PSA表达升高，导致许多患者遭受了不必要的活检，暴露出PSA在Pca诊断中的局限性。因此，探寻敏感性及特异性更加优越的Pca肿瘤标志物，对提高Pca的早期诊断有着十分重要的意义。

PCA3被认为是Pca的特异性基因，研究表明其在前列腺癌组织中高度表达，在正常前列腺组织或者前列腺增生组织中无表达或低表达，在其他肿瘤组织及器官中也无表达。但由于PCA3基因为非编码基因，不表达为蛋白质，检测起来有一定难度。目前用于检测PCA3基因最常用的方法为核酸扩增技术（PCR），虽然扩增结果稳定可靠，但检测时程长，成本较高，操作繁琐，不利于缺少技术设备的基层单位进行检测。

环介导等温扩增法（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）是一种新型的核酸扩增方法，它采用4条特异性引物及1条环引物识别靶基因，其可在等温条件下1小时可将目的序列扩增10^9倍以上。LAMP反应会产生大量的焦磷酸根离子，它们与LAMP反应体系中的镁离子（Mg2+）结合产生焦磷酸镁沉淀，引起浊度变化，十分便于观察，且整个扩增过程只需要一台水浴锅，大大加快了扩增进程并节省了实验成本。如在LAMP反应体系中加入钙黄绿素（一种荧光指示剂），那么在反应结束后会产生黄绿色荧光。不仅如此，随着LAMP技术的逐渐发展，实时浊度检测仪器也于今年来问世，将配置好的LAMP反应体系置于浊度仪上进行反应可实时观测浊度曲线，了解反应进程。

目前，公开的试剂盒反应体系不够稳定，不利于检测结果的快速获取且假阳性结果较多，因此使得该试剂盒的商业使用受到了限制。

发明内容

本发明通过设计合适的引物并优化检测条件，提供一种快速、定性检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的试剂盒。该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成，所述的引物序列如下：

F3(外引物)：TGGATATTTATTTGAACGGGAT；

B3(外引物)：AACGCACAGTTTAGGCAG；

LB(环引物)：GGGAGGAGATAACCACGGG；

FIP(内引物)：AGCCATCAAGATTTTCTCGTCTGTTTTTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG；

BIP(内引物)：TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。

上述各引物量浓度分别为：FIP/BIP40μM、F3/B35μM、LB20μM。

本发明所述的2倍环介导等温扩增反应缓冲液（2×LAMP反应液）由40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL）、20mM氯化钾（KCL）、16mM硫酸镁（MgSO4）、20mM硫酸铵（（NH4）2S04)1.6mM甜菜碱（Betaine）、2.8mM的dNTPs和0.2%质量百分浓度的吐温20（Tween20）组成。其中mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。

本发明的所述阳性对照可以由以下方法制备得到：按常规的Trizol法由前列腺癌组织中提取RNA，逆转录成cDNA之后，PCR法扩增包含等温扩增部分的一段序列，扩增结束经测序鉴定后，装入T载体克隆后抽提质粒DNA，测定DNA浓度，然后调整浓度为每微升10^6拷贝作为阳性对照。

本发明所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的BstDNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/微升；所述的阳性对照为含人前列腺癌特异性基因PCA3的cDNA样本；阴性对照为双蒸水；所述显色剂为钙黄绿素螯合剂，所述钙黄绿素螯合剂，为钙黄绿素与Mg2+的螯合物，是一种荧光指示剂。LAMP反应的副产物焦磷酸离子与镁离子结合释放钙黄绿素，发出黄绿色荧光。以上试剂均由上海生工生物技术公司提供。

本发明还提供一种检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的方法，具体包括以下步骤：

（1）常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；

（2）配置扩增体系，每25ul扩增体系中，含有外引物1ul；内引物1ul，环引物1ul，2倍环介导等温扩增反应缓冲液12.5ul，BstDNA聚合酶0.9ul，鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul，步骤（1）中RNA提取液1～5ul(具体用量根据提取物来源不同，组织来源1～2ul，血液、尿液来源4～5ul)，其余为去离子水及钙黄绿素显色剂（如采用实时浊度分析仪可不加）；63℃恒温反应1小时；

（3）反应结束后，可直接肉眼观察，反应管内液体变为黄绿色说明检测结果阳性；如采用实时浊度分析仪检测可直接观察反应扩增曲线，如有曲线记录则为阳性。

本发明的工作原理是：LAMP反应分为三步，即：起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。环介导等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物扩增所需要的模板，即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因DNA片段，由于内引物扩增的DNA片段含有该引物5’端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，根据LAMP反应的反应原理，一般扩增反应均在1小时的扩增时间内达到平台期，而如果反应开始的时间约晚就越容易造成一些中间产物相互反应，导致假阳性的产生，影响实验的准确性。为此，我们在哑铃状结构的5’末端的环状单链部分导入具有互补序列的环引物，可增加DNA合成的起点，可使反应开始的时间提升约20%，并在1小时该循环反应可使靶DNA累积到10^9拷贝，可通过荧光染料或实时浊度分析仪来观察扩增结果。

与现有技术相比，本发明通过加入环引物显著提升反应速率，平均反应开始时间为19.3min，而在之前的研究中未加入环引物平均反应开始时间为24.1min。在实验结果可靠性的比较中，加入环引物后假阳性结果明显减少。与PCR技术相比，检测时间减少约50%，在检测成本方面也较PCR明显减少。

附图说明

图1为自然灯光下各个样本的LAMP结果。

图2为各个样本的实时浊度仪扩增曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

如图所示。图1中1~6号管为前列腺癌患者标本经LAMP反应后的情况，可直观看出产生黄绿色荧光，而7~8号的良性前列腺增生患者无荧光产生。图2中1~5号扩增区域为前列腺癌患者血样，6~8号扩增区域为前列腺增生患者血样，平均的反应开始时间提升约20%。一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，包括：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂；所述的引物是根据DNA序列数据库公布的人类PCA3基因序列设计的一对外引物、一对内引物及一组环引物，序列如下：

F3(外引物)：TGGATATTTATTTGAACGGGAT；

B3(外引物)：AACGCACAGTTTAGGCAG；

LB(环引物)：GGGAGGAGATAACCACGGG；

FIP(内引物)：AGCCATCAAGATTTTCTCGTCTGTTTTTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG；

BIP(内引物)：TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。

上述各引物量浓度分别为：FIP/BIP40μM、F3/B35μM、LB20μM。

本发明所述的2倍环介导等温扩增反应缓冲液（2×LAMP反应液）由40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL）、20mM氯化钾（KCL）、16mM硫酸镁（MgSO4）、20mM硫酸铵（（NH4）2S04)1.6mM甜菜碱（Betaine）、2.8mM的dNTPs和0.2%质量百分浓度的吐温20（Tween20）组成。其中mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。

本发明还提供一种检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的方法，具体包括以下步骤：

（1）常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；

（2）配置扩增体系，每25ul扩增体系中，含有外引物1ul；内引物1ul，环引物1ul，2倍环介导等温扩增反应缓冲液12.5ul，BstDNA聚合酶0.9ul，鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul，步骤（1）中RNA提取液1～5ul(具体用量根据提取物来源不同，组织来源1～2ul，血液、尿液来源4～5ul)，其余为去离子水及钙黄绿素显色剂（如采用实时浊度分析仪可不加）；63℃恒温反应1小时；

（3）反应结束后，可直接肉眼观察，反应管内液体变为黄绿色说明检测结果阳性；如采用实时浊度分析仪检测可直接观察反应扩增曲线，如有曲线记录则为阳性。

实施例1：一种环介导等温扩增检测前列腺癌组织标本PCA3基因的方法，该方法

（1）肿瘤组织标本RNA提取

取新鲜手术切除前列腺癌组织标本，大小5mm×5mm×5mm，液氮隔夜保存后研钵中磨碎，采用Trizol试剂提取总RNA。

（2）逆转录—环介导等温反应体系（检测管）

2×LAMP反应液12.5ul

一对外引物1ul

一对内引物1ul

一组环引物1ul

RNA提取液（检测物）2ul

鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul

钙黄绿素螯合剂1ul

去离子水补至25ul

（3）同样成分比例配置阳性及阴性对照反应体系

阳性对照反应体系

2×LAMP反应液12.5ul

一对外引物1ul

一对内引物1ul

一组环引物1ul

阳性对照cDNA溶液2ul

鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul

钙黄绿素螯合剂1ul

去离子水补至25ul

阴性对照反应体系

2×LAMP反应液12.5ul

一对外引物1ul

一对内引物1ul

一组环引物1ul

阴性对照双蒸水2ul

鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul

钙黄绿素螯合剂1ul

去离子水补至25ul

（4）恒温水浴或实时浊度仪中于63℃反应1小时。

（5）反应结束后肉眼观察反应管内颜色变化，变为黄绿色，说明检测结果阳性；用实时浊度仪可观察到浊度曲线。

实施例2：一种环介导等温扩增法检测外周血标本中PCA3基因表达的方法，该方法

（1）外周血标本RNA提取

抽取5ml静脉血用乙2胺四乙酸钠抗凝，于4℃用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，收集单个核细胞1.5ml至Eppendorf管中，采用TrizolLS试剂提取总RNA，加入15ul含焦磷酸2乙酯（DEPC）处理的水中保存。

（2）逆转录—环介导等温扩增反应体系（检测管）

2×LMAP反应液12.5ul

一对内引物1ul

一对外引物1ul

一组环引物1ul

RNA提取液（检测物）5ul

鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶0.1ul

BstDNA聚合酶0.9ul

钙黄绿素1ul

去离子水补至25ul

（3）配置阳性和阴性对照反应体系

其他成分比例同检测管，但阳性对照为5ulcDNA，阴性对照为1ul双蒸水。

（4）恒温水浴或实时浊度仪中于63℃反应1小时。

（5）反应结束后肉眼观察反应管内颜色变化，如变为黄绿色说明检测结果阳性。如配备实时浊度仪可观察浊度曲线予以判断结果。

<110>贾瑞鹏

<120>一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用

<160>1

<210>1

<211>3901

<212>DNA

<213>人工序列

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