一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法及其专用的引物对

摘要

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法及其专用的引物对。本发明的方法包括如下步骤：检测待测马铃薯的同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸是否为C、第896位脱氧核糖核苷酸是否为T和第1146位脱氧核糖核苷酸是否为A；本发明的引物对由序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成。通过实验证明：用本发明的引物对对马铃薯材料进行检测，检测结果与表型鉴定结果的吻合度达80％以上，其中对圆薯形的吻合度达90％以上，选择准确率高，稳定性好，而且在苗期就能对后代进行选择，不受植物生长阶段及环境条件影响，可有效加速马铃薯薯形育种进程，降低育种成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法及其 专用的引物对。

背景技术

马铃薯是世界第三大、我国第四大粮食作物，因其具有耐寒、耐贫瘠、高产稳产、 适应性广、营养全面等优点，在世界范围内广泛种植，对于保障我国及世界的粮食安 全具有重要意义。块茎形状即薯形是马铃薯的重要农艺性状之一，也是鉴别品种特征 的重要依据之一。不同的消费习惯和加工产品对薯形的要求不同，如东北地区消费者 偏好圆薯形品种，而中原和南方地区消费者偏好长薯形品种；一般炸条要求长薯形品 种，而炸片需要圆薯形品种。因此，选育特定薯形的品种满足不同消费者和加工需求， 对于促进马铃薯产业全面发展具有重要意义。

传统育种主要依赖于表型选择。可是环境条件、基因型、基因环境互作等多种因 素会影响表型选择的准确性。培育一个优良品种往往需要七、八年甚至十几年时间。 分子标记辅助选择技术可大大提高选择准确性和育种效率，从而加速马铃薯育种进程。 而获得易于操作且与特定性状紧密连锁的分子标记是进行标记辅助选择的前提。马铃 薯栽培品种是高度杂合的四倍体(2n＝4x＝48)作物，遗传背景狭窄、染色体高度杂合、 遗传重组频率高且存在严重的自交衰退现象，开发分子标记困难。而自然界中绝大多 数马铃薯以二倍体形式存在，相对于四倍体，二倍体染色体数目较少，遗传背景相对 简单，易于进行遗传分析和操作。同时，马铃薯单倍型基因组序列框架图已经完成， 覆盖了马铃薯95％以上的基因，为马铃薯分子标记的开发提供了资源。基于上述马铃 薯遗传特性，研究者大多利用二倍体材料开发标记，再将开发的标记应用到四倍体材 料中。但是，在将二倍体中开发的标记应用到四倍体材料过程中也会出现一些问题， 由于四倍体马铃薯在减数分裂过程中，有四条同源染色体发生配对，而且高度异质的 远缘杂种常导致在一个遗传位点存在多种等位基因组合形式，致使染色体发生交换重 组而出现标记与性状偏分离、筛选准确率低等问题。因此，二倍体材料中开发的标记 应用到四倍体材料中并不十分顺利。

到目前为止，已有几十个马铃薯性状被标记，如包括抗晚疫病、抗青枯病、抗病 毒病等的抗性性状，包括炸片颜色、块茎休眠、薯肉颜色等的品质性状以及耐旱性、 耐冻性等的抗逆性状。但目前可用于马铃薯薯形育种的标记很少，可用于四倍体马铃 薯薯形育种的标记更少，且目前所开发的薯形标记在应用于薯形筛选时，准确性和稳 定性较差，筛选效率低，实际应用效果差。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的方法包括如下步骤：检测待测马 铃薯的同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸是否为C、第896位脱氧 核糖核苷酸是否为T和第1146位脱氧核糖核苷酸是否为A：

1)若待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸 为C，且所述待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第896位脱氧核糖核 苷酸为T，且所述待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第1146位脱氧核 糖核苷酸为A，则待测马铃薯为或候选为圆薯形马铃薯；

2)若待测马铃薯的同源染色体上的目标基因不满足上述条件，则待测马铃薯为或 候选为长薯形马铃薯；

所述目标基因的序列如序列表中序列3所示。

上述方法中，所述检测待测马铃薯的同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核 糖核苷酸是否为C、第896位脱氧核糖核苷酸是否为T和第1146位脱氧核糖核苷酸是 否为A的方法为直接测序。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的引物对。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的引物对由序列表中序列1所示的 DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子组成。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的PCR试剂。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的的PCR试剂包括上述引物对。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的试剂盒。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯薯形的试剂盒包括上述引物对或上述 PCR试剂。

本发明的第五个目的是提供上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测 马铃薯为圆薯形马铃薯还是长薯形马铃薯中的应用。

本发明还提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在选育或辅助选育圆 薯形马铃薯和/或长薯形马铃薯中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为圆薯形马铃薯还 是长薯形马铃薯的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测马铃薯为圆薯形马铃薯还是长薯形马铃薯的方 法包括如下步骤：

(1)用上述引物对对待测马铃薯进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)用AflII内切酶对所述PCR扩增产物进行酶切，得到酶切产物；

(3)检测所述酶切产物的大小；

若酶切产物含有大小为700bp和200bp的片段；则待测马铃薯为或候选为圆薯形 马铃薯；

若酶切产物仅含有大小为900bp的片段；则待测马铃薯为或候选为长薯形马铃薯。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测马铃薯的基因组DNA；所述PCR扩增 的退火温度为60℃。

上述方法或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述应用中，所述圆薯形 马铃薯为块茎的最大纵轴的长度与最大横轴的长度的比值I＜1.4的马铃薯；所述长薯 形马铃薯为块茎的最大纵轴的长度与最大横轴的长度的比值I≥1.4的马铃薯；

所述纵轴为匍匐茎生长方向；

所述横轴为垂直于匍匐茎生长方向。

本发明的优点：

1)弥补目前马铃薯薯形标记不足及表观选择准确性差、筛选效率低、工作量大的 问题。

2)利用本发明开发的标记，在苗期就可以根据马铃薯的DNA进行鉴定，从而确 定其薯形，可节省人力物力，缩短育种周期。

本发明以马铃薯二倍体材料，基于马铃薯基因组相关序列信息，结合分离群体分 组分析法(BSA)提供了一种鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法并开发了一个可用于 马铃薯薯形辅助选择的分子标记1137-CAPSVI，可对马铃薯块茎形状进行准确、方便、 快速的筛选。通过实验证明：利用分子标记1137-CAPSVI对四倍体薯形材料进行检测， 检测结果与表型鉴定结果的吻合度达80％以上，其中对圆薯形的吻合度达90％以上， 选择准确率高，稳定性好，而且在苗期就能对后代进行选择，不受植物生长阶段及环 境条件影响，可有效加速马铃薯薯形育种进程，降低育种成本。

附图说明

图1为部分试验材料的基因组DNA的电泳检测。

图2为PCR产物经AflII酶切后的电泳图。其中，M：Marker；P1：320-02；P2： 10618-01；RB：圆形混池；LB：长形混池。

图3为四倍体材料薯形鉴定结果频率分布图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的长薯形亲本材料10618-01和圆薯形亲本材料320-02均在文献 “ZhangYong-fei，GeneticanalysisofpigmentedtuberFLeshinpotato，2009”中公开过， 公众可从中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所获得。

下述实施例中的LB固体培养基的配方(1L)：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl10 g、琼脂15g，加入蒸馏水定容至1L，PH调制7.2-7.4，高压灭菌15min。

实施例1、鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法及分子标记1137-CAPSVI的获得

一、试验材料的准备及表型鉴定

1、试验材料

试验材料如下：长薯形材料10618-01、圆薯形材料320-02和以长薯形材料10618-01 为母本，圆薯形材料320-02为父本杂交获得的220个F1薯形分离后代。

2、基因组DNA的提取与质量检测

采集步骤1中试验材料的马铃薯叶片，采用改良的CTAB小量法提取基因组DNA， 并取2μL的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。部分实验材料的电泳检 测结果如图1所示，说明试验材料的基因组DNA的质量合格。

3、薯形表型鉴定

从试验材料中的F1薯形分离后代中选取最大的3个块茎，利用游标卡尺测量每个 块茎的最大纵轴(匍匐茎生长方向)及最大横轴(垂直于匍匐茎生长方向)长度，计 算每个块茎最大纵轴对最大横轴的比值I，3个块茎比值I的平均值作为衡量待测材料 的块茎形状的指标，判断标准为：当I＜1.4时，块茎为圆形；I≥1.4时，块茎为长形。 根据判断标准对其它F1薯形分离后代进行薯形表型鉴定，并构建圆薯形混池(round bulk，RB)和长薯形混池(longbulk，LB)，圆薯形混池由I值在1.2以下的10个F1 薯形分离后代的基因组DNA组成，长薯形混池由I值在1.9以上的10个F1薯形分离 后代的基因组DNA组成。两池的DNA样品均由各试验材料的基因组DNA等量混合 组成。

二、鉴定或辅助鉴定马铃薯薯形的方法

从马铃薯基因组序列网站 (http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)上下载相关序列，选取 特定区域序列，利用在线引物设计网站 (http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)进行引物设计，将引物Tm值设定为 58～62℃之间，扩增片段大小设定为700-1000bp之间。将引物预计扩增序列利用在线 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行开放阅读框分析，并将获得的引 物利用PGSC中的数据进行比对，选取29对只有唯一匹配位点的引物送交上海生工生 物工程有限公司合成。

分别以圆薯形亲本320-02和长薯形亲本10618-01的基因组DNA为模板对合成的 29对引物进行检测，共选择出17对在双亲中都能扩增出单一条带的引物，将17对引 物的PCR扩增产物纯化后连接到T载体上，转化大肠杆菌，并涂布在含有amp、x-gal 和IPTG的LB平板上过夜培养。在圆薯形亲本320-02和长薯形亲本10618-01的LB 平板上各挑取12个白斑克隆，经PCR检测后，各选取6个阳性克隆测序。上述PCR 反应体系：8μLddH₂O，1.5μL缓冲液(10×PCR)，0.3μLdNTPs(10mmolL^–1)，1.5μL 引物F(2μmolL^–1)，1.5μL引物R(2μmolL^–1)、0.2μLTaq酶(2.5UμL^–1)，2μLDNA (20ngμL^–1)。上述PCR扩增条件：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃50s，35 个循环，72℃10min。

将测序结果利用DNAStar中的SeqMan程序进行比对分析，结果发现引物 1137-F45R45的扩增产物在圆薯形亲本320-02和长薯形亲本10618-01之间存在3个 SNP位点，分别为序列表中序列3所示的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸、第896 位脱氧核糖核苷酸和第1146位脱氧核糖核苷酸。圆薯形亲本320-02的基因组DNA中 的目标基因序列如序列表中序列3所示，长薯形亲本10618-01的基因组DNA中的目 标基因序列如序列表中序列4所示。其中，圆薯形亲本320-02的基因组DNA中的目 标基因的第805位脱氧核糖核苷酸为C，且第896位脱氧核糖核苷酸为T，且第1146 位脱氧核糖核苷酸为A；长薯形亲本10618-01的基因组DNA中的目标基因第805位 脱氧核糖核苷酸为T，且第896位脱氧核糖核苷酸为G，且第1146位脱氧核糖核苷酸 为T。

分别以圆薯形混池的基因组DNA和长薯形混池的基因组DNA为模板，采用引物 1137-F45R45进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并对PCR扩增产物进行测序。测 序结果表明：圆薯形混池的基因组DNA中的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸为C、 第896位脱氧核糖核苷酸为T和第1146位脱氧核糖核苷酸为A，与圆薯形亲本320-02 的基因组DNA的PCR扩增产物的测序结果一致；长薯形混池的基因组DNA中的目 标基因第805位脱氧核糖核苷酸为T、第896位脱氧核糖核苷酸为G和第1146位脱氧 核糖核苷酸为T。

因此根据这3个SNP位点可以确定马铃薯薯形：检测待测马铃薯的同源染色体上 的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸是否为C、第896位脱氧核糖核苷酸是否为T 和第1146位脱氧核糖核苷酸是否为A：

1)若待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第805位脱氧核糖核苷酸 为C，且所述待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第896位脱氧核糖核 苷酸为T，且所述待测马铃薯的至少一条同源染色体上的目标基因的第1146位脱氧核 糖核苷酸为A，则待测马铃薯为或候选为圆薯形马铃薯；

2)若待测马铃薯的同源染色体上的目标基因不满足上述条件，则待测马铃薯为或 候选为长薯形马铃薯；

上述目标基因的序列如序列表中序列3所示。

三、分子标记1137-CAPSVI的获得

1、分子标记1137-CAPSVI的获得

通过在线软件dCAPSFinder2.0发现上述步骤二中的3个SNP位点中有2个含有 酶切位点，分别是HpaII酶切位点(识别序列为“CCGG”)和AflII酶切位点(识别位 点为“CTTAAG”)。

用AflII内切酶分别对上述步骤二中的圆薯形亲本320-02的基因组DNA、长薯形 亲本10618-01的基因组DNA、圆薯形混池的基因组DNA、长薯形混池的基因组DNA 的PCR扩增产物进行酶切，得到酶切产物，对酶切产物进行凝胶电泳检测(1.6％琼脂 糖凝胶电泳检测)。上述酶切反应体系：PCR产物8μL，10×NEBuffer1.5μL，BSA0.15 μL，ddH₂O5.3μL，AflII内切酶0.05μL。上述酶切反应条件：37℃反应3h。

结果如图2所示：圆薯形亲本320-02及圆薯形混池的酶切产物含有大小为700bp 和200bp的两条带，而长薯形亲本10618-01及长薯形混池的酶切产物仅有大小为900 bp的单一条带。

由此可见，引物1137-F45R45可以对马铃薯薯形进行鉴定，并将该引物命名为 1137-CAPSVI。1137-CAPSVI分子标记的序列如下：

F：5’-GTGTCTCCTGTGAGAGATTTG-3’(序列1)；

R：5’-TATAGATTGGAATGCGAGAACC-3’(序列2)。

2、分子标记1137-CAPSVI鉴定马铃薯薯形的方法

分子标记1137-CAPSVI对马铃薯薯形进行鉴定的方法具体如下：

(1)用分子标记1137-CAPSVI对待测马铃薯进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物；

(2)用AflII内切酶对步骤(1)获得的PCR扩增产物进行酶切，得到酶切产物，

(3)检测酶切产物的大小；

若酶切产物含有大小为700bp和200bp的片段；则待测马铃薯为或候选为圆薯形 马铃薯；

若酶切产物仅含有大小为900bp的片段；则待测马铃薯为或候选为长薯形马铃薯。

实施例2、分子标记1137-CAPSVI在二倍体马铃薯和四倍体马铃薯薯形筛选中的 应用

一、分子标记1137-CAPSVI在二倍体马铃薯薯形筛选中的应用

1、实验材料及薯形的表型鉴定

试验材料为213份二倍体马铃薯，来源于以长薯形材料10618-01为母本，圆薯形 材料320-02为父本的F1薯形分离后代。213份二倍体马铃薯薯形的表型鉴定均按照 实施例1的步骤一中的3的判断标准判定，213份二倍体马铃薯材料中有133个圆薯 形材料和80个长薯形材料。

2、鉴定方法及鉴定结果

分别以213份二倍体马铃薯的基因组DNA为模板，采用分子标记1137-CAPSVI 为引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，并利用AflII内切酶对PCR扩增产 物进行酶切，得到酶切产物，检测酶切产物。

若圆薯形材料的酶切产物含有700bp和200bp的两条带，则圆薯形材料为圆形马 铃薯(标记阳性)，否则为标记阴性；

若长薯形材料的酶切产物仅含有900bp的一条带，则长薯形材料为长薯形马铃薯 (标记阳性)，否则为标记阴性。

结果如表1所示：在133个圆薯形材料中，标记阳性的有132个，分子标记检测 与表型鉴定结果吻合度达99.25％；在80个长薯形材料中，标记阳性的有71个，分子 标记检测与表型鉴定结果吻合度达88.75％。分子标记检测结果与表型鉴定结果吻合度 达95.31％，将表型鉴定结果与分子标记检测结果做Pearson双侧相关分析，相关系数 r为0.900，达极显著水平。

表1、二倍体马铃薯材料表型鉴定和标记鉴定结果

上述结果表明，分子标记1137-CAPSVI与二倍体马铃薯薯形性状紧密连锁，能较 好的区分二倍体马铃薯薯形，可通过标记辅助选择用于二倍体马铃薯薯形育种，加快 育种进程。

二、分子标记1137-CAPSVI在四倍体马铃薯薯形筛选上的应用

1、实验材料及薯形的表型鉴定

试验材料为53份四倍体马铃薯，来源于不同杂交组合的四倍体高代无性系。53 份来源于不同杂交组合的四倍体高代无性系的材料(材料来源于中国农科院蔬菜花卉 研究所)信息如表2所示。53份四倍体马铃薯薯形的表型鉴定均按照实施例1的步骤 一中的3的判断标准判定。鉴定结果表明：在53份四倍体马铃薯材料中，I值小于1.4 的圆薯形材料35份，占总材料数的66.04％；I值大于1.4的长薯形材料18份，占总 材料数的33.96％。总体I值范围在0.8-2.2之间，主要集中在1.1～1.4之间，其中，在 1.2～1.3之间的材料最多，共11个，占总材料数的20.75％(如图3所示)。

表2、四倍体马铃薯材料信息

2、鉴定方法及鉴定结果

分别以53份四倍体材料的基因组DNA为模板，采用分子标记1137-CAPSVI为引 物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，并利用AflII内切酶对PCR扩增产物进 行酶切，得到酶切产物，对酶切产物检测。

若圆薯形材料的酶切产物含有700bp和200bp的两条带，则圆薯形材料为圆形马 铃薯(标记阳性)，否则为标记阴性；若长薯形材料的酶切产物仅含有900bp的一条 带，则长薯形材料为长薯形马铃薯(标记阳性)，否则为标记阴性。

利用分子标记1137-CAPSVI对53份四倍体薯形品系的检测结果如表3所示：在 圆薯形材料的检测中，在35份圆薯形材料中，标记阳性的有32个，分子标记检测与 表型鉴定结果吻合度达91.43％；在18份长薯形材料中，标记阳性的有15个，分子标 记检测与表型鉴定结果吻合度也高达83.3％。53份材料的检测结果与表型鉴定结果吻 合度达83.02％，将表型鉴定结果与分子标记检测结果做Pearson双侧相关分析，相关 系数r为0.611，达极显著水平。

上述结果表明，分子标记1137-CAPSVI与四倍体马铃薯薯形性状紧密连锁，能较 好的区分四倍体马铃薯薯形，可通过标记辅助选择用于四倍体马铃薯薯形育种，加快 育种进程。

表3、表型鉴定和标记鉴定结果