一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物及试剂盒。本发明的RPA引物由SEQ？ID？No.1所示的单链DNA分子和SEQ？ID？No.2所示的单链DNA分子组成。通过试验证明：本发明的RPA引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且基于该引物建立了葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫具有指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物及试剂盒。

背景技术

葡萄卷叶病毒病(Grapevineleafroll-associatedvirus，GLRaV)是仅次于葡萄扇叶病毒病的一种世界性葡萄病毒病，在国内分布也较为普遍，田间感病率较高，对葡萄产量和品质影响很大，且引起该病的病毒是由葡萄卷叶伴随病毒单独或多种葡萄卷叶伴随病毒复合侵染造成。现已报道的葡萄卷叶伴随病毒有11种，分别为GLRaV-1～9、GLRaV-Dr和GLRaV-De，我国已鉴定明确的葡萄卷叶伴随病毒种类共有6种，即GLRaV-1～5和7。GLRaV已被证明属于典型的Clostero病毒，仅在韧皮部和叶片存在，其传播不是靠机械，通常是靠感染的母株或接穗等繁殖材料。GLRaV具有半潜隐性，导致葡萄植株生长衰弱、果实成熟延迟、果粒大小不均、着色不良、含糖量减少和产量下降，对葡萄的生长发育有显著影响。

目前，检测葡萄卷叶病毒的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光PCR法。指示植物检测法比较简单，但其检测速度很慢，而且无法确定侵染病毒的种类，灵敏度也较低。国内外已有很多利用ELISA方法检测葡萄卷叶伴随病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高，灵敏度不及RT-PCR。利用分子生物学技术建立的RT-PCR、免疫捕捉RT-PCR、实时荧光RT-PCR及探针杂交检测等方法，使得葡萄病毒A的检测结果更为快速、灵敏、准确。但传统基于PCR的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。因此许多不依赖PCR仪的等温扩增技术被发明出来，尤其以LAMP应用最为广泛。

RPA(Recombinasepolymeraseamplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮组下使模板DNA解链，引物于模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。

发明内容

本发明的一个目的一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物由SEQIDNo.1所示的单链DNA分子和SEQIDNo.2所示的单链DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂包括上述引物。

上述RPA试剂中，所述引物1和所述引物2在所述RPA试剂中的终浓度均为0.4μmol/L。

本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的试剂盒包括上述引物或上述RPA试剂。

本发明还有一个目的是提供上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用。

本发明还提供了上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测葡萄卷叶伴随病毒3号产品中的应用。

本发明还提供了上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否感染葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用。

本发明还提供了上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品是否感染葡萄卷叶伴随病毒3号产品中的应用。

本发明还提供了上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用。

本发明还提供了上述引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的产品中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的方法包括如下步骤：

(1)用上述引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(2)检测所述RPA扩增产物的大小；

若所述RPA扩增产物含有大小为380bp的片段，则所述待测病毒为或候选为葡萄卷叶伴随病毒3号；

若所述RPA扩增产物不含有大小为380bp的片段，则所述待测病毒不为或候选不为葡萄卷叶伴随病毒3号。

上述方法中，所述RPA扩增的模板为待测病毒的cDNA。

上述方法中，所述RPA扩增的温度为37℃，所述RPA扩增的时间为40min。

上述方法在检测或辅助检测葡萄卷叶伴随病毒3号中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的方法主要具备以下优点：

(1)仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；

(2)只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；

(3)反应时间仅需40min；

(4)结果易于判断，不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带。

本发明针对葡萄卷叶伴随病毒3号的HSP70基因的保守序列，设计特异性RPA扩增引物，并基于该引物建立了葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA检测方法，可对葡萄卷叶伴随病毒3号进行定性检测。通过试验证明：本发明的RPA扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且基于该引物建立了葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫具有指导意义。

附图说明

图1为RPA检测方法的建立。其中，1：葡萄卷叶伴随病毒3号；2：阴性对照。

图2为特异性实验。其中，1：葡萄卷叶伴随病毒3号；2：葡萄卷叶伴随病毒2号；3：沙地葡萄茎痘伴随病毒；4：葡萄斑点病毒；5：葡萄病毒A；6：阴性对照。

图3为RPA灵敏度实验。1-6：模板cDNA的稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5。

图4为PCR灵敏度实验。1-6：模板cDNA的稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits是TwistDX公司的产品，产品目录号为TABAS03KIT。

下述实施例中的葡萄卷叶伴随病毒3号(Grapevineleafroll-associatedvirus3)在文献“王仲,刘命华,李捷,李明骏,程玉琴.3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测[J].中国果树,2012,04:43-46.”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。

下述实施例中的葡萄卷叶伴随病毒2号(Grapevineleafroll-associatedvirus2)在文献“赵静静,乾义柯,颉超,郭庆元,胡白石,陆平.引起葡萄黄化类症状的病毒和类病毒RT-PCR检测[J].新疆农业科学,2015,06:1099-1104”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。

下述实施例中的沙地葡萄茎痘伴随病毒(Grapevinerupestrisstempittingassociatedvirus)、葡萄斑点病毒(Grapevinefleckvirus)及葡萄病毒A(GrapevinevirusA)均在文献“梁巧玲,乾义柯,张娜,陆平,刘绪斌.新疆三种葡萄病毒RT-PCR检测及序列分析[J].植物保护学报,2015,03:376-381.”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。

实施例1、用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物及其RPA试剂盒

一、RPA引物的设计

针对葡萄卷叶伴随病毒3号的HSP70基因的保守序列，设计检测葡萄卷叶病毒3的RPA引物，产物大小为380bp。具体序列如下：

上游引物GLRaV3-F：5′-ATTGAGGAACAATTTGGGGGACATCCGGCAATACT-3′(序列1)；

下游引物GLRaV3-R：5′-GAACCGACGTATCAATATCTAACGGCTGCCGACTA-3′(序列2)。

二、用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂盒及其使用方法

1、用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂盒

用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂盒包括上述步骤一设计的上游引物GLRaV3-F和下游引物GLRaV3-R、含冻干酶粉管、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)、醋酸镁溶液(280mmol/L)。上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)均来源于RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits。

2、用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂盒的使用方法

(1)RPA扩增

以待测样品的cDNA为模板，采用GLRaV3-F和GLRaV3-R引物进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。同时设置空白对照(DNA模板为超纯水)。

RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL、去离子水12.5μL、上、下游引物各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，模板DNA1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。

RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。

(2)RPA扩增产物的电泳检测

RPA反应结束后，向上述RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。并对RPA扩增产物进行测序。

若RPA扩增产物含有大小为380bp的片段，则待测病毒为或候选为葡萄卷叶伴随病毒3号；

若RPA扩增产物不含有大小为380bp的片段，则待测病毒不为或候选不为葡萄卷叶伴随病毒3号。

三、用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA试剂盒的应用

1、RNA的提取及cDNA的合成

参照试剂盒操作(植物总RNA提取试剂盒，货号为DP432，天根生物科技有限公司)提取感染了葡萄卷叶伴随病毒3号的葡萄叶片的RNA。并参照试剂盒(PrimeScriptRT-PCRKit，货号为RR014A，TaKaRa)的操作，以获得的RNA为模板，反转录获得cDNA。将获得的cDNA保存于-20℃备用。

2、RPA扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用GLRaV3-F和GLRaV3-R引物进行RPA扩增。同时设置空白对照(DNA模板为超纯水)。

RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL，去离子水12.5μL，上、下游引物各2μL，模板DNA1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。

将RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。

3、RPA扩增产物的电泳检测

RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取上清液5μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。并对RPA扩增产物进行测序

结果如图1所示：葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA扩增产物含有1个条带，大小为380bp，而阴性对照无条带。说明本发明的用于检测葡萄卷叶伴随病毒3号的RPA引物及RPA试剂盒可以有效检测葡萄卷叶伴随病毒3号。

实施例2、RPA引物的特异性检测

1、RNA的提取及cDNA的合成

参照实施例1的步骤三中的RNA的提取及cDNA的合成方法，分别从感染了葡萄卷叶伴随病毒3号的葡萄叶片、感染了葡萄卷叶伴随病毒2号的葡萄叶片、感染了沙地葡萄茎痘伴随病毒的葡萄叶片、感染了葡萄斑点病毒的葡萄叶片和感染了葡萄病毒A的葡萄叶片中制备得到葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA、葡萄卷叶伴随病毒2号的cDNA、沙地葡萄茎痘伴随病毒的cDNA、葡萄斑点病毒的cDNA和葡萄病毒A的cDNA。

2、RPA扩增

分别以步骤1获得的葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA、葡萄卷叶伴随病毒2号的cDNA、沙地葡萄茎痘伴随病毒的cDNA、葡萄斑点病毒的cDNA和葡萄病毒A的cDNA为模板，采用GLRaV3-F和GLRaV3-R进行RPA扩增，分别得到葡萄卷叶伴随病毒3号、葡萄卷叶伴随病毒2号、沙地葡萄茎痘伴随病毒、葡萄斑点病毒和葡萄病毒A的RPA扩增产物。同时设置空白对照(DNA模板为超纯水)。

RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL，去离子水12.5μL，上、下游引物各2μL，模板DNA1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。

将RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。

3、RPA扩增产物的电泳检测

RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

结果如图2所示：从图中可以看出：只有葡萄卷叶伴随病毒3号的扩增产物含有1个大小为380bp的条带，葡萄卷叶伴随病毒2号、沙地葡萄茎痘伴随病毒、葡萄斑点病毒和葡萄病毒A均无条带。说明本发明的RPA引物特异性高。

实施例3、RPA引物的灵敏度检测及与普通PCR灵敏度的对比

1、RNA的提取及cDNA的合成

参照实施例1的步骤三中的RNA的提取及cDNA的合成方法，分别从感染了葡萄卷叶伴随病毒3号的葡萄叶片样品中制备得到葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA，并将葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA进行梯度稀释，分别得到稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA。

2、RPA扩增

分别以上述步骤1得到的稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA为模板，采用GLRaV3-F和GLRaV3-R进行RPA扩增。

RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL，去离子水12.5μL，上、下游引物各2μL，模板DNA1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。将RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。

3、PCR扩增

分别以上述步骤1得到的稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的葡萄卷叶伴随病毒3号的cDNA为模板，采用引物P3U和P3D进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

引物序列如下：

P3U：5′-CGCTCATGGTGAAAGCAGACG-3′；

P3D：5′-CTTAGAACAAAAATATGGAGCAG-3′。

PCR扩增的体系和反应条件参考文献“GeneticvariabilityandpopulationstructureofGrapevineleafroll-associatedvirus3isolates”中的方法。

4、电泳检测

1)RPA反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。RPA电泳结果如图3所示。

2)PCR反应结束后，取5μL的PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。PCR电泳结果如图4所示。

从图3和图4中可以看出，本发明的RPA方法与普通PCR的灵敏度相当，均为10^-3稀释度。