一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产L-鸟氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产L-鸟氨酸的方法，属于生物工程和生物技术领域。本发明将来源于Bacillus？cereus的精氨酸酶成功在Bacillus？subtilis？168中表达。酶活测定结果表明，重组工程菌的精氨酸酶酶活比原始菌提高了近27倍。以此工程菌作为生物催化剂，以L-精氨酸作为底物，进行转化法生产L-鸟氨酸，采用分批补加底物L-精氨酸的方法在5-L发酵中进行转化法生产L-鸟氨酸。12h后可以得到378.9g/L的L-鸟氨酸，底物L-精氨酸的摩尔转化率达到99.9％。本发明方法生产L-鸟氨酸具有效率高，专一性强，能耗低等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产L-鸟氨酸的方法，属于生物工程 和生物技术领域。

背景技术

L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前体物质。同时 L-鸟氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有重要的保障 作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和脂质的分解代 谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以及激发病态下肝 脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别是对于鸟氨酸循环 障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低患者血氨浓度。鸟氨 酸α-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改善慢性营养不良，改善 免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和饮料的口味，减少苦味。 在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。

鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受二分 子NH₄⁺和一分子CO₂形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被水解成鸟 氨酸和尿素。

工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法以及L-精氨酸水解法。微生物发 酵生产L-鸟氨酸主要是通过诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以较为便宜的 葡萄糖甚至是淀粉等为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世纪五六十年代 就开始鸟氨酸生产的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先报道了利用谷氨酸 棒状杆菌突变株发酵生产鸟氨酸。此后，OkumuraheShibuya等人在这方面也做了大量的工作， 将具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌，以及具有精氨酸和鸟氨酸以及 霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国内陈宁、刘树庆等人在1999年 开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过硫酸二乙酯和紫外线诱变定向 选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产量达到9.85g/L。近几年，随着代谢 工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发酵生产取得一定的进展，其中，中 山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达异源的谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3- 磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨酸产量得到提高，最终到14.8g/L， 而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟氨酸的产量为24.1g/L。通过发酵法进 行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等，成本非常低廉，适合于工业的发展，但 发酵周期一般都相对较长，而且发酵的产量较低对于后期分离需要较高的技术需求。

L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸包括，碱水解法和酶水解法，特别是酶水解，由于其反应 效率高，产物转专一性高而受到越来越多的重视。近几年，国内有人开始尝试以精氨酸为底 物进行酶转化法生产L-鸟氨酸。北京化工大学徐焘，通过筛选得到一株精氨酸酶活力较高的 苏云金芽孢杆菌，以此细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物进行L-鸟氨酸生产，并最终 得到43.57g/LL-鸟氨酸。而后张涛等人提取苏云金芽孢杆菌的精氨酸酶，以精氨酸为底物， 精氨酸酶纯酶作催化剂，并最终得到72.1g/L的鸟氨酸。宋伟等人构建表达外源精氨酸酶的 E.coliBL21，并以重组细胞为催化剂，L-精氨酸为底物，最终得到112.3g/L的L-鸟氨酸。然 而，无论以产精氨酸酶的菌株作为催化剂，还是以纯化的精氨酸酶为催化剂转化L-精氨酸生 产L-鸟氨酸，都还存在效率比较低，产量低的问题。特别是用纯化的精氨酸酶进行转化生产 L-鸟氨酸，需要消耗较大的成本在精氨酸酶的分离纯化上，不利于工业化的应用。

本发明通过表达载体pMA5，实现了将来源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因argI成功在 安全性生产菌株B.subtilis168中高效表达。以此次获得的具有精氨酸活性的重组菌全细胞为 生物催化剂，以L-精氨酸为底物，进行转化法生产L-鸟氨酸。并通过对L-精氨酸转化体系的 建立和条件优化。最终确定了最佳的L-精氨酸转化条件，实现了L-鸟氨酸的高效生产。

发明内容

本发明首先提供了一株产精氨酸酶的重组枯草芽孢杆菌，是将精氨酸酶基因argI，以 pMA5为表达载体，以Bacillussubtilis168为宿主，构建了基因工程菌株B.subtilis 168/pMA5-argI。

在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸酶基因来源于Bacilluscereus，序列如SEQID NO.1所示。

本发明还提供了应用所述重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA5-argI全细胞转化L-精氨 酸生产L-鸟氨酸的方法，是以重组菌全细胞作为生物催化剂，构建了转化法生产L-鸟氨酸的 转化体系；所述转化体系采用pH为9.0的0.25-0.3M碳酸盐缓冲液，含有0-0.5mM的Mn²⁺、 100-200g/L的L-精氨酸，转化温度为35-40℃，并适时补加底物L-精氨酸，使得底物浓度维 持在120-200g/L之间。

在本发明的一种实施方式中，转化体系中，全细胞用量为3-5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述转化体系采用pH为9.0的0.25M碳酸盐缓冲液，含 有0.5mM的Mn²⁺、200g/L的L-精氨酸，转化温度为40℃，并适时补加底物L-精氨酸，使 得底物浓度维持在120-200g/L之间。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明首次在B.subtilis168中克隆表达了来源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因 argI，相比出发菌株，精氨酸酶酶活提高了26.7倍。

(2)本发明通过穿梭载体pMA5，在HpaII启动子控制下，精氨酸酶直接高效表达，不 需要通过IPTG等价格昂贵的诱导剂下进行诱导表达。

(3)本发明应用重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/pMA5-argI全细胞转化L-精氨酸生产 L-鸟氨酸，在4h内获得了148.7g/L的L-鸟氨酸，精氨酸的摩尔转化率达到100％；通过补 加底物L-精氨酸，在12h内L-鸟氨酸的产量高达378.9g/L，底物摩尔转化率达到99.9％。

具体实施方式

重组菌株酶活力测定

酶活测定方法：配制0.2M底物L-精氨酸(pH9.0，0.2M碳酸盐缓冲液)，取0.9ml底物 溶液，加入0.1ml酶液，40℃反应10min。将酶反应液稀释相应的倍数，取1ml稀释后的反 应液，用Chinard比色法测定反应液中L-鸟氨酸的含量。酶活定义单位为1min催化1umolL- 精氨酸转化成L-鸟氨酸所需的酶量。

Chinard比色法：1ml标准液中依次加入1ml的冰醋酸，1ml混合酸(茚三酮溶液)，于沸 水浴中反应1h，测定515nm下的吸光度值。

实施例1精氨酸酶引物设计

根据NCBI中Bacilluscereus全基因组核酸序列中argI基因序列，设计精氨酸酶基因的 PCR引物P1和P2。

P1：5’-ATCCATATGATGAAAAAAGAAATCTCAG-3’(NdeI)

P2：5’-ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCG-3’(BamHI)

实施例2精氨酸酶基因的克隆

以Bacilluscereus总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃ 预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，45s，35个 循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTPMix4μL， 10×ExTaqBuffer5μL，灭菌的双蒸水37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂 盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心 管中，-20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-TVector连接，连接产物转化E.coilJM109， 转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10mL液体LB培养 基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-argI，经酶切验证连接成功后，加 入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。

实施例3重组质粒pMA5-argI的构建

提取保存于E.coliJM109中的质粒pMD18-T-argI和pMA5，并分别用BamHI和NdeI 进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pMA5 酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连 接好的重组质粒pMA5-argI转化到感受态E.coilJM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌 落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMA5-argI，酶切验证正确后，加入甘油至终浓 度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。

实施例4重组质粒pMA5-argI转化B.subtilis168

挑取B.subtilis168接种于一支5mLLB液体培养基试管，37℃摇床培养过夜，取100μL 过夜培养的菌液，接种至用5mLSPIMedium中，37℃摇床培养，5h后开始测OD₆₀₀，当培 养物生长到对数末期时，快速取200μL接种到2mLSPIIMedium中，37℃100r/min摇床培 养1.5h。加20μL100×EGTA溶液，于37℃100r/min摇床培养10min，用1.5mL离心管 分装成500μL每管，向管中加入适量的质粒pMA5-argI，轻轻混匀于37℃100r/min摇床培 养30min。将离心管转移到250r/min摇床，37℃养1.5h，4000r/min离心收集菌体，弃部分 上清液，留100μL重悬菌体，涂布于卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，挑取阳性菌落，提 取质粒酶切验证，得到重组菌B.subtilis168/pMA5-argI。

实施例5重组菌B.subtilis168/pMA5-argI精氨酸酶活力测定

将实施例4构建的重组菌B.subtilis168/pMA5-argI，与出发菌株B.subtilis168分别接种 于10mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50mL LB培养基中，37℃培养12h，取发酵液于4℃，10000r/min离心10min，收集的细胞用pH7.0 的Tris-HCl缓冲液清洗3次，最后用5mLpH7.0Tris-HCl缓冲液悬浮细胞。超声波破碎处 理制备粗酶液。

配制0.2M底物L-精氨酸(pH9.0，0.2M碳酸盐缓冲液)，取0.9ml底物溶液，加入0.1ml 酶液，40℃反应10min。将酶反应液稀释相应的倍数，取1ml稀释后的反应液，用Chinard 比色法测定反应液中L-鸟氨酸的含量。酶活定义单位为1min催化1umolL-精氨酸转化成L- 鸟氨酸所需的酶量。

Chinard比色法：1ml标准液中依次加入1ml的冰醋酸，1ml混合酸(茚三酮溶液)，于沸 水浴中反应1h，测定515nm下的吸光度值。

结果表明重组菌B.subtilis168/pMA5-argI表达的精氨酸酶比酶活为21.9U/mg，比出发菌株 B.subtilis168精氨酸酶酶活提高了26.7倍。

实施例6全细胞转化法生产L-鸟氨酸最佳转化体系的构建

重组菌B.subtilis168/pMA5-argI接种于50mlLB培养基中培养12h(OD₆₀₀≈3.5)，离心 获得重组菌细胞，取0.2g重组菌细胞重悬于50ml缓冲液中，以100g/L的L-精氨酸为底物， 转化生产L-鸟氨酸。

关于转化温度：分别在20-60℃下进行转化产L-鸟氨酸，测定在不同转化温度下转化液 中L-鸟氨酸的含量。结果表明，温度在低于40℃时，转化速率随着温度的升高而升高，高于 40℃时转化速率急剧下降。

关于缓冲液：分别考察磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼砂缓冲液、Tris-HCl缓冲液、 柠檬酸盐缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液对转化速率的影响，同时确定最佳的缓冲液浓 度。结果如表1所示，碳酸盐缓冲液由于其在碱性条件下的pH缓冲能力较强，与其他几种 缓冲液相比，应用碳酸盐缓冲液进行转化产L-鸟氨酸的转化速率最快。

关于转化体系中的金属离子：在转化液中添加0.1-5mM的Mn²⁺，考察对转化率的影响， 结果表明转化体系中Mn²⁺的浓度在0-0.5mM时，转化率随着Mn²⁺浓度的升高而升高，继续 升高Mn²⁺的浓度并不会促进转化率的升高，反而由于Mn²⁺在碱性条件(pH9.0)下产生 Mn(OH)₂，不利于转化的进行。

表1：不同缓冲液L-鸟氨酸产率的影响

缓冲液组成 L-鸟氨酸产率(g/(L·h)) Na₂HPO₄-NaH₂PO₄47.7±1.01 Na₂HPO₄-柠檬酸 37.9±0.57 柠檬酸钠-柠檬酸 34.8±0.65 Tris-HCl 45.8±0.72 NaHCO₃-Na₂CO₃51.1±0.92 硼酸钠-硼酸 46.1±0.77

实施例7分批补加底物转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸

重组菌B.subtilis168/pMA5-argI接种于2L发酵培养基中培养16h(OD₆₀₀≈14.6-15.2)， 离心获得细胞，pH7.0Tris-HCl洗涤两次后，重悬于2L底物缓冲液(0.25M碳酸盐缓冲液， 200g/LL-精氨酸，0.5mMMn²⁺，pH9.0)，40℃下进行转化。转化过程中补加底物L-精氨酸， 使得底物浓度维持在120-200g/L之间。

结果表明，在12h内，共补加500g/L的底物L-精氨酸，L-鸟氨酸的产量为378.9g/L， 底物L-精氨酸的摩尔转化率达到99.9％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。