一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法

摘要

本发明公开了一种一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法。快速准确的基因分型有助于HEV感染毒株的分子流行特征调查和污染源溯源，从而对污染源进行跟踪与监控。本发明采用的步骤如下：1)设计一对外侧引物和一对内侧引物，外侧引物Tm的值低于内侧引物的Tm值；所述的两对引物在套式PCR反应中对样本中的不同基因型HEV毒株均能扩增；同时，不同种基因型的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，以获得不同的高分辨率溶解曲线峰型，满足HRM对于HEV基因型的鉴定分析；2)HRM一步法分型鉴定。本发明大大提高了监测效率，降低了使用成本。

说明书

技术领域

本发明涉及戊型肝炎病毒基因型的鉴定，具体地说是一种一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法。

背景技术

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)引起的一种危害严重的急性传染性疾病，其临床表现与甲型肝炎类似，但病死率更高，患病孕妇的病死率更可高达21％。HEV主要通过粪-口传播，经常引起水源性暴发和食源性暴发。自1955年印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与拉丁美洲的众多发展中国家广泛流行。近年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，新疆、辽宁、山东等省均有大量流行。1986～1988年我国新疆地区曾爆发水型戊型肝炎疫情，近12万人发病，死亡707例，极大地危害了人类健康。由于HEV可能通过直接接触或以水、食物等为媒介在动物和人之间传播，引起戊型肝炎在人群或动物种群中广泛流行，严重危害人群健康，这提示了HEV在公共卫生和食品安全方面存在重要意义。快速准确的基因分型则有助于感染毒株的分子流行特征调查和污染源溯源，从而对污染源进行跟踪与监控。

发明内容

本发明利用戊型肝炎病毒两套扩增引物的Tm值差异，建立基于一步法套式RT-PCR扩增的高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，以实现对戊型肝炎病毒基因型的快速分型。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其步骤如下：

1)HRM引物的设计

对比分析已发表的不同来源1、3、4型HEV全基因序列，针对其ORF3序列设计一对外侧引物和一对内侧引物，外侧引物Tm的值低于内侧引物的Tm值，所述的外侧引物为：GAA+TGA+ATAA+CAT+GT，TGGTCACGCCAAG，所述的内侧引物为：CCGGCGGTGGTTTCTGG，GCGAAGGGGTTGGTTGGATGAATAT；

所述的两对引物在套式PCR反应中对样本中的不同基因型HEV毒株均能扩增；同时，不同种基因型的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，以获得不同的高分辨率溶解曲线峰型，满足HRM对于HEV基因型的鉴定分析；

2)HRM分型鉴定

在每个样品测试管中加入200xRT-Enzymesolution0.1μL，5xRT-PCRReactionMix4.0μL，20μM外侧引物各0.4μL，20μM内侧引物各0.8μL，10×饱和染料LCgreen2μL，去离子水3.5μL，最后加入样本RNA8μL，500r/min离心30s，置于荧光定量PCR仪中进行一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定。

本发明设计HEV保守扩增探针，并结合不同基因型的扩增产物中的固定位点碱基突变，建立具有高分辨率峰型的HRM分型鉴定方法。高分辨率溶解曲线分析技术可对食品中或保存的HEV毒种进行基因型鉴定，具有高特异性和高灵敏度，且无需测序和后期分析即可完成快速检测和基因分型，大大提高了检测效率，降低了使用成本。

进一步，所述PCR的反应条件如下：

第一阶段，反转录55℃/20min；

第二阶段，预变性95℃/30s；

第三阶段，95℃/5s，54℃/15s，72℃/30s15个循环；

第四阶段，95℃/5s，60℃/15s，72℃/20s35个循环；

第五阶段，95℃/1min，44℃/1min；升温至80℃，15次读数/℃；

分析样本的溶解曲线和峰型，确定HEV的基因型。

本发明具有如下的有益效果：基于荧光定量PCR的高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)，不仅有着很高的特异性和灵敏度，而且在达到快速检测目的的同时可进行有效的突变点或基因分型分析，无需测序和后期分析，大大降低了检测筛查用时及成本，实现了真正的闭管操作，有效避免了因操作导致的交叉污染。

附图说明

图1为不同HEV基因型溶解曲线峰型图。

具体实施方式

高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其步骤如下：

1.HRM引物设计

在NCBI的网站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov)选取了30条来自不同地区的戊型肝炎病毒全基因组序列，用MegAlign软件(version5.0；DNASTAR，Madison，WI)的ClustalV算法进行排序，并针对ORF3基因设计HRM扩增引物，序列见表1。为了满足一步法检测的要求，必须满足外侧引物的Tm值低于内侧引物的Tm值。同时，为了验证探针的敏感度和特异性，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对探针进行了验证。结果发现，所设计的引物具有较高的特异性。

表1：HEV高分辨率溶解曲线分型鉴定引物

注：+T，+A，+C，+G为经LNA修饰的碱基。

2.HRM一步法分型鉴定

在每个样品测试管中加入200×RT-Enzymesolution0.1μL，5×RT-PCRReactionMix4.0μL，20μM外侧引物各0.4μL，20μM内侧引物各0.8μL，10×饱和染料LCgreen2μL，去离子水3.5μL，最后加入样本RNA8μL，500r/min离心30s，置于荧光定量PCR仪中进行一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定，反应条件如下：

第一阶段，反转录55℃/20min；

第二阶段，预变性95℃/30s；

第三阶段，95℃/5s，54℃/15s，72℃/30s15个循环；

第四阶段，95℃/5s，60℃/15s，72℃/20s35个循环；

第五阶段，95℃/1min，44℃/1min；升温至95℃，15次读数/℃；

分析样本的溶解曲线和峰型，确定基因型。

HRM敏感度验证

以l0倍系列稀释的不同基因型HEV阳性标准RNA(10¹-10⁶拷贝)为模板进行HRM扩增并分析其标准峰型。结果表明该方法对三种不同基因型模板的检测下限均可达10¹～10²拷贝，具有很高的灵敏度，如图1所示；且其标准峰型区分明显，表明此方法具有很广的线性范围，适用于不同条件、多种样品的鉴定。

HRM特异性验证

利用本发明对其它如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪流行性腹泻病毒等常见传染性病原进行检测，结果均为阴性，表明该方法针对HEV检测具有良好的特异性。

样品中HEV的HRM分型鉴定

同时采用高分辨率溶解曲线法和传统RT-PCR-测序法，对260个来自浙江省及其周边地区的样品和毒种进行鉴定。经过样品处理、RNA提取等步骤后，用高分辨率溶解曲线法参照前述的方法进行鉴定，同时使用传统RT-PCR-测序法法进行鉴定比对。

结果显示，用高分辨率溶解曲线法和传统RT-PCR-测序法检测到的HEV阳性样品及其基因型判定均能一一对应。表明高分辨率溶解曲线法能有效的用于不同来源戊型肝炎病毒的鉴定。

序列表

<110>浙江省检验检疫科学技术研究院

<120>一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)…(15)

<223>

<400>1

GAATGAATAACATGT15

210>2

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)…(13)

<223>

<400>2

TGGTCACGCCAAG13

210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)…(17)

<223>

<400>3

CCGGCGGTGGTTTCTGG17

210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<222>(1)…(25)

<223>

<400>4

GCGAAGGGGTTGGTTGGATGAATAT25。